来源：Genome engineering a polyploid archaeon chassis Haloferax mediterranei using the endogenous type I–B CRISPR-Cas system for efficient biopolymer production（Advanced Industrial and Engineering Polymer Resear）| 编译：DNA Lab Space
导读
地中海富盐菌（Haloferax mediterranei）是生产高附加值生物聚合物PHBV（聚3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸酯）的优良古菌底盘，但缺乏高效基因组编辑工具长期制约其代谢工程改造。本研究利用该菌内源I-B型CRISPR-Cas系统，开发了一套多功能基因组编辑平台，实现基因删除效率超90%、多基因同时编辑、大片段染色体删除（最高24.9 kb）及DNA插入。通过基因组精简策略构建的底盘菌株ES1Δ123Δ24.9，在7-L生物反应器中以葡萄糖为碳源实现PHBV产量27.44 g/L，碳源转化率0.38 g PHBV/g葡萄糖——这是迄今古菌PHBV生产者中报道的最高碳源转化率。
研究背景
聚羟基脂肪酸酯（PHAs）是细菌和古菌在营养限制条件下合成的可生物降解、生物相容性生物聚合物，被视为传统塑料的环境友好替代品。其中，PHBV较聚3-羟基丁酸（PHB）具有更优异的机械性能——更高的柔韧性、更低的结晶度和更好的加工性，在工业和生物医学领域极具吸引力。然而，PHBV的大规模生产受制于3-羟基戊酸（3HV）前体（如丙酸或戊酸）补充带来的高成本和细胞毒性。
地中海富盐菌作为嗜盐古菌，生长迅速，可利用包括农业工业废弃物在内的多种低成本碳源，且其高盐生长条件降低了微生物污染风险、简化了发酵灭菌流程，是PHBV生产的理想菌株。然而，该菌基因组编辑工具的匮乏严重阻碍了其代谢工程改造。本研究旨在利用其内源I-B型CRISPR-Cas系统开发高效基因组编辑平台，进而构建基因组精简底盘菌株用于PHBV高效生产。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
本研究所用及构建的全部菌株列于表S1。Escherichia coli DH5α用于构建基因编辑质粒，E. coli JM110用于消除质粒甲基化。E. coli菌株在Luria-Bertani培养基中于37°C培养，需要时添加100 μg/mL氨苄青霉素。
H. mediterranei DF50ΔEPS为尿嘧啶营养缺陷型菌株，其pyrF基因和胞外多糖（EPS）基因簇已被敲除，由本研究组此前构建。H. mediterranei DF50ΔEPSΔ123为DF50ΔEPS的突变体，其主染色体的三个复制子（oriC1、oriC2和oriC3）已被敲除，用作基因组精简的起始菌株。DF50ΔEPS、DF50ΔEPSΔ123及其突变体在补充50 μg/mL尿嘧啶的AS-168培养基中于37°C培养。ES1为DF50ΔEPS衍生菌株，其pyrF基因已原位互补，在AS-168培养基中培养。携带pWL502及其衍生质粒的H. mediterranei菌株在AS-168SY培养基（去除酵母提取物的AS-168培养基）中培养以维持质粒稳定性。
对于H. mediterranei敲除突变体的反选择，在LPMG培养基中补充50 μg/mL尿嘧啶和250 μg/mL 5-氟乳清酸（5-FOA）。LPMG培养基含NaCl（110 g/L）、MgCl₂·6H₂O（20.51 g/L）、MgSO₄·7H₂O（29.52 g/L）、KCl（5 g/L）、NH₄Cl（2 g/L）、CaCl₂（1 g/L）、FeSO₄·7H₂O（50 mg/L）、MnCl₂·4H₂O（0.36 mg/L）、PIPES（15 g/L）、KH₂PO₄（18.75 mg/L）和葡萄糖（10 g/L）。
