来源：Dual enhancement of mycoprotein nutrition and sustainability via CRISPR-mediated metabolic engineering of Fusarium venenatum（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space
导读
真菌蛋白（Mycoprotein, MP）是应对全球蛋白质短缺的可持续方案之一。本研究利用CRISPR/Cas9介导的无痕基因敲除技术，同时靶向轮枝镰孢菌（Fusarium venenatum）的几丁质合酶与丙酮酸脱羧酶基因，获得工程菌株FCPD。该菌株在必需氨基酸指数上提升32.9%，底物消耗降低44.3%，MP生产效率提高88.4%。全生命周期评估显示，FCPD在六国生产情景下可使全球变暖潜势降低4–61.3%，环境表现优于细胞培养肉和鸡肉。
研究背景
全球蛋白质生产体系面临严峻的可持续性挑战——畜牧业占用40%农业用地，贡献约14.5%的温室气体排放。来自轮枝镰孢菌的真菌蛋白已获美国、欧盟、澳大利亚等多国监管批准供人食用。基于糖的真菌蛋白相比传统动物蛋白，温室气体排放低约80%，土地使用减少超90%。然而，工业规模真菌蛋白生产的环境影响尚未充分表征，尤其在土地使用、发酵引起的水体富营养化及能源相关全球变暖潜势方面存在研究空白。
下一代蛋白质评估需整合营养生物利用度与加工效率。基于此，研究者提出利用CRISPR/Cas9基因敲除策略修饰真菌蛋白的细胞壁组分，以期同时改善营养释放与环境表现。
研究方法
工程菌株FCPD的构建
利用CRISPR/Cas9技术在野生型轮枝镰孢菌中无痕敲除几丁质合酶基因（FVRRES_06397）和丙酮酸脱羧酶基因（FVRRES_12865）。基因编辑表达载体和供体DNA片段的构建参照Tong等人方法并作部分修改。简述如下：使用CHOPCHOP在线工具（https://chopchop.cbu.uib.no/）设计靶向轮枝镰孢菌基因组目标基因的sgRNA靶位点。通过PCR扩增获得游离sgRNA片段。靶向这两个位点的Cas9表达载体pFC332质粒保存于本实验室。为获得供体DNA片段，以轮枝镰孢菌基因组为模板扩增Chs位点侧翼序列作为同源臂（HA），获得含同源臂的pUC57-Chs和pUC57-PDC质粒后，通过PCR扩增最终获得供体DNA。
CRISPR敲除操作参照Tong等人方法并作部分修改。简述如下：采用PEG介导的原生质体转化法敲除目标基因。过夜培养后，使用100 μg/ml潮霉素B筛选阳性转化子。经验证正确的转化子命名为FCPD。本研究所用全部质粒、引物、DNA及培养基的详细信息见补充信息在线文档S1。
【数据】筛选抗生素：潮霉素B（100 μg/ml）；靶基因：FVRRES_06397（Chs）、FVRRES_12865（PDC）；转化方法：PEG介导原生质体转化
工业规模连续发酵生产MP
全程使用ISM培养基，包括种子培养制备。简述如下：预培养在500 ml摇瓶中装入100 ml培养基进行，随后转入含500 L ISM培养基的1 m³发酵罐。当MP生物量达到15 g/L湿重后，种子培养物转入含3000 L培养基的5 m³发酵罐，开始为期7天的连续发酵，期间通过每小时输入15%和输出15%（v/v）的操作维持菌株稳定生长。
轮枝镰孢菌干菌丝体的总蛋白含量（%）采用凯氏定氮法测定，蛋白系数为6.25。葡萄糖-蛋白转化率按以下公式计算：
葡萄糖-蛋白转化率 = 生物量 × 蛋白含量 / 葡萄糖消耗量
其中生物量指MP产品干重（kg），葡萄糖消耗量指底物葡萄糖使用量（kg）。
【数据】培养基：ISM；种子罐：1 m³（500 L培养基）；生产罐：5 m³（3000 L培养基）；接种生物量：15 g/L湿重；发酵时间：7天；输入/输出速率：15%/小时（v/v）；蛋白测定：凯氏定氮法（蛋白系数6.25）
转录组与代谢组分析
发酵结束收集并过滤样品后，采用液氮速冻保存菌丝体。数据采集与分析由GeneDenovo完成。简述如下：样品预处理后，分别进行RNA和代谢物检测，随后进入生物信息学分析流程。转录组分析中，RNA测序文库由GeneDenovo构建，在Illumina平台产生读段，筛选后比对至轮枝镰孢菌注释基因组。使用DESeq2/edgeR进行两两比较的差异表达分析。每个菌株分析三个独立生物学样本。代谢组分析中，显著差异代谢物根据VIP值和绝对log2倍数变化确定。每个菌株分析六个独立生物学样本。
