来源：Metabolic reprogramming of abscisic acid-producing strain Botrytis cinerea TB-31 toward terpenoid biosynthesis using a CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein system（Synthetic and Systems Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space
导读
灰葡萄孢（Botrytis cinerea）TB-31是研究倍半萜脱落酸（ABA）生物合成与调控的重要丝状真菌平台。本研究在该菌株中建立了基于CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物的基因编辑系统，实现了单基因、多基因敲除、大片段删除及异源蛋白表达。完全敲除ABA生物合成基因簇（BGC）的△bcaba1234菌株展现出显著的代谢流重定向，将细胞资源转向萜类前体生物合成，为高价值萜类化合物的生产奠定了底盘菌株基础。
研究背景
丝状真菌是一类具有典型菌丝结构的真核微生物，能够产生包括萜类、聚酮类和非核糖体肽在内的多种次级代谢产物。萜类化合物作为源自异戊二烯（C5）单元的多样化天然产物，在制药、营养保健、香料和生物能源等领域具有重要工业价值。丝状真菌中萜类生物合成主要通过甲羟戊酸（MVA）途径进行，异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）作为基本结构单元，经异戊烯基转移酶依次缩合形成不同链长的线性异戊二烯焦磷酸，包括牻牛儿基焦磷酸（GPP，C10）、法尼基焦磷酸（FPP，C15）和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP，C20），最终经萜烯合酶环化及细胞色素P450和脱氢酶的氧化修饰产生结构多样的萜类化合物。与常规微生物宿主相比，丝状真菌在大规模生物合成高价值化合物方面具有显著优势，但针对合成生物学应用的菌株工程和发酵优化策略研究仍十分有限。
研究方法
2.1 菌株
B. cinerea TB-31（由本实验室从野生型菌株B. cinerea TBC-6分离并保藏）在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上、26°C条件下培养使用。转录组和代谢组分析时，菌株在液体发酵培养基中、25°C、200 rpm条件下培养。
【数据】培养基：PDA；温度：26°C（常规培养）/25°C、200 rpm（发酵培养）
2.2 质粒构建
使用相应引物（表S1）扩增各类核酸片段。为荧光显微观察、基因编辑和蛋白表达构建质粒。所有构建体均通过DNA测序验证。操作如下：
来自Streptococcus pyogenes的密码子优化的Cas9获自质粒p414-TEF1p-Cas9-CYC1t（Addgene编号：#43802），用于在B. cinerea TB-31中表达。代表Cas9与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和四个串联核定位信号（4NLSs）融合的片段Cas9-EGFP-4NLSs通过重叠聚合酶链式反应（PCR）获得，并克隆到本实验室先前构建的载体pCBh1中，产生pCBh1-Cas9-EGFP-4NLSs。Cas9-4NLSs编码序列克隆到pCBh1和pCBg418中，分别产生pCBh1-Cas9-4NLSs或pCBg418-Cas9-4NLSs质粒。密码子优化的与四个NLS融合的Cas9用引物Cas9-F/R扩增，然后克隆到载体pET28a中产生pET28a-Cas9-4NLSs。以pET28a-Cas9-4NLSs为模板，用引物PpkiA-Cas9-F和Cas9-TglaA-R扩增Cas9-4NLSs片段，克隆到载体Anep8-Cas9（Addgene编号：#117169）的NheI和PacI位点，生成pAnep8-Cas9-4NLSs-AMA1。
含sgRNA的质粒pJET1.2-pU6-sgRNA-laeA的构建如下：首先设计并合成bclaeA的20-nt靶序列。该序列连同来自p426-SNR52p-gRNA（Addgene编号：#43803）的gRNA骨架和B. cinerea U6启动子，组装成PU6-20 nt-gRNA骨架构建体。最后将所得片段克隆到平末端克隆载体pJET1.2（Addgene编号：#173156）中扩增。