【数据】培养基：LB、AS-168、AS-168SY、MG、LPMG；温度：37°C；氨苄青霉素：100 μg/mL；尿嘧啶：50 μg/mL；5-FOA：250 μg/mL；NaCl：110 g/L；MgCl₂·6H₂O：20.51 g/L；MgSO₄·7H₂O：29.52 g/L；KCl：5 g/L；NH₄Cl：2 g/L；CaCl₂：1 g/L；FeSO₄·7H₂O：50 mg/L；MnCl₂·4H₂O：0.36 mg/L；PIPES：15 g/L；KH₂PO₄：18.75 mg/L；葡萄糖：10 g/L
2.2 质粒构建
本研究所用及构建的质粒列于表S2，所用引物汇总于表S3。基因删除质粒通过将mini-CRISPR阵列克隆至穿梭载体pWL502构建。mini-CRISPR阵列包含强组成型启动子P_phaR_、一个重复-间隔-重复模块和一个poly(T)终止子（T8）。mini-CRISPR阵列的合成由南京金斯瑞公司完成。每个靶标中与PAM序列（5′-TTG-3′）下游原间隔序列匹配的36-bp序列被特异性地选作间隔序列。
用于精确基因删除的质粒构建中，靶基因侧翼的上游和下游片段（300–600 bp）分别扩增并通过桥接PCR连接，然后插入pWL502。用于DNA序列插入的质粒构建中，插入序列及其上下游片段首先被克隆，然后插入pWL502。构建的质粒或线性PCR产物在转化入H. mediterranei前经DNA测序验证。
【数据】PAM序列：5′-TTG-3′；间隔序列长度：36 bp；同源臂长度：300–600 bp；启动子：P_phaR_；终止子：poly(T) T8
2.3 *H. mediterranei*转化与突变体验证
用于基因编辑的质粒首先转化入E. coli JM110以消除DNA甲基化。随后通过聚乙二醇（PEG）介导的转化方法将其转化入H. mediterranei DF50ΔEPS或DF50ΔEPSΔ123。从转化板（不含酵母提取物的AS-168培养基、MG培养基或LPMG培养基）随机刮取转化子，在蒸馏水中裂解。裂解液用作PCR模板，扩增子经DNA测序验证。
为评估基因编辑效率，从三个独立转化板的各二十个菌落中随机选取并裂解于ddH₂O中获得基因组，用作PCR模板。使用外部或内部引物通过PCR验证基因删除效率。扩增子经测序确定双向删除敲除的大DNA片段边界。
鉴于H. mediterranei的多倍体特性，基于PCR基因分型定义编辑状态：（i）杂合子：使用外部和内部引物同时检测到野生型和突变型条带。（ii）纯合子：仅检测到突变型条带。非必需基因的杂合敲除通过连续传代转化为纯合子。对于供体介导的删除，编辑效率指随机测试菌落中纯合敲除的百分比；而对于无供体双向删除，定义为携带PCR确认删除的白色菌落（筛选crtI删除）的比例。
对于质粒消除，携带质粒的菌株在含50 μg/mL尿嘧啶和250 μg/mL 5-FOA的AS-168培养基中培养两代。随后，培养物涂布于含尿嘧啶和5-FOA的AS-168琼脂培养基上培养获得单菌落，经PCR验证。质粒已消除的菌株用于下一轮基因组编辑。
【数据】转化方法：PEG介导；验证方法：PCR+DNA测序；筛选菌落数：20个/板×3板；质粒消除：AS-168+50 μg/mL尿嘧啶+250 μg/mL 5-FOA，两代
2.4 RNA提取、RT-qPCR与qPCR分析
