来源：In silico exploration of the genomic repertoire of Iranian aquatic bacteria: Prophage carriage, bioactive compound potential, CRISPR-Cas immunity, and integrated defensive-metabolic islands（Biochemistry and Biophysics Reports）| 编译：DNA Lab Space
导读
伊朗独特且尚未充分探索的水生生态系统蕴藏着丰富的微生物多样性。本研究首次对38株源自高盐湖泊和湿地的伊朗本土细菌菌株进行全面的基因组调查，整合了次级代谢组、细菌素潜力、内源前噬菌体及基因组架构的计算机分析。研究发现这些细菌拥有强大的次级代谢产物合成能力，鉴定出数十个生物合成基因簇（BGCs），其中四氢嘧啶（ectoine）生物合成无处不在。同时，研究还表征了八个高质量前噬菌体，并发现了将BGCs与防御系统物理连接的"多功能基因组岛"，据此提出"堡垒假说"（Fortress Hypothesis）以解释这种适应性基因组架构。
研究背景
海洋生命自35亿年前起源以来，已进化出适应恶劣环境的复杂生存机制。陆生生物的生物活性化合物已广为人知，而多样化海洋生命的独特适应性有望产生多种独特的生物活性分子。微生物次级代谢产物虽非生存必需，却通过提供抗生素作用等选择性优势，在生态互动中发挥关键作用——增强微生物在环境中竞争和生存的能力。世界卫生组织（WHO）将抗生素耐药性视为重大全球健康威胁，因其削弱了常见传染病的治疗效果。
细菌素作为细菌产生的抗菌肽，因其核糖体合成特性及窄谱或广谱的靶向能力，被视为传统抗生素的潜在替代品。噬菌体（感染细菌的病毒）则在塑造微生物进化、生态和动态方面发挥关键作用，广泛存在于包括水、极端条件生态系统和土壤在内的多种环境生态位中。在此背景下，探索极端环境中微生物的次级代谢潜力与防御机制，对新型抗生素发现和合成生物学应用具有重要意义。
研究方法
2.1 基因组数据集
从伊朗生物资源中心（IBRC）官方网站获取本土细菌菌株的完整列表。2025年7月5日，从美国国家生物技术信息中心（NCBI）基因库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载了归属于23个菌株的共38个基因组。所研究细菌的特征汇总于表1。
【数据】基因组数量：38个；菌株数：23株；数据来源：NCBI基因库；下载日期：2025年7月5日
2.2 推定次级代谢产物和细菌素基因簇的鉴定
为对次级代谢产物进行全面分析，使用两种专业工具筛选细菌基因组的生物合成基因簇（BGCs）。首先，采用antiSMASH v8.0.4工具以严格模式（strict mode）系统鉴定广泛的次级代谢产物基因簇[30]。随后，使用BAGEL4 v1.2网络服务器以其默认参数[31]对特定类别的代谢产物（细菌素）进行更有针对性的搜索。
【数据】工具：antiSMASH v8.0.4（严格模式）；BAGEL4 v1.2（默认参数）
2.3 前噬菌体鉴定
使用PHASTEST（具有增强序列翻译的噬菌体搜索工具）v1.0.1[32]和基于机器学习的工具VirSorter2 v2.2.4进行细菌基因组中的前噬菌体检测，选择最小序列长度为500，最低评分为0.4[33]。PHASTEST工具通过评估必需前噬菌体结构和功能模块（包括头部、衣壳、尾部、整合酶和裂解相关基因）的存在和组织，将预测的前噬菌体分为三个不同的完整性类别（不完整（评分<70）、可疑（70≤评分≤90）和完整（评分>90））。随后，使用CheckV v1.5以默认参数对PHASTEST工具获得的完整前噬菌体序列和VirSorter2鉴定的所有前噬菌体进行彻底评估，以识别前噬菌体序列中的宿主污染并评估其完整性和质量[34]。仅选择高质量前噬菌体（定义为完整性超过90%且污染低于5%）进行进一步分析。
【数据】工具：PHASTEST v1.0.1、VirSorter2 v2.2.4、CheckV v1.5；最小序列长度：500；最低评分：0.4；完整性阈值：>90%；污染阈值：<5%
2.4 蛋白质注释、生活方式预测和分类学分类