质粒pTEL-hyg含有一对端粒并提供瞬时潮霉素抗性，由Matthias Hahn教授（德国凯泽斯劳滕大学生物系）惠赠。用作供体DNA的片段通过两步过程构建。首先进行PCR扩增获得三个不同DNA片段：5′同源臂、G418抗性基因表达盒（PanTrpC::G418）和3′同源臂。然后通过重叠延伸PCR组装这些片段，随后导入原生质体进行转化。对于mCherry蛋白的异源表达，从质粒pCAMBIA1303（MiaoLing Bio，Cat#P46327）获得PgpdA启动子驱动的mCherry表达盒（PgpdA:mCherry）；通过重叠PCR添加与G418抗性基因相邻的同源臂，生成供体DNA。
【数据】质粒来源：p414-TEF1p-Cas9-CYC1t（Addgene #43802）、Anep8-Cas9（Addgene #117169）、p426-SNR52p-gRNA（Addgene #43803）、pJET1.2（Addgene #173156）；抗性标记：潮霉素B、G418
2.3 农杆菌EHA105介导的转化（ATMT）
ATMT参照文献[36,37]稍作修改进行。将重组质粒pCBh1-Cas9-EGFP-4NLSs或其他指定质粒转染到Agrobacterium tumefaciens EHA105中，在28°C、220 rpm条件下培养至OD600达到0.35–0.45。将100 μLB. cinerea TB-31或其改良菌株的分生孢子（1 × 10⁷）与100 μL菌液混合，涂布到铺有硝酸纤维素（NC）膜的固体培养基上，培养2天。将膜无菌转移到补充有潮霉素B（50 μg/mL；Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）和200 μM头孢噻肟的PDA固体培养基上，28°C培养3–7天直至转化子菌落出现。为纯化推定的阳性转化子，单孢分离物在含相应筛选抗生素的PDA平板上连续传代至少三代。
【数据】菌株：A. tumefaciens EHA105；OD600：0.35–0.45；温度：28°C（共培养）/28°C（筛选培养）；转速：220 rpm；孢子量：1 × 10⁷；时间：2天（共培养）/3–7天（筛选）；潮霉素B浓度：50 μg/mL；头孢噻肟浓度：200 μM
2.4 荧光显微观察
采用ATMT法将质粒pCBh1-Cas9-EGFP-4NLSs转化到B. cinerea TB-31中。转化子在含50 μg/mL潮霉素B的PDA平板上筛选，并用引物对EGFP-F/4NLSs-R通过PCR确认。将转化子的单菌落接种到放置无菌载玻片的PDA平板上。培养72小时后，菌丝样品用10 μL含DAPI（1.5 μg/mL）的抗淬灭培养基封片，使用配备63 × 油浸物镜的Leica DMi8倒置荧光显微镜分析核荧光。对于红色荧光mCherry观察，样品在相同条件下但使用40 × 物镜检查。
【数据】潮霉素B浓度：50 μg/mL；培养时间：72h；DAPI浓度：1.5 μg/mL；显微镜：Leica DMi8；物镜：63 ×（核荧光）/40 ×（mCherry）
2.5 Cas9蛋白表达与纯化
将质粒pET28a-Cas9-4NLSs转化到化学感受态E. coli Tssetta（DE3）细胞（ESC-E04，擎科生物技术有限公司，北京，中国）中。当600 nm光密度达到0.6时，向培养基中加入终浓度0.2 mM的异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷（IPTG）。过夜培养后，收集细胞并在提取缓冲液（20 mM HEPES、500 mM NaCl、1 mM DTT，pH 7.5）中用超声波处理10分钟破碎。然后将细胞匀浆在4°C离心30分钟。上清液上样至HisTrap Ni-NTA柱，在4°C旋转孵育1小时。用含20 mM咪唑的提取缓冲液洗去未结合蛋白。用5倍柱体积的洗脱缓冲液（20 mM HEPES、200 mM咪唑、500 mM NaCl、pH 8.0、1 mM DTT、2 mM MgCl₂、5%甘油）洗脱结合蛋白。随后使用10 kDa Vivaspin柱浓缩并更换缓冲液。用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度后，最终蛋白在液氮中冷冻并保存于−80°C备用。