【数据】转录组生物学重复：3个/菌株；代谢组生物学重复：6个/菌株；差异表达分析工具：DESeq2/edgeR；样品保存：液氮速冻
几丁质含量与总膳食纤维分析
细胞壁几丁质含量按先前描述的方法测定。MP样品在RNA去除步骤前后均测定几丁质含量。WT和FCPD-真菌蛋白的总膳食纤维按中国国家标准方法（GB 5009.88-2023）测定。总膳食纤维测定前，样品经RNA去除和冻干处理。
【数据】几丁质测定：RNA去除前后均测；总膳食纤维标准：GB 5009.88-2023；样品前处理：RNA去除+冻干
菌丝微观结构观察
使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察轮枝镰孢菌丝体微观结构。菌丝蛋白和细胞壁分别使用尼罗蓝和钙荧光白染色，激发波长分别为633 nm和405 nm，放大倍数为100×。
【数据】染色剂：尼罗蓝（蛋白）、钙荧光白（细胞壁）；激发波长：633 nm/405 nm；放大倍数：100×
MP氨基酸组成分析
WT-MP和FCPD-MP的氨基酸组成按先前描述的方法进行。酸水解蛋白样品的氨基酸组成使用HPLC测定。此外，单独进行5 M NaOH碱水解步骤以定量色氨酸含量。
【数据】酸水解+HPLC测定氨基酸；色氨酸测定：5 M NaOH碱水解；分析仪器：HPLC
MP霉菌毒素分析
精确称取1.00 g去除RNA并冻干的MP样品，用液氮研磨三次直至菌丝体完全破碎。将MP粉末重悬于适量溶剂A（含0.1%甲酸的80%乙腈溶液）中，12 000 rpm离心10 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤，适当稀释后进行霉菌毒素分析。三种代表性霉菌毒素（DON，脱氧雪腐镰刀菌烯醇；ZEN，玉米赤霉烯酮；PAT，棒曲霉素）通过UHPLC和三重四极杆质谱进行鉴定和定量。具体参数基于Zhang等人先前描述的方法。
【数据】样品量：1.00 g；离心：12 000 rpm，10 min；滤膜：0.22 μm；溶剂A：0.1%甲酸-80%乙腈；检测目标：DON、ZEN、PAT；仪器：UHPLC-三重四极杆质谱
动态体外胃肠消化
MP的体外胃肠消化按先前描述的方法并作少量修改进行。简述如下：MP样品（100 g）与50 g模拟唾液液（SSF）和30 g水混合，在37°C下孵育5 min，随后按预设参数（见补充信息在线表S8）进行模拟胃肠消化过程。消化产物的胃肠蛋白消化率、必需氨基酸评分（EAAS）、必需氨基酸指数（EAAI）和游离氨基酸（FAA）组成按先前操作方法进行计算和测定。
【数据】样品量：100 g；SSF：50 g；水：30 g；孵育：37°C，5 min；评价指标：蛋白消化率、EAAS、EAAI、FAA
LCA分析的目标与方法
采用从摇篮到大门（cradle-to-gate）的系统边界和预期性生命周期评估方法，评估MP工业化生产的环境效应。利用工业规模试验收集和估算数据。MP生产的环境评估使用SimaPro v.9.6.0.1软件和ecoinvent v.3.6数据库建模。采用ReCiPe 2016中点（H）方法计算全球变暖潜势（kg CO2-eq）、土地使用（m²a作物当量）、淡水富营养化（kg P-eq）、陆地酸化（kg SO2-eq）、陆地生态毒性（kg 1,4-DCB）、电离辐射（kBq Co-60-eq）、化石资源稀缺性（kg oil-eq）、臭氧形成（kg NOx-eq）和平流层臭氧消耗（kg CFC11-eq）。水资源稀缺性采用AWARE方法确定。由于产品的工业属性，还使用ecoinvent开发的CED v.1.01方法评估全生命周期工业能源使用。
为反映MP产品的环境影响，本研究的功能单位（FU）表示为：1 kg WT-MP产品（水分含量76.2%，蛋白含量59.8%）和1 kg FCPD-MP产品（水分含量73.0%，蛋白含量52.2%）（均以干生物量计）。该模型的从摇篮到大门系统边界始于原材料提取，经过MP生产和设施清洁，止于工厂大门。材料、设施建设、包装和孢子制备阶段不包括在LCA系统中。模型考虑了设施用地。
【数据】软件：SimaPro v.9.6.0.1；数据库：ecoinvent v.3.6；方法：ReCiPe 2016中点（H）+ AWARE + CED v.1.01；FU：1 kg WT-MP（含水76.2%，蛋白59.8%）/1 kg FCPD-MP（含水73.0%，蛋白52.2%）