使用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）从指数生长期细胞中提取总RNA，方法如前所述。10 μg RNA经RQ1 DNase（Promega，美国）处理以去除基因组DNA，1 μg RNA用于M-MLV逆转录酶（Promega，美国）逆转录生成cDNA。随后使用ViiA™ 7实时PCR系统（Applied Biosystems，美国）配合Kapa SYBR Fast qPCR预混液（KM4101，Kapa Biosystems）进行定量PCR（qPCR）。用于检测靶基因转录水平的qPCR引物列于表S3。三个独立实验的样品进行分析，以7S RNA基因作为内参。DF50ΔEPSΔ123的染色体拷贝数分析按照此前描述的方法通过qPCR进行。
【数据】RNA提取：TRIzol；DNase处理：10 μg RNA；逆转录：1 μg RNA；qPCR系统：ViiA™ 7；qPCR预混液：Kapa SYBR Fast（KM4101）；内参基因：7S RNA；独立实验数：3
2.5 摇瓶培养与细胞生长
种子培养制备中，ES1及H. mediterranei基因组精简突变体在AS-168液体培养基中于37°C培养36 h。随后将种子培养物接种（初始OD₆₀₀ = 0.1）至50 mL MS培养基中，MS培养基与MG培养基相似，但将10 g/L葡萄糖替换为20 g/L淀粉作为碳源。发酵在250 mL锥形摇瓶中于37°C进行120 h。在96 h收集35 mL培养物用于细胞干重（CDW）和PHBV产量分析。
使用微孔板读数仪（Biotek，美国）每24 h测定MS培养物0 h至120 h的OD₆₀₀值。将24 h的培养样品调整至相同细胞密度，用MG培养基制备系列稀释液。取5 μL 10²至10⁶稀释液点样于MG培养基平板，于42°C培养4天以比较其生长。每个菌株设置三个生物学重复。
【数据】种子培养：AS-168培养基，37°C，36 h；接种OD₆₀₀：0.1；培养基：MS（20 g/L淀粉）；培养体积：50 mL/250 mL摇瓶；温度：37°C；时间：120 h；取样时间：96 h（35 mL）；OD₆₀₀测定间隔：24 h；点样体积：5 μL；稀释度：10²–10⁶；平板培养：42°C，4天；生物学重复：3
2.6 补料分批发酵
基因组精简Haloferax mediterranei突变体的PHBV生产补料分批发酵在7 L发酵罐（Biotech-7BG-3，中国）中进行。菌株在AS-168培养基中于37°C培养36 h制备种子培养物。将300 mL种子培养物接种至含20 g/L葡萄糖的2.7 L MG培养基中。发酵温度和pH分别设定为37°C和7.0。通过添加5 M NaOH或2 M HCl调节pH。溶解氧含量设定为≥25%饱和度，通气速率设定为300 L/h以供应氧气。发酵过程中产生的泡沫通过添加消泡剂Defoamer消除。
在整个补料阶段采用pH-stat补料策略添加补料溶液（129 g/L NaCl、45.45 g/L NH₄Cl和500 g/L葡萄糖）。发酵持续108 h。每4 h取1 mL样品，用SBA-40D生物传感器分析仪（中国）实时测定残余葡萄糖浓度。每12 h取10 mL样品测定CDW和PHBV产量。培养物以10,000 rpm离心10 min收集细胞沉淀用于PHBV分析。上清液中的葡萄糖浓度使用1260 Infinity高效液相色谱（HPLC）系统定量分析。
【数据】发酵罐：7 L（Biotech-7BG-3）；种子培养：AS-168，37°C，36 h；接种量：300 mL/2.7 L；初始葡萄糖：20 g/L；温度：37°C；pH：7.0（5 M NaOH/2 M HCl调节）；溶解氧：≥25%饱和度；通气速率：300 L/h；消泡剂：Defoamer；补料液：129 g/L NaCl+45.45 g/L NH₄Cl+500 g/L葡萄糖；补料策略：pH-stat；发酵时间：108 h；取样：每4 h取1 mL（葡萄糖），每12 h取10 mL（CDW/PHBV）；离心：10,000 rpm，10 min
研究结果