使用PhaBOX v2.0网络服务（https://phage.ee.cityu.edu.hk/phabox）评估已鉴定前噬菌体的生活方式预测和分类学分类[35]。该网络平台分别使用PhaTYP[36]和PhaGCN[37]实现上述目的。同时，使用PhageScope网络工具（https://phagescope.deepomics.org/）v1.3对预测的前噬菌体进行注释[38]。所有工具均基于其默认参数使用。
【数据】工具：PhaBOX v2.0、PhaTYP、PhaGCN、PhageScope v1.3；参数：默认参数
2.5 平均核苷酸同一性（ANI）、系统发育和比较基因组分析
使用Galaxy Europe网络平台（https://usegalaxy.eu/）v25.0.4.dev0[40]提供的FastANI工具v1.3[39]，通过平均核苷酸同一性（ANI）分析评估高质量前噬菌体和细菌基因组的基因组相似性。ANI结果通过Morpheus（https://software.broadinstitute.org/morpheus）进行可视化。使用ViPTree网络服务器v4.0[41]对选定的前噬菌体进行系统发育分析，生成蛋白质组树并确定其在病毒生命树中的位置。该工具使用基于全基因组相似性的无比对全蛋白质组系统发育方法构建病毒系统发育树。此外，基于BLASTn比对结果，选择与NCBI数据库中公开可用的噬菌体序列具有最高序列相似性的完整前噬菌体，使用ViPTree进行比较基因组分析。对于BLASTn分析中宿主、生活方式和分类学未知的任何噬菌体序列，通过CHERRY[42]和前述工具进行宿主、生活方式和分类学分配。此外，ANI评分非常高的前噬菌体使用相同工具进行了进一步的比较基因组水平分析，以检查其密切的遗传关系。
【数据】工具：FastANI v1.3、Galaxy Europe v25.0.4.dev0、Morpheus、ViPTree v4.0、CHERRY；方法：ANI分析、BLASTn比对、全蛋白质组系统发育
2.6 AMG、CAZyme和RBP鉴定
按照Luo等人描述的方法（略有修改）[43]鉴定前噬菌体中的推定AMGs。简言之，收集所有最初标记为未分类或假设性的噬菌体蛋白，随后使用eggNOG-mapper版本2[44]和InterProScan v107.0[45]重新注释。经注释并预测参与代谢途径的蛋白质随后使用BlastKOALA v3.1[46]进行KEGG注释。CAZymes的预测使用dbCAN3工具v14完成，可访问https://bcb.unl.edu/dbCAN2/。使用PhageRBPdetection工具v4[47]进行预测前噬菌体中RBPs的鉴定。所有被鉴定为RBP的未分类蛋白质（如假设蛋白或未知蛋白）均以严格参数（e-value≤0.0001，同一性≥100%，覆盖率≥100%）对RefSeq、UniProtKB参考蛋白质组和Swiss-Prot数据库进行InterProScan和BLASTp分析。
【数据】工具：eggNOG-mapper v2、InterProScan v107.0、BlastKOALA v3.1、dbCAN3 v14、PhageRBPdetection v4；比对参数：e-value≤0.0001，同一性≥100%，覆盖率≥100%
2.7 CRISPR、防御和抗防御系统分析
使用CRISPR-Cas++网络服务（https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/）v1.1.2中的CRISPRCasFinder[48]和CRISPRCasMeta工具，筛选所有选定的前噬菌体以及38个细菌菌株中CRISPR-Cas系统的存在情况。所有工具均以默认参数运行。随后将鉴定到的间隔序列使用BLAST与预测的前噬菌体进行比对，要求整个间隔序列长度完全匹配、零错配，e值阈值为0.0001或更低[18]。细菌基因组中CRISPR、间隔序列和Cas蛋白类型的频率使用Circos数据可视化工具[49]进行可视化。此外，使用AcrHub预测平台（https://pacrispr.erc.monash.edu/AcrHub/）中所有三种可用工具（包括PaCRISPR、AcRanker和基于HMM的预测器[50]）检查选定前噬菌体中分类为未分类或假设性的蛋白质中潜在的抗CRISPR（ACR）蛋白。同时，使用DefenseFinder工具v2.0.0[51]评估选定的前噬菌体和所有细菌菌株中CRISPR和ACR蛋白之外的其他防御和抗防御机制。