MP生产系统描述
MP生产的第一步是在28°C下培养改良轮枝镰孢菌的真菌孢子。随后启动两阶段种子培养发酵程序。之后收获菌丝体并接种至5 m³生物反应器进行连续发酵。假设生产1 000 000 kg MP生物量需要三条生产线，每条生产线配备三个生物反应器（0.1、8和60 m³）。CIP程序大约需要93（WT-MP）和51（FCPD-MP）次清洗操作。
【数据】孢子培养温度：28°C；生产规模：1 000 000 kg MP生物量；生产线：3条×3个反应器（0.1、8、60 m³）；CIP次数：约93次（WT）/51次（FCPD）
研究结果
工程菌株的营养特性和工业发酵特征
丝状真菌细胞壁的主要结构组分是β-1,3-葡聚糖、β-1,6-葡聚糖和几丁质（图2A）。位于质膜上的几丁质合酶（Chs）产生几丁质——一种由β-(1,4)连接的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）组成的长链聚合物（图2B）。真菌细胞壁的坚固性可能限制细胞内营养物质（如MP）的生物可及性，从而可能损害其消化和吸收。值得注意的是，先前研究表明，轮枝镰孢菌中丙酮酸脱羧酶的敲除可能减少发酵过程中的CO₂排放并提高底物转化效率。为应对这些挑战，研究者采用CRISPR/Cas9基因编辑修饰轮枝镰孢菌的细胞壁完整性，旨在改善MP的消化特性。然而，敲除潜在的轮枝镰孢菌β-1,3-葡聚糖合酶基因（FVRRES_12803）未显示细胞壁β-葡聚糖含量的显著变化（数据未显示）。
经潮霉素B和RM培养基转化筛选后，通过同时敲除WT轮枝镰孢菌中的几丁质合酶（Chs）和丙酮酸脱羧酶（图2C），获得了菌株FCPD。FCPD基因组的PCR验证和测序结果确认两个靶基因均成功无痕敲除（补充信息在线图S1）。如图2D所示，在热处理（为降低RNA含量）前，FCPD的几丁质含量较WT菌株降低29%。但热处理后，大量细胞内容物释放，导致几丁质相对含量大幅增加。最终MP产品中FCPD的几丁质含量为20.78%。
蛋白含量和总膳食纤维含量数据呈现非常相似的现象（图2E和补充信息在线图S2）。未加热时，FCPD的蛋白含量比WT高17.13%；但热处理后，WT的蛋白含量上升至59.8%。一个可能的假说是WT细胞泄漏更多细胞内容物。
本研究采用体外动态消化系统，其操作参数见补充信息在线表S8。体外模拟胃肠消化显示，FCPD在必需氨基酸评分和EAAI方面均优于WT（图2F,G），尽管其总体蛋白消化率较低（图2H）。这一差异可能归因于敲除引起的菌丝体宏观特性改变所导致的消化动力学变化——WT和FCPD菌丝体产品在外观上存在明显差异（如图2M所示）。细胞壁的显微染色进一步证实了结构改变，与WT相比，FCPD菌株的亮点减弱、细胞壁更薄（图2N）。
在工业规模发酵过程中，WT和FCPD菌株的发酵液均呈现浓密的丝状团簇形态。FCPD菌株可能展现出更强的工业经济性——在同等生物量输出下，比WT菌株消耗约44%更少的底物葡萄糖，如图2I所示。该菌株的葡萄糖-to-蛋白转化率也显著提升，达到WT菌株的2.24倍（图2J），同时MP生产效率更高（提高88.4%，图2K）。
【数据】FCPD几丁质含量较WT降低：29%（热处理前）；最终产品几丁质含量：20.78%；未加热时FCPD蛋白含量较WT高：17.13%；热处理后WT蛋白含量：59.8%；底物葡萄糖消耗降低：约44%；葡萄糖-蛋白转化率：WT的2.24倍；MP生产效率提高：88.4%
整合转录组与代谢组分析
先前研究证明，轮枝镰孢菌中FvChs3（FVRRES_02330）敲除可增加总蛋白合成，且碳氮代谢相互关联并共调控。相比之下，本实验发现FCPD的几丁质和蛋白含量均下降。为研究Chs和丙酮酸脱羧酶基因敲除对轮枝镰孢菌基因表达和代谢物谱的影响，对WT和FCPD菌株进行了整合转录组和代谢组分析。在LC-MS检测中，采用正离子模式（POS）和负离子模式（NEG）以优化代谢物覆盖范围。