【数据】IPTG浓度：0.2 mM；OD600：0.6；提取缓冲液：20 mM HEPES、500 mM NaCl、1 mM DTT、pH 7.5；超声时间：10 min；离心：4°C、30 min；洗脱缓冲液：20 mM HEPES、200 mM咪唑、500 mM NaCl、pH 8.0、1 mM DTT、2 mM MgCl₂、5%甘油；保存温度：−80°C
2.6 sgRNA合成与RNP形成
本研究中使用的sgRNA通过体外转录从DNA模板合成，参照先前描述的方法稍作修改[33]。首先在NCBI网站上分析靶基因的保守结构域，用于设计和选择高特异性sgRNA。然后合成20-nt靶位点寡核苷酸（含T7启动子），与恒定寡核苷酸退火形成双链DNA模板。使用T7 High Yield RNA Transcription Kit（南京Vazyme生物技术有限公司）转录sgRNA，然后用RNA Clean & Concentrator Kit（Zymo Research Corp.，Irvine，California，USA）纯化。为形成RNP，将纯化的Cas9蛋白和成熟sgRNA以3:2的比例加入孵育缓冲液（20 mM HEPES、pH 7.5、100 mM KCl、5%甘油、1 mM DTT、0.5 mM EDTA、2 mM MgCl₂）中，37°C孵育30分钟。
【数据】Cas9:sgRNA比例：3:2；孵育缓冲液：20 mM HEPES、pH 7.5、100 mM KCl、5%甘油、1 mM DTT、0.5 mM EDTA、2 mM MgCl₂；温度：37°C；时间：30 min
2.7 不同sgRNA的体外切割实验
将数个靶向同一基因（如bclaeA）的sgRNA（4 μg）分别与纯化的6 μg Cas9蛋白在切割缓冲液（20 mM HEPES、pH 7.5、100 mM KCl、5%甘油、1 mM DTT、0.5 mM EDTA、2 mM MgCl₂）中37°C孵育15分钟。然后向反应体系中加入靶基因CDS片段，37°C反应1小时。为终止反应，加入1 mg/mL蛋白酶K、10 mM CaCl₂和1%十二烷基硫酸钠（SDS），55°C孵育1小时，离心后取上清液用2%琼脂糖凝胶电泳分析。
【数据】sgRNA用量：4 μg；Cas9蛋白用量：6 μg；切割缓冲液：20 mM HEPES、pH 7.5、100 mM KCl、5%甘油、1 mM DTT、0.5 mM EDTA、2 mM MgCl₂；温度：37°C（切割反应）/55°C（终止反应）；时间：15 min（预孵育）/1 h（切割）/1 h（终止）；蛋白酶K：1 mg/mL；CaCl₂：10 mM；SDS：1%
2.8 *B. cinerea*转化
B. cinerea原生质体转化参照已发表方案稍作修改进行[38]。首先将2 × 10⁷成熟孢子涂布在覆盖玻璃纸的PDA平板上以形成原生质体。萌发菌丝在72小时后收获，用KC缓冲液洗涤两次。
【数据】孢子量：2 × 10⁷；培养时间：72h；缓冲液：KC缓冲液
图1 CRISPR/Cas9 RNP系统基因编辑策略及B. cinerea TB-31萜类合成途径。(A)–(B) CRISPR/Cas9介导的B. cinerea TB-31基因编辑工作流程示意图，使用预组装的Cas9-sgRNA RNP复合物。关键步骤包括：(1) 设计并合成靶向目的基因的sgRNA；(2) 体外组装Cas9蛋白与sgRNA形成RNP复合物；(3) 通过PEG介导转化将两种RNP和端粒载体pTEL-hyg（A）或含G418盒的供体DNA（B）递送至B. cinerea原生质体；(4) 编辑菌株的再生与筛选。(C)–(F) ABA BGC内单基因编辑的基因组示意图：△bcaba1 (C)、△bcaba2 (D)、△bcaba3 (E)和△bcaba4 (F)；(G)–(H) ABA BGC多基因编辑的基因组示意图：△bcaba124 (G)、△bcaba1234 (H)。使用IBS 2.0 [66]生成基因结构示意图，基因长度按比例缩小。验证引物的结合位置用黑色箭头标示。
研究结果
3.1 在*B. cinerea* TB-31中建立CRISPR/Cas9基因编辑
为在B. cinerea TB-31中建立CRISPR/Cas9基因编辑，采用了三种不同策略。