【数据】工具：CRISPRCasFinder、CRISPRCasMeta、CRISPR-Cas++ v1.1.2、Circos、AcrHub、PaCRISPR、AcRanker、HMM预测器、DefenseFinder v2.0.0；比对条件：零错配、e-value≤0.0001
2.8 多功能基因组岛分析
采用基于空间邻近性的方法检测和表征结合代谢、防御和前噬菌体组分的功能性基因组岛。该方法涉及绘制细菌基因组中关键基因组特征（如BGCs、防御系统（包括CRISPR-Cas阵列、防御和抗防御系统）和整合前噬菌体区域）的物理聚集情况。基因组岛根据两个标准定义：第一，所有相关元件必须位于同一重叠群（contig）上；第二，任何两个相邻元件之间的最大间隔距离不得超过50千碱基对（kbp）。该距离阈值基于早期研究采用，表明防御相关遗传元件之间的功能性相互作用通常发生在此基因组范围内[52]。使用三种不同的基因组岛模型进行分类，包括"防御-代谢岛"（包含防御系统和BGCs）、"前噬菌体-防御-代谢岛"（包含前噬菌体、防御系统和BGCs）以及"前噬菌体-代谢岛"（包含前噬菌体和BGCs但缺乏专用防御系统）。仔细记录不同元件基因组坐标重叠的情况。
【数据】基因组岛定义标准：同一contig；相邻元件最大间隔≤50 kbp；三种模型：防御-代谢岛、前噬菌体-防御-代谢岛、前噬菌体-代谢岛
研究结果
3.1 鉴定的次级代谢产物基因盒
#### 3.1.1 单一候选BGCs的鉴定
基因组挖掘鉴定出多种多样的单一生物合成基因盒，每个基因盒专用于生产单一种类的次级代谢产物。最普遍的類型是四氢嘧啶生物合成基因簇，被鉴定到43次，突显了其作为广泛分布的相容性溶质的基本作用（图1）。Betalactone簇被鉴定到18次。萜烯和III型聚酮合酶（T3PKS）簇也很常见，各被检测到17次，而NI-铁载体簇被鉴定到16次。数量较少但值得注意的簇包括氢氰酸（4）、hserlactone（3）、氧化还原辅因子（2）、黑色素（2）和间苯二酚（2）。若干独特的簇被单独观察到，包括arylpolyene、I型聚酮合酶（T1PKS）和膦酸酯。对特定分离株的比较分析显示，在A. persicus分离株6019和分离株Pva5IMA98y的基因组中未鉴定到次级代谢产物。相比之下，L. halophila的基因组包含最多的代谢产物基因簇，共鉴定到九个不同的基因盒。
【数据】四氢嘧啶BGC：43次；Betalactone：18次；萜烯：17次；T3PKS：17次；NI-铁载体：16次；氢氰酸：4次；hserlactone：3次；氧化还原辅因子：2次；黑色素：2次；间苯二酚：2次；arylpolyene：1次；T1PKS：1次；膦酸酯：1次；L. halophila：9个基因簇
#### 3.1.2 杂合候选簇
研究还发现了若干杂合BGCs，其定义为编码多种不同类别次级代谢产物生物合成的基因组位点。一个值得注意的发现是鉴定了六个结合arylpolyene和间苯二酚通路的杂合簇，所有这些都位于M. persicus的基因组内且物理上相邻。此外，还鉴定到两个独立的杂合簇，每个都将非核糖体肽合成酶（NRPS）簇与非核糖体肽衍生的金属载体（NRP-metallophore）簇配对；这两个杂合簇均仅在M. iranensis中发现，并被归类为化学杂合体。其他相邻的杂合簇包括含吡咯烷酮环的翻译后修饰肽（RiPP）与betalactone各一例、T3PKS与四氢嘧啶一例、T3PKS与萜烯一例，以及amglyccycl与萜烯配对的两例。这些杂合簇架构的代表性实例如图2所示。
【数据】arylpolyene-间苯二酚杂合簇：6个（M. persicus）；NRPS-NRP-metallophore杂合簇：2个（M. iranensis）；azole-RiPP+betalactone：1例；T3PKS+四氢嘧啶：1例；T3PKS+萜烯：1例；amglyccycl+萜烯：2例
3.2 鉴定的细菌素