3.1 利用内源I-B型CRISPR-Cas实现*H. mediterranei*高效单基因敲除
H. mediterranei的I-B型CRISPR-Cas系统由位于巨质粒pHM500上的八个cas基因（cas1-cas2-cas3-cas4-cas5-cas6-cas7-cas8）和六个CRISPR阵列组成，其中四个阵列位于主染色体上，两个（P12和P23）位于pHM500上（图2a）。Cas6、Cas5、Cas7和Cas8形成crRNA引导的Cascade复合物，并招募核酸酶Cas3（图1）。当TTG作为原型间隔序列邻近基序（PAM）时，该系统可介导对靶质粒的明显干扰，导致转化率降低98.9%。该系统已通过删除cas3基因开发为高效的CRISPRi工具——cas3编码的产物是降解靶核酸的核酸酶-解旋酶蛋白。
推测六个CRISPR阵列可能产生大量成熟crRNA并占据有限的Cascade复合物，从而对基于CRISPR-Cas的基因组编辑工具的效率产生负面影响。因此，研究首先在H. mediterranei DF50CRF（无CRISPR阵列）中通过使用不同数量的crRNA靶向crtI基因来评估基因组编辑效率。crtI基因位于主染色体上（图1），编码八氢番茄红素脱饱和酶，催化八氢番茄红素形成番茄红素。其缺失将导致可见的颜色变化——从粉红色变为白色。
设计了三个crRNA靶向crtI基因的开放阅读框（图S1a）。其中，两个crRNA（crtI-t1和t2）和一个crRNA（crtI-c1）分别靶向crtI的模板链和编码链。mini-CRISPR模块由靶向crtI基因的36-bp间隔序列（两侧为30-bp重复序列）组成，置于强组成型启动子P_phaR_控制下，连同由crtI侧翼上游（U，约300 bp）和下游（D，约300 bp）序列组成的供体，插入pWL502中，生成基因编辑质粒pWLGE-crtI（图2b）。
携带pWLGE-crtI的DF50CRF转化子首先在富营养培养基（AS-168SY培养基）中培养，所有转化子均形成橙色菌落，表明crtI未被成功删除。这可能归因于DF50CRF中高拷贝数的染色体。据报道，嗜盐古菌的多倍体程度在含低磷酸盐浓度的培养基中培养时会降低。转化子随后在含37.5 mg/L KH₂PO₄的MG固体培养基上筛选以删除crtI基因。
与DF50CRF（pWL502）相比，携带pWLGE-crtI的转化子数量随着crRNA数量的增加而逐渐减少（图S1b），表明自身靶向CRISPR引起了毒性。当同时使用两个crRNA（t1和t2）时，转化板上白色菌落（CrtI失活）的比例高于使用单个crRNA（t1）时。每组随机选取五个白色菌落进行PCR分析（图S1c）。
野生型和突变体特异性条带的同时存在表明，尽管使用了低磷酸盐培养基（含37.5 mg/L KH₂PO₄的MG培养基），crtI在DF50CRF中仍未完全敲除，转化子仍保持杂合状态。使用两个crRNA（t1/t2或t1/c2）时，突变体特异性条带更强、野生型条带更弱，表明前者的突变频率更高。这些结果表明，当多倍体进一步降低时，多个crRNA有望在H. mediterranei中实现成功的基因组编辑。
随后，使用染色体拷贝数较低的突变菌株DF50ΔEPSΔ123来实现crtI基因的成功编辑。使用含不同KH₂PO₄浓度的两种低磷酸盐培养基（MG，37.5 mg/L；LPMG，18.8 mg/L）筛选crtI基因编辑菌落。首先通过qPCR确定DF50ΔEPSΔ123的染色体拷贝数在低磷酸盐培养基中降低，但当细胞在富磷酸盐培养基（AS-168或MG）中培养时恢复至较高水平（图S2）。
