来源：CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering for enhanced PUFA production in Schizochytrium limacinum（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space
导读
裂殖壶菌（Schizochytrium limacinum）是生产多不饱和脂肪酸（PUFA）的重要工业菌株，但遗传操作工具匮乏长期制约其代谢工程改造。本研究构建了基于农杆菌介导转化（ATMT）的乙酸钠筛选系统，使转化效率提升77.13%；开发了内源tRNAGly驱动的CRISPR/Cas9编辑系统，编辑效率达48.38%。通过代谢重构FAS途径实现EPA从头合成，并采用"推-拉-阻"策略强化PKS途径，最终工程菌株脂质含量达77.14%，DHA和PUFA占比分别提升至55.10%和70.47%。
研究背景
微生物发酵生产脂肪酸及其衍生物被视为替代传统石化基和动植物来源产品的绿色生物制造范式。代谢工程通过改造靶酶和调控基因表达，可重定向微生物代谢以增强脂质和PUFA合成。然而，非模式产油微生物的基因编辑方法及PUFA生物合成机制研究仍处于起步阶段。
Schizochytrium sp. 作为Labyrinthulomycetes纲的代表成员，已被美国FDA认证为GRAS（Generally Recognized as Safe）安全菌株，其发酵生产的DHA已实现商业化应用。尽管如此，野生型菌株的脂质生产能力仍有待提升，迫切需要开发高效的遗传操作工具以推进其代谢工程改造。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用菌株列于表S1。S. limacinum SR21及其突变株先通过固体培养基平板培养制备种子培养物，活化二代种子培养物后转接至发酵培养基。
固体培养基成分：葡萄糖30 g/L、酵母提取物8 g/L、海盐晶体20 g/L、琼脂粉20 g/L，pH调至6.5。二代种子活化培养基：葡萄糖30 g/L、酵母提取物8 g/L、海盐晶体20 g/L，pH调至6.5。发酵培养基：葡萄糖80 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 0.3 g/L、K₂SO₄ 1 g/L、KH₂PO₄ 0.1 g/L、MgSO₄·7H₂O 4 g/L、CaCl₂ 0.05 g/L，pH调至6.5。
农杆菌AGL-1所用YEB和IM培养基配方如下：YEB培养基含蔗糖5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L。IM培养基成分相同。针对农杆菌AGL-1的营养缺陷型探索，本研究替换了固体培养基的碳源，形成筛选培养基，其成分为：果糖或蔗糖或木糖或糖蜜或乙酸钠30 g/L、酵母提取物8 g/L、海盐晶体20 g/L、琼脂粉20 g/L，pH调至6.5。
【数据】固体培养基：葡萄糖30 g/L，pH 6.5；发酵培养基：葡萄糖80 g/L，pH 6.5；IM培养基：蔗糖5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物1 g/L；筛选培养基碳源：果糖/蔗糖/木糖/糖蜜/乙酸钠各30 g/L
2.2 抗生素敏感性试验
S. limacinum SR21种子培养物在摇瓶中培养至OD₆₀₀为0.6。取100 μL种子培养物涂布于含不同浓度G418（0–250 mg/L）的种子培养基上，28°C培养至少7天以评估其对Geneticin的耐受性。同时，在含不同浓度Zeocin（0–250 mg/L）、Hygromycin B（0–250 mg/L）、Sulfometuron methyl（0–1000 mg/L）、Glufosinate-ammonium（0–1000 mg/L）和Paromomycin（0–1000 mg/L）的固体培养基上测试SR21的耐受性。
对于AGL-1，将种子培养物涂布于含不同浓度Cefotaxime sodium（0–300 mg/L）、Carbenicillin（0–300 mg/L）和Kanamycin（0–300 mg/L）的YEB培养基上，28°C培养至少7天以评估其抗生素耐受性。
【数据】G418浓度：0–250 mg/L；Zeocin：0–250 mg/L；Hygromycin B：0–250 mg/L；Sulfometuron methyl：0–1000 mg/L；Glufosinate-ammonium：0–1000 mg/L；Paromomycin：0–1000 mg/L；培养温度：28°C；培养时间：≥7天
2.3 ATMT系统的构建与优化