BAGEL4分析鉴定出两大类细菌素。第一类由已鉴定出特定类别细菌素但未明确鉴定出核心生物合成蛋白的BGCs组成。这些推定细菌素以Sactipeptides为主（14个BGCs），其次是LAPs（羊毛硫抗生素样肽，5个BGCs），以及数量较少的Lasso_peptides、Bottromycin、Microcin、Lanthipeptide_class_IV和UviB。此外，在A. halophilus中鉴定到一个包含NRPS和lassopeptide的杂合基因盒（图3）。第二类更明确的类别包括成功鉴定出核心蛋白的细菌素（图4）。其中，检测到LINOCIN_M18（3个BGCs）、Zoocin_A（3个BGCs）、Michiganin-A（2个BGCs）的BGCs，以及Colicin、Closticin_574、Butyrivibriocin_AR10、geobacillin_II和putative_Bacteriocin_family_protein各一例。这一基因组潜力通过antiSMASH工具分析得到证实，该工具鉴定出额外的编码核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPPs）的BGCs。antiSMASH结果特别包括多个lanthipeptide-class-ii（2个BGCs）、lanthipeptide-class-iii（4个BGCs）和lanthipeptide-class-iv（2个BGCs）的BGCs，这些与BAGEL4注释的"LAPs"和"Lanthipeptide_class_IV"类别一致并对其进行了扩展。此外，antiSMASH检测到数个含吡咯烷酮环的RiPPs簇（6个BGCs，其中一个与betalactone杂合）。它还确认了NRPS-lassopeptide杂合体和另一个lassopeptide簇的存在，以及一个ranthipeptide BGC。所有分析的基因组共同编码了总共46个独特的细菌素BGCs。其中，S. halophila是显著的生产者，包含12个BGCs，其中一半（6个BGCs）专门用于细菌素合成。在整合并去重BAGEL4和antiSMASH分析的结果后，46种鉴定的细菌素中的每一种都代表一个独特的、非冗余的遗传决定因子。
【数据】Sactipeptides：14个BGCs；LAPs：5个BGCs；LINOCIN_M18：3个BGCs；Zoocin_A：3个BGCs；Michiganin-A：2个BGCs；Colicin：1例；Closticin_574：1例；Butyrivibriocin_AR10：1例；geobacillin_II：1例；putative_Bacteriocin_family_protein：1例；lanthipeptide-class-ii：2个BGCs；lanthipeptide-class-iii：4个BGCs；lanthipeptide-class-iv：2个BGCs；azole-RiPPs：6个BGCs；细菌素BGC总数：46个；S. halophila：12个BGCs（6个细菌素）
3.3 前噬菌体鉴定
为鉴定推定前噬菌体，共下载了38个细菌基因组。使用PHASTEST工具，从16个菌株中预测到总共37个前噬菌体序列。在37个前噬菌体序列中，分别有15个、10个和12个序列被确定为完整、可疑和不完整。鉴定到的完整前噬菌体平均重叠群长度为34.85 kbp。最短重叠群长度为19.3 kbp，最长者为48.2 kbp。此外，VirSorter2鉴定到85个前噬菌体。VirSorter2鉴定的前噬菌体平均大小为31.75 kbp，最长重叠群为105.28 kbp，最短重叠群为1.40 kbp。在预测的前噬菌体中，有8个独特序列达到质量标准，被选择进行进一步分析。
【数据】PHASTEST预测：37个前噬菌体（16个菌株）；完整：15个；可疑：10个；不完整：12个；完整前噬菌体平均长度：34.85 kbp；最短：19.3 kbp；最长：48.2 kbp；VirSorter2鉴定：85个；平均大小：31.75 kbp；最长：105.28 kbp；最短：1.40 kbp；高质量前噬菌体：8个
3.4 细菌基因组和前噬菌体相似性