第一种策略涉及在B. cinerea TB-31中稳定表达Cas9。编码Cas9-EGFP-4NLSs的核酸序列被克隆并插入表达载体pCBh1，通过ATMT转化质粒整合到B. cinerea TB-31的染色体中。荧光显微镜显示融合蛋白Cas9-EGFP-4NLSs定位于B. cinerea TB-31的细胞核（图S1），这是其进行基因组编辑的先决条件。在研究初期阶段，我们旨在通过同源重组将Cas9整合到已报道的亚硝酸还原酶（bcniiA）中性基因组位点。该位点此前被报道对真菌生长无影响[11]。我们尝试使用对应于bcniiA 5′和3′区域的1 kb同源臂，将5496 bp的Cas9表达盒（Panolic::Cas9）和潮霉素B抗性表达盒（PanTrpC::hph）整合到bcniiA位点。然而，尽管进行了三次独立的转化尝试，仍无法获得在靶位点成功整合的阳性转化子。这可能归因于丝状真菌同源重组效率低，尤其是对于大DNA片段（1000 bp + 7380 bp + 1000 bp）。
随后，我们利用农杆菌介导转化（ATMT）的随机整合方式将cas9基因引入B. cinerea基因组。该方法能够高效产生多个表达Cas9的转基因菌株，并有助于阳性转化子的鉴定。然而，与空载体对照相比，含Cas9编码序列的整合型质粒转化 consistently 产生的转化子数量显著减少（图S2A）。在随机选取的18个转化子中，17个与转空载体（pCBh1-blank）的对照菌株（TB-31-P）相比，ABA含量出现显著且不同程度的下降（图S2B）。为进一步评估这些随机整合Cas9菌株的有效性，我们还检测了其菌落形态和遗传稳定性。整合的Cas9-4NLSs表达不影响菌落形态（图S3），但被发现遗传不稳定。PCR验证显示，在含抗生素培养基上第四代传代后，16.7%（4/24）的转化子丢失了Cas9基因，而所有TB-31-P对照菌株均稳定保留空载体。这种不稳定性可能归因于Cas9的潜在细胞毒性，多项研究已有报道[40,41]。Cas9的引入可能在B. cinerea中产生超出观察到的ABA生物合成减少之外的多效性效应。这些结果表明，随机整合策略不适合用于产生稳定修饰菌株，并可能对未来工业应用构成潜在风险。
第二种策略涉及通过将表达Cas9-4NLSs和sgRNA的质粒共转化到B. cinerea TB-31原生质体中，实现Cas9的瞬时表达。携带Aspergillus nidulans AMA1序列（能够自主复制并在非选择条件下快速丢失）的质粒通常用于丝状真菌中的Cas9/sgRNA表达[42]。将Cas9-4NLSs片段克隆并插入pAnep8-AMA1载体，在组成型pkiA启动子下表达。测量了十二个随机选取的Cas9瞬时表达菌株的ABA产量。与TB-31相比，结果显示这些菌株的ABA产量无显著影响（图S4），表明质粒中Cas9的瞬时表达对该菌株的影响相对较小。
选择B. cinerea VELVET复合物成员BclaeA[43]作为靶蛋白来测试编辑系统，因其具有明显的表型效应。△bclaeA突变体（代表缺乏bclaeA的TB-31）表现出"棉花糖样"形态，具有白色菌丝，为成功编辑提供了视觉确认[22]。靶向bclaeA的sgRNA在U6启动子下合成并克隆到pJET1.2载体中。将5 μg pAnep8-Cas9-4NLSs-AMA1质粒和5 μg pJET1.2-sgRNA-laeA质粒以1:1比例共转化到1 × 10⁸个B. cinerea TB-31原生质体中，通过潮霉素B抗性筛选转化子。值得注意的是，pJET1.2-sgRNA-laeA质粒不含真菌选择标记，我们仅使用一种浓度的潮霉素B进行筛选。最终仅获得18个转化子；PCR检测未发现基因编辑，转化子中未观察到显著表型变化。这些结果表明该策略的编辑效率非常低。
第三种策略涉及将CRISPR-Cas9 RNP复合物转化到B. cinerea TB-31中。使用预组装RNP复合物进行CRISPR/Cas9介导的B. cinerea TB-31基因编辑的工作流程如图1A–B所示。纯化的Cas9和sgRNA靶位点如图S5–7所示。当与sgRNA形成核糖核蛋白（RNP）复合物时，高纯度Cas9蛋白在体外表现出强大的切割活性（图S8）。将10 μg提供瞬时潮霉素B抗性的端粒载体pTEL-hyg[33]与组装的RNP共转化到1 × 10⁸个B. cinerea TB-31原生质体中。通过选择性平板筛选和PCR验证，结合表型鉴定，在分析的54个转化子中鉴定出16个具有显著大片段基因缺失的阳性转化子。这些结果表明该系统对bclaeA的单基因编辑效率约为30%。bclaeA基因敲除改变了菌落表型特征并降低了ABA产量（图S9–10），与早期发现一致[22]。在非选择性培养基上传代数次后，端粒载体pTEL-hyg被消除。因此，该系统能够实现无标记编辑，适用于B. cinerea TB-31的高效遗传修饰。