#### 2.3.1 表达载体构建
本研究所用质粒列于表S2，所有质粒均在Escherichia coli DH5α中构建。来源于Streptococcus pyogenes的Cas9蛋白、绿色荧光蛋白（GFP）、β-葡萄糖醛酸酶（GUS）和红色荧光蛋白（DsRed）的密码子优化基因由Azenta Life Sciences（中国苏州）合成。本研究所用引物汇总于表S3。
构建pC322-GUS载体时，首先组装含Geneticin表达盒的pC322质粒。PE、Geneticin和CYC片段分别以引物对PE-F/PE-R、G418-F/G418-R和CYC-F1/CYC-R1从S. limacinum SR21基因组DNA和质粒pFC332扩增获得。这些片段融合后连接到pCambia载体中。随后用限制性内切酶SmaI（Thermo Scientific）酶切载体产生缺口。最后，PA、GUS和CYC片段分别以引物对PA-F/PA-R、GUS-F/GUS-R和CYC-F2/CYC-R2从SR21基因组DNA和含GUS片段的合成质粒扩增，连接至pC322质粒。
构建pC322-GFP和pC322-DsRed载体时，先用限制性内切酶ApaI（Thermo Scientific）酶切pC322-GUS质粒产生缺口。GFP和DsRed片段分别以引物对GFP-F/GFP-R和DsRed-F/DsRed-R扩增，连接至线性化的pC322-GUS质粒。
【数据】限制性内切酶：SmaI、ApaI（Thermo Scientific）；宿主菌：E. coli DH5α；基因合成：Azenta Life Sciences（苏州）
#### 2.3.2 ATMT系统的建立与优化
对于S. limacinum SR21，细胞先在种子培养基中过夜培养，再接种至新鲜种子培养基至对数生长期。细胞通过离心收集（4°C，4000 g，5 min），重悬于1 × BSS溶液（10 mM KCl、10 mM NaCl和3 mM CaCl₂）。第二次离心（4°C，4000 g，5 min）去上清后，用蔗糖溶液（50 mM）重悬。再次离心（4°C，4000 g，5 min）保留沉淀。此步骤重复三次。最终，浓缩的SR21细胞重悬于0.2 mL蔗糖溶液（50 mM）用于ATMT操作。
对于AGL-1，含pC322质粒的菌株在含适宜抗生素的YEB培养基中培养（28°C，72 h）至OD₆₀₀达0.8–1.2。离心收集（4°C，4000 g，5 min）后，重悬于诱导培养基（含200 μM乙酰丁香酮和50 μg/mL卡那霉素）至OD₆₀₀为0.3–0.4。随后在振荡培养箱中（28°C，6 h）诱导virulence。
转化时，SR21细胞与AGL-1在IM培养基中共培养48 h，然后接种至选择性培养基，28°C继续培养72 h。
【数据】离心条件：4°C，4000 g，5 min；BSS溶液：10 mM KCl、10 mM NaCl、3 mM CaCl₂；蔗糖溶液：50 mM；诱导培养基：200 μM乙酰丁香酮、50 μg/mL卡那霉素；共培养时间：48 h；筛选培养：28°C，72 h
2.4 CRISPR/Cas9表达系统的构建
#### 2.4.1 基于基因组序列的内源tRNA分析
使用tRNAscan-SE分析S. limacinum SR21基因组中的tRNA序列。基因组信息来自作者前期研究[27]。选择一个内源tRNAGly及其300 bp上游序列作为RNA Pol III启动子，驱动CRISPR/Cas9系统中gRNA的表达。
#### 2.4.2 tRNA-gRNA的构建与验证
构建敲除质粒时，先用限制性内切酶ApaI（Thermo Scientific）酶切pC322-GFP质粒获得骨架。随后以引物对Cas-F/Cas-R扩增密码子优化的Cas9基因。扩增片段融合并连接至线性化的pC322-GFP质粒，构建pCB322。
针对CRTI基因的敲除质粒，先用限制性内切酶BcuI（Thermo Scientific）酶切pCB322。tRNAGly及其300 bp上游序列以引物tRNA-F/CRTI-N20-1R从SR21基因组扩增，sgRNA scaffold序列以引物CRTI-N20-1F/tRNA-R从质粒pFC332扩增。这些片段融合后插入酶切后的pCB322，生成pCB322-ΔCRTI-1。其他敲除质粒通过PCR从pCB322-ΔCRTI-1衍生获得。gRNA的选择和供体模板的构建按照作者前期研究进行。N20序列使用生物信息学工具sgRNACas9[28]设计。
为验证tRNA-gRNA的功能，将最终质粒pCB322-ΔCRTI-1转化至S. limacinum SR21。通过观察转化子的颜色变化评估tRNA-gRNA的效率。编辑效率通过从初始筛选平板随机挑选转化子、传代五代、计算白色表型菌落比例来量化。
【数据】限制性内切酶：ApaI、BcuI（Thermo Scientific）；tRNAGly上游序列：300 bp；传代数：5代；N20设计工具：sgRNACas9