38个细菌菌株的成对FastANI比较产生的值在75.89%至99.9984%之间（图5）。在每个物种组内，ANI保持≥78%，其中四个A. persicus菌株间达到99.98%，三个P. halophilus菌株间为99.37%，三个S. proteolyticus菌株间为96.85%，两个S. proteolyticum菌株间为99.97%，两个S. marinum菌株间为99.99%，六个M. persicus菌株间为99.99%。物种间ANI降至78.3%以下，其中O. limi和O. halophilus之间的最低值为78.1%。八个前噬菌体序列进行了类似比较。所有前噬菌体的自身比较均给出100%同一性。唯一例外是Ph_Salpro1与Ph_Salpro4的比较，为99.998%。没有前噬菌体与来自不同宿主物种的前噬菌体共享相似性。
【数据】细菌ANI范围：75.89%-99.9984%；A. persicus菌株间：99.98%；P. halophilus菌株间：99.37%；S. proteolyticus菌株间：96.85%；S. proteolyticum菌株间：99.97%；S. marinum菌株间：99.99%；M. persicus菌株间：99.99%；O. limi vs O. halophilus：78.1%；Ph_Salpro1 vs Ph_Salpro4：99.998%
3.5 前噬菌体特征
基于全面的注释分析，八个选定的噬菌体代表四个分类谱系，包括Caudoviricetes、Arquatrovirinae、Streptomyces phage Chymera和Bielevirus phiO18P（表2）。除Ph_Sapr1被鉴定为烈性噬菌体外，所有前噬菌体均显示溶原性生活方式。在整个数据集中，平均基因组长度为50.4 kbp，范围从Ph_Salpro3的36.9 kbp到Ph_Salpro2的60.6 kbp，而平均GC含量为56.36%，范围从Ph_Alpe的39.8%到Ph_Salpro3的65.6%。Ph_Salpro2同时拥有最大的基因组和最多的基因数量（共75个）。Ph_Ocea携带最少的复制基因，仅一个，而Ph_Salpro3结合了最短的基因组和观察到的最高GC含量。Ph_Sapr1在集中独树一帜，拥有五个裂解基因。Ph_Alpe因其在宿主互作功能方面的投入而脱颖而出，在整合、调控、包装和复制类别中领先，除复制外各有五个基因（复制为七个基因）。每个噬菌体的整体架构的环状基因组图谱见补充材料2。
【数据】平均基因组长度：50.4 kbp；基因组范围：36.9 kbp（Ph_Salpro3）-60.6 kbp（Ph_Salpro2）；平均GC含量：56.36%；GC范围：39.8%（Ph_Alpe）-65.6%（Ph_Salpro3）；Ph_Salpro2基因总数：75个；Ph_Ocea复制基因：1个；Ph_Sapr1裂解基因：5个
3.6 系统发育分析
通过VipTree工具生成的系统发育分析显示，由Ph_Salpro1、Ph_Salpro2和Ph_Salpro4组成的群体位于多样化Streptomyces噬菌体的分支内（图6）。在另一个聚类中，Ph_Sapr1与主要感染弧菌属物种的Vibrio噬菌体紧密关联。系统发育还显示Ph_Ocea与可感染Aeromonas和Pasteurella的噬菌体归为一组。分析进一步揭示Ph_Sapr2与Shigella噬菌体具有密切的系统发育关系。包含Ph_Alpe的群体与感染类芽孢杆菌属（Paenibacillus）的相关噬菌体相关联出现。
【数据】分类谱系：Caudoviricetes、Arquatrovirinae、Streptomyces phage Chymera、Bielevirus phiO18P；Ph_Salpro1/2/4：Streptomyces噬菌体分支；Ph_Sapr1：Vibrio噬菌体；Ph_Ocea：Aeromonas/Pasteurella噬菌体；Ph_Sapr2：Shigella噬菌体；Ph_Alpe：Paenibacillus噬菌体
3.7 比较基因组分析
使用ViPTree进行的比较基因组分析为进化关系提供了进一步见解。Ph_Agbu与其最近的亲属（MAG MSP0043）的比对显示了共线性区域和重排区域（图7A）。Ph_Haka2和Ph_Haka3的近乎相同基因组证明了高度共线性（图7B）。Ph_Salpro1和Ph_Salpro4的基因组比对揭示了簇内广泛的共线性（图7C）。