【数据】同源臂长度：1 kb；Cas9表达盒大小：5496 bp；总整合片段：1000 bp + 7380 bp + 1000 bp；Cas9基因丢失率：16.7%（4/24）；转化子数量：18个（策略二）/54个（策略三）；阳性转化子：16个；编辑效率：约30%；质粒用量：5 μg + 5 μg（策略二）/10 μg pTEL-hyg（策略三）；原生质体数量：1 × 10⁸
图2 修饰菌株的菌落形态与直径、生长曲线及代谢物。(A) 八种修饰菌株的菌落形态。B. cinerea TB-31和基因敲除菌株在PDA上培养，3和7 dpi时拍照。(B) B. cinerea TB-31和基因敲除菌株的菌落直径。B. cinerea TB-31和修饰菌株在PDA平板上25°C培养7天。数据为中位数及四分位距（n = 3）。(C)–(D) B. cinerea TB-31和基因敲除菌株的生长曲线。使用生长分析仪在指定时间点测量B. cinerea TB-31和单基因敲除菌株（C）及多基因敲除菌株（D）孢子悬浮液的光密度（OD600）。数据为中位数±四分位距（n = 3）。(E)–(H) TB-31中ABA及△bcaba1、△bcaba2和△bcaba4中ABA前体的MS/MS碎裂谱。主要碎片离子标注有对应的m/z值。
3.2 CRISPR/Cas9介导的ABA BGC单基因编辑
为进一步评估该系统对其他基因的编辑能力，我们使用已建立的CRISPR-Cas9 RNP复合物系统靶向了ABA生物合成相关基因簇中的四个基因（bcaba1、bcaba2、bcaba3和bcaba4）。最初，我们为四个基因中的每个基因设计了至少两个靶向外显子的sgRNA（图S11）。sgRNA的靶标特异性和RNP的切割活性也在体外进行了评估（图S12）。为提高编辑效率，我们同时将两对具有高切割活性的RNP导入B. cinerea TB-31原生质体中，以删除靶基因。编辑示意图如图1C–F所示。
基于体外验证结果，选择两个sgRNA组装成RNP复合物用于bcaba1的靶向编辑。将两个RNP与10 μg pTEL-hyg共转化到1 × 10⁸个B. cinerea TB-31原生质体中，使用潮霉素B筛选转化子。在筛选的24个转化子中，通过诊断PCR和测序确认了8个阳性候选。bcaba1的编辑效率在该单次研究中约为33.3%。
对于bcaba2编辑，将两个已验证的高效sgRNA组装成RNP，与10 μg pTEL-hyg载体共转化到1 × 10⁸个B. cinerea TB-31原生质体中。通过诊断PCR和DNA测序，在筛选的17个转化子中鉴定出8个阳性转化子。bcaba2的编辑效率在该研究中为47.1%。
由于原文节选在此处中断，后续bcaba3、bcaba4及多基因编辑（△bcaba124、△bcaba1234）的详细结果原文未完整呈现。
【数据】bcaba1编辑效率：33.3%（8/24）；bcaba2编辑效率：47.1%（8/17）；pTEL-hyg用量：10 μg；原生质体数量：1 × 10⁸
图3 B. cinerea菌株TB-31、△bcaba3和△bcaba1234的转录组分析。(A)–(B) 转录组数据（RNA-seq）与RT‒qPCR验证的回归分析。△bcaba3 vs. TB-31：R² = 0.94，P < 0.001（A）；△bcaba1234 vs. TB-31：R² = 0.97，P < 0.001（B）。(C) △bcaba1234与TB-31相比MVA途径基因相对转录水平的热图。基因转录水平使用Z score转换进行标准化，计算公式为(X-mean)/SD，表示高于或低于平均转录水平的标准差数。上调基因以红色突出显示，下调基因以蓝色显示。数据来自三个独立的生物学重复。(D) △bcaba1234与TB-31相比参与其他次级代谢途径的DEG相对转录水平热图。(E) △bcaba1234菌株与TB-31菌株相比参与细胞内初级代谢途径的基因相对转录水平热图。代谢途径以灰色框标记。PPP：磷酸戊糖途径；TCA：三羧酸循环；GYC：乙醛酸循环。