如预期，在MG培养基上，单个crRNA（c1）在DF50ΔEPSΔ123中平均编辑效率为26.67%；在LPMG培养基上，crtI编辑效率提高至73.33%，相当于MG培养基的2.75倍（图2c、图S3a和图S3b）。基于多crRNA可能提高DF50CRF基因组编辑效率的结果（图S1c），引入双crRNA（c1和t1）策略进一步优化基因编辑工具，编辑效率达到86.67%，高于单crRNA（图2c和图S3c）。这些数据表明，使用多个crRNA和低多倍体Haloferax宿主可使H. mediterranei中CRISPR介导的基因编辑效率超过80%。
为进一步优化该基因编辑工具，研究确定了同源臂大小对基因编辑效率的影响。选择由HFX_2676（约2.7 kb）编码的新型PHA合成调控因子PspR作为靶基因（图2d）。设计两个crRNA（pspR-c和t），由pWLGE-pspR表达，分别靶向pspR的编码链和模板链。基于pWLGE-pspR，通过插入300 bp或600 bp长度的上游或下游同源臂构建了两个衍生质粒pWLGE-pspR600和pWLGE-pspR1200。将它们分别转化入DF50ΔEPSΔ123细胞中进行pspR删除。
随着同源臂长度从300 bp（pspR600）增加到600 bp（pspR1200），pspR删除效率从25%显著提高至91.67%（图2e和图S4）。因此，约600 bp的上游和下游同源臂可能适用于在H. mediterranei中实现高基因编辑效率。这些结果表明，靶向编码链和模板链的多个crRNA、长同源臂（约600 bp）和低磷酸盐筛选培养基可显著提高H. mediterranei DF50ΔEPSΔ123中的基因编辑效率。
【数据】PAM：TTG；转化率降低：98.9%；crtI编辑效率（MG，单crRNA）：26.67%；crtI编辑效率（LPMG，单crRNA）：73.33%（MG的2.75倍）；crtI编辑效率（LPMG，双crRNA）：86.67%；pspR删除效率（300 bp同源臂）：25%；pspR删除效率（600 bp同源臂）：91.67%；同源臂长度：300 bp/600 bp；靶基因pspR大小：约2.7 kb；KH₂PO₄浓度：MG 37.5 mg/L，LPMG 18.8 mg/L
3.2 双基因同时删除与胞外多糖生物合成基因簇插入
常用的“pop-in & pop-out”方法据推测无法同时敲除H. mediterranei基因组中位于不同位点的两个基因。目标基因的序贯敲除是一个耗时、费力且昂贵的过程。CRISPR-Cas系统作为强大的基因操作工具库，已被应用于多种微生物的多基因同时编辑。因此，探索CRISPR-Cas3系统在位于不同位点的双基因敲除中的潜力，对于开发高效的多基因同时删除编辑工具具有重要价值。
研究随机选择了两个与PHBV降解相关的非必需基因进行同时删除。一个是位于巨质粒pHM500上的胞外PHA解聚酶基因phaZ（HFX_6464，966 bp）；另一个是位于巨质粒pHM300上的（R）-烯酰-CoA水解酶基因phaJ（HFX_5217，660 bp）。设计两个crRNA（t和c），由质粒pWL502表达，分别靶向phaZ或phaJ的模板链和编码链（图3a）。
PCR结果表明，phaZ和phaJ在pHM500和pHM300上被同时删除。phaZ的敲除效率为40%，而phaJ的效率则高得多，达到100%（图S5a和S5b）。不同的编辑效率可能与crRNA与Cascade复合物的结合能力、靶基因的基因组环境或携带靶基因的巨质粒拷贝数有关。总之，这些结果表明，多重CRISPR-Cas3靶向策略能够一步敲除多个分离的基因，从而相比传统的“pop-in & pop-out”方法简化了H. mediterranei中的基因编辑。
【数据】phaZ基因大小：966 bp（位于pHM500）；phaJ基因大小：660 bp（位于pHM300）；phaZ敲除效率：40%；phaJ敲除效率：100%
3.3 多crRNA介导的大DNA片段删除
（注：此节原文节选未完整提供，以下基于摘要及上下文可确认的内容编译）
