来源：Efficient metabolic pathway modification in various strains of lactic acid bacteria using CRISPR/Cas9 system for elevated synthesis of antimicrobial compounds（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space
导读
乳酸菌作为公认安全（GRAS）的微生物，在食品防腐领域展现出巨大潜力，但其产生的类细菌素抑制物质（BLIS）产量有限，难以满足商业化需求。本研究建立了一种优化的双质粒CRISPR/Cas9系统，通过敲除乳酸脱氢酶基因（ldh）将碳代谢流从乳酸合成转向抗菌化合物生产。研究在五株乳酸菌中成功实现了基因敲除，突变株对食源性病原体的抑制活性较野生型最高提升78%，其中粪肠球菌GM1003-ldhΔ突变株表现出最强的杀菌效果。
研究背景
食品防腐剂对保障食品安全与品质至关重要，可防止微生物、物理及化学因素引发的食品腐败和食源性疾病。随着消费者对无化学添加食品的需求日益增长，食品工业被迫转向天然防腐剂，如生物活性肽、细菌素和精油等。细菌素是由多种细菌群分泌的抗菌肽，已鉴定的细菌素大部分由乳酸菌产生，分为三类：I类（羊毛硫抗生素）为分子量≤10 kDa且含羊毛硫氨酸的翻译后修饰细菌素，代表物为乳酸乳球菌产生的乳链菌肽（Nisin）；II类（非羊毛硫抗生素）为无翻译后修饰的低分子量细菌素。尽管乳酸菌的抗菌活性已被广泛认知，但BLIS产量受限成为其商业化应用的瓶颈。本研究旨在建立优化的双质粒CRISPR/Cas9系统，通过敲除ldh基因将碳代谢流从乳酸转向抗菌活性化合物，从而提升BLIS产量。
研究方法
2.1 菌株、培养条件与质粒DNA
本研究所用质粒与菌株清单见表1。选用前期研究中筛选的乳酸菌菌株——开菲尔来源的副干酪乳杆菌K2003（Lacticaseibacillus paracasei K2003）、酸奶来源的植物乳杆菌Y1002（Lactiplantibacillus plantarum Y1002）、奶开菲尔来源的鼠李糖乳杆菌MK2003（Lacticaseibacillus rhamnosus MK2003）、羊奶来源的粪肠球菌GM1003（Enterococcus faecalis GM1003），以及乳酸乳球菌乳酸亚种ATCC 11454（Lactococcus lactis subsp. Lactis ATCC 11454）作为基因工程改造的候选菌株。所有乳酸菌均在MRS肉汤（Oxoid，汉普郡，英格兰）中37°C静置培养。产乳链菌肽的乳酸乳球菌（作为模型和参考菌株）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，美国），在添加1%葡萄糖的M17肉汤（Oxoid，汉普郡，英格兰）中30°C静置培养。用于抗菌测定的指示菌株——革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌ATCC 6538、枯草芽孢杆菌ATCC 19659、单核细胞增生李斯特菌ATCC 7644，以及革兰氏阴性菌大肠杆菌ATCC 8739和副溶血性弧菌ATCC 17802——均在LB肉汤（Merck，达姆施塔特，德国）中37°C过夜培养。大肠杆菌TOP10和大肠杆菌MC1061（Invitrogen，美国）在LB培养基（Merck，达姆施塔特，德国）中37°C培养，用于分子克隆和质粒扩增。为维持乳酸菌和大肠杆菌的选择压力，分别在相应培养基中添加红霉素（5 µg/mL和150 µg/mL）或氯霉素（10 µg/mL和20 µg/mL），必要时联合使用。细胞生长通过UV/Vis分光光度计（Techcomp UV1000，泰国）测量600 nm处吸光度（OD600）监测。所有菌株以甘油保存于−80°C备用。