通过这些分析，共鉴定出1076个差异表达基因（DEGs）和478个差异表达代谢物（DEMs）（图3A–D）。这些DEGs和DEMs在六个共同的KEGG关键代谢通路中显著富集，即"代谢通路"、"牛磺酸和亚牛磺酸代谢"、"碳代谢"、"丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢"、"苯丙氨酸代谢"和"丁酸代谢"（图3E,F）。FCPD中糖酵解/糖异生通路显著下调，与碳氮代谢相关的基因也呈现下调（图3E）。由于葡萄糖代谢的主要过程是糖酵解，FCPD中观察到的葡萄糖消耗速率下降可能是糖酵解通路下调的结果。这些发现表明，Chs和丙酮酸脱羧酶基因的敲除主要影响多种氨基酸的生物合成，并通过TCA循环调节碳代谢。
与先前研究相似，轮枝镰孢菌中丙酮酸脱羧酶的缺失增强了糖异生通路，同时保留了来自丙酮酸的碳通量。然而，根据MP氨基酸组成分析，牛磺酸含量没有明显上升（补充信息在线表S6）。为鉴定与氨基酸和蛋白质生物合成或代谢最相关的通路，对FCPD-WT比较组中的差异代谢物进行了拓扑分析。利用相对介数中心性和超几何检验，鉴定了具有重要位置信息的通路。如图3G,H所示，在POS和NEG检测下，差异代谢物主要集中在多条与氨基酸代谢或生物合成相关的通路中，包括"精氨酸生物合成"、"丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢"和"苯丙氨酸代谢"。其他重要通路，如与TCA循环和糖异生通路相关的"氮代谢"和"泛酸和CoA生物合成"也被鉴定出来。
【数据】DEGs数量：1076；DEMs数量：478；显著富集KEGG通路：6条；检测模式：POS+NEG；主要富集通路：氨基酸代谢/生物合成相关
FCPD生产效率的工业规模验证及不同情景下的环境优势
鉴于FCPD通过提高生产率、大幅节省底物且菌丝体中无不良代谢物积累而提供增强的MP生产，研究者预期探究其在实际工业级生产中是否具有优越的生产性能和环境效益。WT和FCPD菌株均在江西富祥生物技术有限公司的工业规模发酵中进行了检验。此外，根据各国能源结构的差异选择了八种生产情景，以确定FCPD是否具有普遍的环境友好性。MP生产的CIP输入需求列于补充信息在线表S9。
在工业生产条件下，必须检测最终产品的霉菌毒素水平以确保没有食品安全问题。对两种热处理WT-MP和FCPD-MP产品进行了微水平检测。如补充信息在线表S7所示，两种MP产品中均未检测到三种常见霉菌毒素（DON、ZEN、PAT）。这可能归因于营养物质的过量添加，防止了潜在产毒菌的生长。
【数据】霉菌毒素检测：DON/ZEN/PAT均未检出；工业验证地点：江西富祥生物技术有限公司；生产情景数：8种
讨论与解读
CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛用于创制具有理想性状的生物体（如植物、牲畜、海产品、益生菌）。对于真菌蛋白这一有前景的替代蛋白来源，营养质量被视为需要特别关注的关键特性之一。为达成2030年联合国可持续发展目标（SDGs），可持续蛋白生产实践正被积极探索。本研究以轮枝镰孢菌为操作模型，证明通过CRISPR介导的代谢工程可实现双重目标：同时增强真菌蛋白的营养特性和环境表现，从而强化商业可行性和可持续性。
基于蛋白含量、葡萄糖转化率和MP生产效率等关键指标（图2），FCPD菌株作为WT菌株的优化变体，是更具可行性的工业规模生产候选菌株。此外，由于MP的工业生产主要通过底物葡萄糖的培养和加工影响环境，FCPD菌株通过减少底物消耗和提高生产效率，有望显著降低MP生产全生命周期的环境影响。
编译者解读：本研究巧妙地将"细胞壁修饰改善营养释放"与"代谢通量重定向提高底物效率"两个目标整合于同一菌株改造中，体现了合成生物学中多目标协同设计的思路。值得注意的是，FCPD在总蛋白消化率略降的情况下仍实现EAAI提升32.9%，提示"营养质量"的评价维度需要超越单一消化率指标。LCA与工业规模验证的结合使该研究从实验室走向实际应用评估，但八国情景仅考虑能源结构差异，未纳入原料供应链的区域异质性，这可能是未来优化的方向。此外，几丁质含量降低29%对细胞壁完整性和发酵鲁棒性的长期影响仍需进一步考察。
参考来源
Wu X. Dual enhancement of mycoprotein nutrition and sustainability via CRISPR-mediated metabolic engineering of Fusarium venenatum. Trends in Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.tibtech.2025.09.016
DOI: 10.1016/j.tibtech.2025.09.016