【数据】Ph_Agbu vs MAG MSP0043：存在共线性和重排区域；Ph_Haka2 vs Ph_Haka3：近乎相同基因组、高度共线性；Ph_Salpro1 vs Ph_Salpro4：广泛共线性
3.8 CRISPR-Cas系统、防御和抗防御系统分析
（此部分原文节选未完整提供，以下基于可获得的原文内容编译）
CRISPR-Cas系统的筛选揭示了细菌分离株中Cas类型的分布模式（图8）。大多数菌株中检测到CRISPR-Cas位点，以I型为主。间隔序列与前噬菌体之间的比对分析以及ACR蛋白的预测结果如原文所述进行了系统分析。
【数据】Cas类型分布：以I型为主（详细数值原文未详述）
3.9 多功能基因组岛分析
在L. halophila和O. limi中鉴定到完全整合的防御-代谢基因组岛的代表性实例（图9）。在L. halophila中，一个hserlactone BGC与Mokosh_TypeII防御系统精确整合（图9A）。L. halophila中一个独立的萜烯BGC完全嵌入RM_Type_IIG防御系统内，共享相同的基因组位点（图9B）。L. halophila中第二个hserlactone岛显示与Old_exonuclease防御系统融合（图9C）。在O. limi中，一个T3PKS BGC完全嵌入防御系统gcu233（图9D）。
【数据】L. halophila：hserlactone BGC + Mokosh_TypeII；萜烯BGC + RM_Type_IIG；hserlactone岛 + Old_exonuclease；O. limi：T3PKS BGC + gcu233
讨论与解读
本研究对伊朗本土水生细菌的基因组调查揭示，这些分离株装备了精细的遗传武器库，包括丰富的次级代谢产物和细菌素、一系列宿主特异性前噬菌体以及强大的细菌防御系统。这一遗传组合凸显了在极端环境中生存的多方面进化策略。最引人注目的是四氢嘧啶生物合成的普遍性——四氢嘧啶操纵子在基因组中出现41次，凸显了其在高盐环境生存中的关键作用。其他常见BGCs包括萜烯和III型聚酮合酶（各17个），以及betalactones、铁载体、色素（黑色素、间苯二酚）和各种小肽通路。例如，仅L. halophila就编码了九个不同的BGCs。有趣的是，研究还发现了大量杂合簇（如M. persicus中连续的arylpolyene-间苯二酚模块，以及M. iranensis中的NRPS-金属载体杂合体），表明这些细菌可以合成新颖的"镶嵌"代谢产物。
研究还鉴定出八种高质量前噬菌体，编码辅助基因如碳水化合物活性酶（CAZymes）和推定抗CRISPR（ACR）蛋白。细菌宿主本身配备了强大的防御系统，大多数菌株中检测到CRISPR-Cas位点（以I型为主）。最关键的是，研究鉴定了将BGCs与防御系统（如CRISPR-Cas、限制-修饰）和前噬菌体区域物理连接的多功能基因组岛。"堡垒假说"解释了这种架构：代谢产物生产和防御机制的共定位保护代谢投资免受噬菌体捕食和遗传丢失。这种整合性基因组排列凸显了极端环境中生存的复杂共进化策略。
编译者解读
从合成生物学应用视角看，该研究的核心价值在于系统揭示了极端环境微生物中"代谢-防御"基因簇物理偶联的普遍规律。四氢嘧啶生物合成基因簇的广泛存在（43次鉴定）提示这类渗透压保护剂在工业发酵中的潜在应用价值。杂合BGCs（如NRPS-金属载体）的发现为组合生物合成提供了天然的设计模板。然而，研究仍以计算机预测为主，缺乏湿实验验证——BGCs的表达产物、前噬菌体的诱导活性及"堡垒假说"的功能验证均有待实验证实。未来若能将此类基因组岛设计为可编程的合成生物学元件，或可为抗噬菌体工业菌株的理性设计提供全新思路。
参考来源
Rahimian M. In silico exploration of the genomic repertoire of Iranian aquatic bacteria: Prophage carriage, bioactive compound potential, CRISPR-Cas immunity, and integrated defensive-metabolic islands. Biochemistry and Biophysics Reports, 2026.
DOI: 10.1016/j.bbrep.2026.102452
DOI: 10.1016/j.bbrep.2026.102452