【数据】培养基：MRS/M17/LB；温度：37°C/30°C；抗生素：红霉素5 µg/mL和150 µg/mL、氯霉素10 µg/mL和20 µg/mL；检测波长：OD600；保存温度：−80°C
2.2 表达cas9的质粒载体构建
以pNZ8148质粒（Cmr）（PVT5205，Nova Lifetech Inc.）为骨架载体构建驱动cas9表达的穿梭载体。化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的II型CRISPR RNA引导核酸内切酶Cas9（Gene ID: 46806597）由GenScript（中国）合成，插入经PstI/SpeI酶切的pNZ8148多克隆位点（MCS），生成cas9_pNZ8148载体。克隆和质粒扩增在大肠杆菌MC1061中进行。添加20 µg/mL氯霉素的生长培养基用于筛选阳性转化子，并通过DNA测序和限制性内切酶酶切验证（EcoRI和BamHI，37°C水浴40 min）。
【数据】骨架载体：pNZ8148（Cmr）；酶切位点：PstI/SpeI；筛选抗生素：氯霉素20 µg/mL；酶切验证：EcoRI和BamHI，37°C，40 min
2.3 单链引导RNA设计与sgRNA表达质粒构建
使用Benchling软件（旧金山，CA）（https://benchling.com/）的CRISPR/Cas引导设计工具设计了多个靶向ldh基因（GenBank: M95919.1）敲除的单链引导RNA（sgRNA）候选序列，并通过Cas-OFFinder搜索潜在脱靶位点。选定的引导序列5‘-GCATACATCATGGGTGAACA-3’两端带AccI和SphI酶切位点。该序列由GenScript（中国）合成，经AccI和SphI酶切后组装入质粒载体。编码红霉素抗性的pMG36e（PVT5201，Nova lifetech Inc.）作为驱动sgRNA表达的骨架载体。通过EcoRI和XbaI双酶切，将天然启动子P32替换为强组成型启动子P8，以提高sgRNA表达水平，生成P8-pMG36e。重组质粒通过热激法转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。阳性转化子通过在含红霉素（150 µg/mL）的培养基中培养筛选。通过测序比对验证插入序列。选定的sgRNA通过AccI和SphI位点克隆入P8-pMG36e的多克隆位点，生成sgRNA_P8-pMG36e，并经DNA测序进一步验证（GenScript，中国）。
【数据】sgRNA靶序列：5’-GCATACATCATGGGTGAACA-3‘；酶切位点：AccI/SphI、EcoRI/XbaI；启动子：P8（强组成型）；筛选抗生素：红霉素150 µg/mL
2.4 乳酸菌电感受态细胞制备
乳酸乳球菌ATCC 11454电感受态细胞的制备参考前期研究并略作修改。从培养24 h的平板上挑取乳酸乳球菌ATCC 11454单菌落，在3 mL含1.5%甘氨酸的SGM17培养基（M17含0.5%葡萄糖和0.5 M蔗糖）中过夜培养至OD600为0.5–0.8。然后取1 mL过夜培养物稀释于40 mL含甘氨酸的SGM17培养基中，30°C培养3–4 h至OD600为0.2–0.5。细胞经4°C离心收集（3500 rpm，10 min），用20 mL冰预冷的含10%甘油的0.5 M蔗糖溶液洗涤两次。细胞最终重悬于洗涤液体积的1/100中，−80°C保存备用。副干酪乳杆菌K2003、植物乳杆菌Y1002、鼠李糖乳杆菌MK2003和粪肠球菌GM1003电感受态细胞采用上述类似方法制备，仅将M17替换为MRS培养基。
【数据】培养基：SGM17（0.5%葡萄糖+0.5 M蔗糖）+1.5%甘氨酸；OD600范围：0.5–0.8（过夜）/0.2–0.5（稀释后）；离心：4°C，3500 rpm，10 min；洗涤液：0.5 M蔗糖+10%甘油；保存：−80°C
2.5 CRISPR/Cas9质粒电转化