图4 △bcaba3和△bcaba1234菌株与TB-31相比的非靶向代谢组学分析。(A) 代谢组学谱的PCA分析，显示对照菌株TB-31和突变菌株△bcaba3及△bcaba1234的明显聚类。每个点代表一个生物学重复，每个主成分（PC1和PC2）解释的方差百分比标注在坐标轴上。(B) 维恩图显示三种菌株间差异丰度代谢物（DAM）的重叠。DAM使用|log2 FC| > 1和调整后p值（FDR）< 0.05的阈值鉴定。(C)–(H) △bcaba3和△bcaba1234与TB-31相比关键萜类生物合成前体的相对含量。包括丙酮酸（C）、甲羟戊酸内酯（D）、IPP（E）、GPP（F）、FPP（G）和GGPP（H）在内的关键萜类生物合成前体的相对含量在菌株间进行了定量和比较。数据为三个独立生物学重复的平均值±SEM。统计学显著性使用单因素方差分析确定。∗，P < 0.05；∗∗，P < 0.01；∗∗∗，P < 0.001。
图5 胞外萜类生物合成的广泛靶向代谢组学及转录组-代谢组整合分析。(A)–(B) △bcaba3 vs. TB-31（A）和△bcaba1234 vs. TB-31（B）中差异丰度代谢物的火山图。差异丰度代谢物基于VIP、FC和统计学显著性（P值）筛选。红色和绿色点分别表示显著上调和下调的代谢物（VIP >1，FC ≥ 2和FC ≤ 0.5，P < 0.05）；灰色点表示不显著的代谢物。x轴代表log2 FC（相对丰度的倍数变化）。(C)–(D) 转录组与萜类代谢组数据的九象限关联分析。图比较了△bcaba3 vs. TB-31（C）和△bcaba1234 vs. TB-31（D）比较中基因和代谢物的差异表达模式。象限3和7代表一致表达模式，而象限1和9代表拮抗表达模式。(E)–(F) 关键差异代谢物及相关基因模块的WGCNA分析。(E) 转录组与非靶向代谢组数据的整合。(F) 转录组与靶向萜类代谢组数据的整合。
图6 基于CRISPR/Cas9的靶向整合系统。(A) mCherry靶向整合的基因组示意图。(B) 荧光显微镜图像显示△bcaba1234菌株中mCherry靶向整合的有效表达，使用5天龄载玻片萌发体，细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺：20 μm。
讨论与解读
B. cinerea因其在萜类生物合成放大方面的固有优势，已被广泛用于ABA的工业化发酵生产。本研究旨在ABA生产菌株B. cinerea TB-31中建立并优化CRISPR/Cas9基因编辑系统，以扩展其代谢工程工具箱，用于迭代菌株改良，并拓宽其合成ABA以外其他高价值萜类化合物的能力。通过研究，我们成功建立并改进了B. cinerea TB-31中基于RNP的CRISPR/Cas9系统，并产生了多个ABA BGC单基因或多基因敲除的修饰菌株。结果表明，使用两个RNP靶向单个基因或基因簇可提高编辑效率，尤其是当RNP与较短同源臂侧翼的供体DNA共转化时。完全敲除整个ABA BGC导致MVA途径上调和萜类生物合成前体水平增加。此外，该方法可用于该菌株的位点特异性基因组整合，这对于关键基因的稳定表达和代谢途径工程至关重要。
CRISPR/Cas9基因组编辑系统已在丝状真菌中应用于遗传工程和代谢工程改造。然而，由于其多核特性、极低的同源重组效率以及可选择标记的有限可用性，丝状真菌的基因编辑仍面临诸多技术挑战。
编译者解读
本研究展示了RNP递送策略在丝状真菌基因编辑中的显著优势——相比质粒介导的Cas9表达，RNP策略避免了Cas9长期表达带来的细胞毒性和遗传不稳定性，同时实现了约30%–47%的单基因编辑效率。完全敲除ABA BGC后代谢流重定向至萜类前体合成的发现，验证了"去除竞争性分支途径"这一经典代谢工程策略在丝状真菌中的有效性。该工作为ABA工业菌株向通用萜类底盘菌株的转型提供了可行路径，但多基因编辑效率的进一步提升及编辑菌株的工业发酵性能仍需后续验证。
参考来源
Hou X-N. Metabolic reprogramming of abscisic acid-producing strain Botrytis cinerea TB-31 toward terpenoid biosynthesis using a CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein system. Synthetic and Systems Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.synbio.2025.12.002
DOI: 10.1016/j.synbio.2025.12.002