基于前述建立的多crRNA策略，研究进一步探索了利用多个crRNA实现大DNA片段删除的能力。通过设计靶向鞭毛基因簇不同位置的两个crRNA，实现了不同长度DNA片段的删除。删除效率随靶向片段长度的变化而不同。通过增加Cas3切割位点的数量，24.9-kb鞭毛基因簇的删除效率得到提高。
【数据】大片段删除范围：最高24.9 kb；crRNA数量：2个；靶向片段长度：可变（“Fla-X”中X表示kb）
3.4 基于CRISPR-Cas系统的无供体自发双向删除
在无供体DNA的条件下，利用内源MMEJ（微同源介导的末端连接）途径而非同源重组，靶向非必需基因crtI实现随机大片段删除。通过共表达iradA模块抑制RadA活性，crtI周围基因组区域的删除效率从2%提高至25%——在所有筛选的白色菌落中，实现了12.5倍的提升。双向删除产生的删除长度范围为0.5 kb至更大片段。
【数据】删除效率提升：2%→25%（12.5倍）；删除长度范围：0.5 kb起；策略：无供体+MMEJ+iradA抑制RadA
3.5 基因组精简菌株的生长特性与PHBV合成能力
通过整合上述基因组编辑策略，构建了删除总长度最高达43.5 kb（占基因组的1.11%）的基因组精简H. mediterranei底盘菌株。对四个菌株的生长表型和PHBV合成能力进行了评估。在MS琼脂培养基上，四种菌株表现出不同的生长表型。将24 h收获的细胞悬液调整至相同密度后系列稀释并点样于MS琼脂平板。OD₆₀₀曲线显示各菌株在MS培养基中的生长特征。
【数据】基因组删除总长度：最高43.5 kb（占基因组1.11%）；培养时间：24 h收获细胞；培养基：MS琼脂/液体
讨论与解读
本研究首次为Haloferax属建立了高效、可编程的基因编辑平台——利用其内源I-B型CRISPR-Cas系统，这距离在H. volcanii和H. mediterranei中首次鉴定CRISPR相关序列已过去三十年。基于低多倍体菌株H. mediterranei DF50ΔEPSΔ123，研究实现了2.7-kb pspR基因91.67%的敲除效率、两个不同基因组位点基因的同时删除以及4.9-kb EPS基因簇的精确插入。这些结果在速度和可靠性上均显著优于经典的pop-in & pop-out方法，使H. mediterranei的初步基因组精简成为可能。
对于定向大片段删除，通过增加Cas3切割位点的数量提高了24.9-kb鞭毛基因簇的删除效率。为实现随机大片段删除，研究在无修复模板条件下靶向非必需基因crtI，利用内源MMEJ途径而非同源重组。通过共表达iradA模块抑制RadA活性，crtI周围基因组区域的删除效率从2%提高至25%——12.5倍提升。整合这些基因组编辑策略后，构建了删除总长度最高达43.5 kb的基因组精简H. mediterranei底盘菌株。
编译者解读：该研究的核心价值在于将内源CRISPR-Cas系统从“防御机制”转化为“基因组手术刀”——不引入外源Cas蛋白，规避了异源表达毒性问题。多crRNA策略与低多倍体宿主的组合拳，精准击破了多倍体古菌编辑效率低的技术瓶颈。尤其值得关注的是无供体双向删除策略：利用MMEJ途径配合RadA抑制，以极简设计实现了随机大片段删除，为古菌基因组精简提供了全新范式。27.44 g/L的PHBV产量和0.38 g/g的碳源转化率，使该底盘菌株具备了工业化竞争潜力。局限在于当前编辑效率仍受靶位点环境影响，且43.5 kb的删除规模与最小基因组目标尚有距离——但这恰恰为后续合成生物学迭代留下了明确的技术路线图。
参考来源
期刊：Advanced Industrial and Engineering Polymer Research, 2026
DOI: 10.1016/j.aiepr.2026.07.003
DOI: 10.1016/j.aiepr.2026.07.003