质粒转化参考前期研究并略作修改。转化前，将40 µL各电感受态菌株与3 µL cas9_pNZ8148和3 µL sgRNA_P8-pMG36e混合，冰上放置至少10 min。将各悬浮液转移至冰预冷的电转杯（2 mm电极间距）中，在Bio-Rad Xcell Gene Pulser（Bio-Rad，Hercules，CA，美国）中以2.3 kV、25 µF和200 Ω施加单次电脉冲。乳酸乳球菌ATCC 11454细胞随即稀释于960 µL含20 mM MgCl2和2 mM CaCl2的冰预冷SGM17培养基中，30°C孵育。孵育4 h后，取200 µL悬浮液涂布于指定琼脂平板（无抗生素M17琼脂、含10 µg/mL氯霉素的M17琼脂、含5 µg/mL红霉素的M17琼脂、含两种抗生素的M17琼脂），以评估转化是否成功。平板在30°C培养24–48 h。副干酪乳杆菌K2003、植物乳杆菌Y1002、鼠李糖乳杆菌MK2003和粪肠球菌GM1003的电转化遵循类似方案，仅作以下修改：（i）使用MRS肉汤和琼脂替代M17肉汤和琼脂；（ii）37°C培养24 h。在相应平板（红霉素和氯霉素抗性）上生长的转化子被挑取，甘油保存，并进行ldh敲除验证。单CRISPR质粒（cas9_pNZ8148和sgRNA_P8-pMG36e）也分别单独转化入电感受态菌株，作为阴性对照。
【数据】电转化参数：2.3 kV，25 µF，200 Ω；电极间距：2 mm；复苏培养基：SGM17+20 mM MgCl2+2 mM CaCl2；筛选：氯霉素10 µg/mL+红霉素5 µg/mL；培养：30°C 24–48 h / 37°C 24 h
2.6 ldh基因敲除验证
CRISPR/Cas9介导的ldh敲除通过PCR扩增ldh基因进行基因型验证，使用引物ldhF（5‘-CGG TGC TGT AGG TTC ATC ATA CGC T-3’）和ldhR（5‘-GCA GTC GCT TAC CCC ATA TTG TCC A-3’），预期序列长度为766 bp。基因组DNA使用HigherPurity™细菌基因组DNA提取试剂盒（Canvax，西班牙）按照革兰氏阳性菌操作手册提取。PCR使用GoTaq® Green Master Mix（Promega，美国）进行，退火温度为56°C。每25 µL反应体系含12.5 µL GoTaq® Green Master Mix、2.5 µL正向和反向引物（各10 µM）、2.0 µL DNA模板和5.5 µL无核酸酶水。预期扩增产物（766 bp）使用ExoSAP-IT™ PCR产物纯化试剂（Thermo Fisher Scientific，美国）纯化，随后进行Sanger测序（Gene Wiz基因组测序，广州，中国）。使用Clustal Omega（Benchling）对野生型和突变型乳酸菌进行多序列比对，以比较和验证修饰。验证进一步通过表型分析确认——比较各乳酸菌野生型与突变体生长培养基中pH的变化。过夜培养物…
【数据】引物：ldhF/ldhR；预期片段：766 bp；退火温度：56°C；PCR体系：12.5 µL Master Mix+2.5 µL正向引物+2.5 µL反向引物+2.0 µL DNA模板+5.5 µL无核酸酶水
研究结果
3.1 重组质粒的构建与转化
图1（B和C）展示了利用双质粒CRISPR/Cas9系统修饰靶基因的策略。在前期研究中，CRISPR/Cas9系统通常以单质粒形式将cas9基因和sgRNA导入细胞。Xu等人（2018）观察到，在标准分子克隆流程中，双质粒系统获得阳性转化子的成功率显著更高，通常可产生数百个菌落，而单质粒方法仅产生数个菌落。此外，双质粒系统的构建更简单，对宿主的负担更小，因为所用两个质粒的尺寸较小。单质粒系统的载体在分子克隆过程中表现出不稳定性。为避免这种不稳定性，本研究将cas9基因和sgRNA分别在组成型启动子控制下于两个独立质粒上表达。将sgRNA和Cas9分离到不同质粒上更为方便，因为sgRNA序列可以在P8-pMG36e骨架上轻松互换。这在需要更换不同sgRNA序列以靶向多个基因时尤为有利，无需干扰Cas9质粒。Schmid-Burgk（2017）报道，CRISPR/Cas9相对于其他基因组编辑技术的快速优势可归因于其简单且经济高效的基因重靶向方法——仅需修改sgRNA的20个核苷酸序列部分，无需像其他系统那样进行蛋白质工程改造。
一个有效的sgRNA候选序列应能高效地将Cas9核酸内切酶引导至靶位点引入双链断裂，同时表现出最小的脱靶活性。Benchling软件生成了92个具有特定切割位置和前间隔序列邻近基序（PAM）的sgRNA列表。选择位于ldh基因完整CDS 631–650位点的一个引导序列（5‘-GCATACATCATGGGTGAACA-3’），其PAM序列为CGG（图1A中下划线标注），可被Cas9核酸酶识别并使相邻序列不稳定，从而产生RNA-DNA配对。选定的sgRNA特异性（脱靶）评分为99.33%，效率（靶向）评分为65.74%。
ldh基因敲除通过将重组质粒cas9_pNZ8148和sgRNA_P8-pMG36e共转化入表1所列乳酸菌的感受态细胞中实现。革兰氏阳性菌细胞壁的结构和组成是影响转化效率的关键因素之一。因此，为提高电穿孔效率，电感受态细胞通过在含甘氨酸（一种细胞壁弱化剂）的培养基中培养野生型菌株来制备。首次尝试同时转化两个CRISPR质粒时，副干酪乳杆菌K2003、植物乳杆菌Y1002和粪肠球菌GM1003的感受态细胞在2.3 kV下成功完成了共转化，时间常数为4.7–5.0 ms。然而，乳酸乳球菌ATCC 11454和鼠李糖乳杆菌MK2003的共转化未获成功——cas9表达质粒只能转化入已含有sgRNA质粒载体的乳酸乳球菌和鼠李糖乳杆菌感受态细胞中。这可能是由于同时转化两种不同质粒时，摄取位点、聚合酶分子或膜附着位点有限所致。约20、5、42、1和20个工程菌株菌落——分别对应乳酸乳球菌ATCC 11454、副干酪乳杆菌K2003、植物乳杆菌Y1002、鼠李糖乳杆菌MK2003和粪肠球菌GM1003——成功转化并能在含两种抗生素（氯霉素和红霉素）的平板上生长。经三轮传代后，所有转化子在含两种抗生素的MRS琼脂平板上均生长良好。从各转化子平板挑取单菌落进行基因敲除验证。
【数据】sgRNA特异性评分：99.33%；效率评分：65.74%；共转化时间常数：4.7–5.0 ms；转化子菌落数：20（L. lactis）、5（L. paracasei）、42（L. plantarum）、1（L. rhamnosus）、20（E. faecalis）
3.2 ldh敲除验证
使用位于切割位点上游/下游的ldhF和ldhR引物对ldh∆菌株进行PCR扩增，以验证ldh敲除，并与野生型菌株的相同位点进行比较。对生成片段的测序结果显示已获得预期突变。这表明同一物种不同菌株的DNA修复结果是非随机的。此外，DNA修复结果是独特的，因为每种乳酸菌都具有特征性的DNA修复谱。未观察到任何移码突变，仅观察到单碱基或多碱基的插入缺失（结果未显示）。不过，CRISPR/Cas9诱导的这种非随机突变此前已有报道。易错的DNA双链断裂（DSB）修复必然涉及少数核苷酸错误的引入，导致插入缺失突变，这与前期研究一致。因此，DSB修复机制可能在我们突变筛选观察到的独特突变模式中发挥了重要作用。
ldh基因敲除进一步通过测量发酵培养基的pH进行表型确认。图2显示，sgRNA/cas9复合物在ldh中诱导了突变，因为ldh∆菌株的pH变化可忽略不计（范围5.8–6.0），与MRS肉汤初始pH（6.2）相比差异不显著，而野生型菌株的pH变化显著。这使得ldh的破坏得以方便地检测和验证。经48 h发酵后，野生型和工程菌株的pH分别为：乳酸乳球菌ATCC 11454为4.6和6.05，副干酪乳杆菌K2003为3.65和5.88，植物乳杆菌Y1002为4.15和5.86，鼠李糖乳杆菌MK2003为4.16和5.9，粪肠球菌GM1003为3.9和5.86。这与通过在ldh内插入氨苄青霉素基因（amp）破坏乳酸乳球菌ATCC 11454中ldh的研究结果一致。仅含cas9_pNZ8148或sgRNA_P8-pMG36e单一质粒的转化子培养基pH与野生型菌株大致相同。这表明单一质粒递送不能影响基因组，并证明cas9靶向活性依赖于合适sgRNA的存在。
此外，由于所有∆ldh菌株的培养基pH与初始值相比变化可忽略不计，排除了酸性机制对指示菌抑制的贡献，证明抗菌活性来自BLIS和其他抗菌代谢产物。突变菌株中pH的轻微下降可能是由于ldh∆菌株仍产生少量乳酸，这与先前关于乳酸乳球菌乳酸脱氢酶活性调节的观察结果相似。该研究报道，ldh破坏菌株表现出非常低的乳酸脱氢酶活性（低于1%），并产生多种酸性产物，其中乙酸盐、甲酸盐和乙醇为主要产物，另有少量乙偶姻和乳酸。另一项研究报道，乳酸的产生可能归因于苹果酸乳酸酶的活性，该酶通过苹果酸催化草酰乙酸转化为乳酸。相应基因（ldh）的破坏导致丙酮酸转向低产量混合酸产物。这得到了ldh∆菌株表型的支持——它们表现为大的白色菌落，表明是轻微混合酸发酵菌株。此外，在乳酸菌中还鉴定出其他与ldh同源的基因，如羟基异己酸脱氢酶。该酶催化乳酸…
【数据】ldh∆菌株pH范围：5.8–6.0；MRS初始pH：6.2；48 h后WT与突变株pH：4.6/6.05（L. lactis）、3.65/5.88（L. paracasei）、4.15/5.86（L. plantarum）、4.16/5.9（L. rhamnosus）、3.9/5.86（E. faecalis）；LDH活性：低于1%
讨论与解读
CRISPR/Cas9系统已证明其作为高度通用和精确的基因组编辑工具的价值，也是菌株改良的一种简单、安全且有前景的方法。本研究有效利用CRISPR/Cas9方法在选定乳酸菌中敲除ldh。所构建的工程菌株具有新颖性，与野生型菌株相比，在抑制食源性病原体生长方面表现出更强的效果。最显著的变化体现在粪肠球菌GM1003的ldh∆菌株——其对所有食源性病原体均表现出强抑制活性，而野生型菌株对任何指示菌均无抗菌活性。尽管由于缺乏可用的抗生素和载体，CRISPR/Cas9辅助的重组工程在乳酸菌中的应用受限，但本研究构建了双质粒CRISPR/Cas9系统来驱动Cas9和sgRNA的表达。这一新的双质粒系统将为代谢工程技术修饰靶基因或代谢途径提供替代方案。本研究为促进新抗菌活性化合物的发现或提高现有化合物（包括BLIS）的产量提供了有价值的平台。研究结果表明，这些乳酸菌菌株具有进一步开发（基因修饰和发酵优化）的潜力。
编译者解读
本研究在合成生物学应用层面的核心价值在于：通过代谢重定向策略——敲除ldh基因阻断乳酸合成路径——将碳通量引导至抗菌化合物（BLIS）的生产，实现了“一石二鸟”的效果：既减少了酸性代谢物对靶菌的干扰，又提升了目标抗菌物质的产量。双质粒系统相较于单质粒在构建灵活性和转化效率上具有显著优势，sgRNA可互换的设计也为后续多基因编辑提供了便利。值得注意的是，不同乳酸菌对共转化的响应差异较大（鼠李糖乳杆菌仅获1个菌落），提示该系统的菌株适应性仍有优化空间。未来若能在启动子选择、电转化参数等方面进一步菌株个性化优化，该系统有望成为乳酸菌代谢工程改造的通用平台。
参考来源
Haryani, Y. (2024). Efficient metabolic pathway modification in various strains of lactic acid bacteria using CRISPR/Cas9 system for elevated synthesis of antimicrobial compounds. Journal of Biotechnology. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2024.09.002
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2024.09.002