#### 2.4.3 基因编辑转化子的验证
为实现靶位点基因编辑，通过ATMT方法将特异性敲除质粒导入S. limacinum SR21。在选择性培养基上挑取单菌落，传代并观察表型变化。分析编辑菌落的突变类型时，对敲除靶区域进行PCR扩增，产物经Sanger测序分析。
2.5 基因敲除与过表达
针对PEX10的破坏盒（disruption cassette）构建如下：以引物对PEX10-F1/PEX10-R1从SR21基因组扩增PEX10基因的上游同源臂，以引物对PEX10-F2/PEX10-R2扩增下游同源臂。Zeocin抗性基因片段以引物对Zeocin-F/Zeocin-R从pPICZαA质粒扩增。三个片段通过融合PCR组装，形成PEX10破坏盒，随后通过ATMT导入SR21。ACC1和DGAT的过表达载体构建方法类似：以相应引物从SR21基因组扩增ACC1和DGAT的编码序列，插入pCB322载体中由组成型启动子驱动表达。
【数据】PEX10破坏盒：上下游同源臂+Zeocin抗性基因；ACC1/DGAT过表达载体：pCB322骨架
研究结果
3.1 抗生素敏感性试验
研究首先旨在确定适合S. limacinum SR21基因改造的抗生素。结果显示，即使在培养7天后，100 mg/L G418完全抑制了SR21的生长（图S1-A）。因此，G418被选为候选抗性标记，最适浓度为100 mg/L。然而，后续实验显示SR21能在含高达250 mg/L Hygromycin B或1000 mg/L Glufosinate-ammonium的平板上生长（图S1-C和图S1-E）。相比之下，Zeocin和Sulfometuron methyl显著抑制细胞生长（图S1-B、图S1-D和图S1-F）。因此，Zeocin（50 mg/L）和Sulfometuron methyl（500 mg/L）被确定为潜在抗生素候选物。总体而言，SR21对多种抗生素表现出低抗性，提示其可能是理想的基因改造宿主。
接下来评估了AGL-1的抗生素敏感性。图S2所示结果表明，即使在培养7天后，Cefotaxime sodium和Kanamycin完全抑制了AGL-1的生长。因此，Cefotaxime sodium和Kanamycin被选为抗性标记，最适浓度为50 mg/L。
【数据】G418完全抑制浓度：100 mg/L；Hygromycin B耐受浓度：250 mg/L；Glufosinate-ammonium耐受浓度：1000 mg/L；Zeocin选择浓度：50 mg/L；Sulfometuron methyl选择浓度：500 mg/L；AGL-1抗生素选择浓度：50 mg/L；培养时间：7天
3.2 ATMT系统的建立与优化
#### 3.2.1 ATMT系统的初步建立
已有研究表明，乙酰丁香酮的添加可诱导virulence基因表达，从而启动T-DNA向受体基因组的转移和整合[34,35]。前期研究显示，将携带G418抗性基因表达盒的农杆菌与Schizochytrium sp. HX-308共培养，在选择培养基中培养5天后成功将外源基因导入该菌株并获得阳性转化子[36]。
按照既有方法[37]，本研究对S. limacinum SR21进行了遗传转化。显微观察显示，GUS染色的菌落呈圆形、凸起、光滑、边缘整齐，与农杆菌的形态特征（短杆状，宽0.5–1 μm、长1–3 μm；具有一根或多根鞭毛；在富营养琼脂平板上形成白色、凹陷、黏液状菌落）明显不同。基于这些形态差异，观察到的菌落被初步鉴定为重组S. limacinum SR21。
为进一步确认转化成功，选取8个单菌落进行分子验证。PCR分析显示在2000–3000 bp之间出现清晰明亮的条带，确认了转基因的存在。由此，利用ATMT结合GUS染色初步建立了SR21的遗传转化系统。
然而值得注意的是，本研究中以携带pC322的AGL-1作为供体菌株转化SR21，获得的阳性转化子少于7个。这一结果与此前在其他裂殖壶菌物种中的ATMT结果形成鲜明对比。有趣的是，显微观察显示，即使经过连续多轮筛选，GUS染色转化子中仍存在大量AGL-1细胞。推测以下因素可能导致这一现象：由于空间效应和转化模式（农杆菌常附着于宿主细胞，形成缠绕自身和宿主细胞的聚集体），在固体选择性培养基中，底部堆积的菌落可能阻碍了目标转化子与抗生素的接触。因此，即使经过多轮筛选，部分AGL-1细胞仍可能逃逸选择性培养基，导致阳性转化子比例偏低。虽然将Cefotaxime sodium浓度提高至400 mg/L改善了这一趋势，但也延长了转化进程并降低了整体转化效率。因此，优化SR21的预处理和寻找更有效的农杆菌抑制剂将是提高转化效率的关键。
【数据】GUS染色菌落形态：圆形、凸起、光滑、边缘整齐；农杆菌形态：短杆状，宽0.5–1 μm、长1–3 μm；PCR条带：2000–3000 bp；阳性转化子数：<7个；Cefotaxime sodium提高至400 mg/L
#### 3.2.2 ATMT系统的优化与验证
农杆菌介导遗传转化的关键步骤是在农杆菌悬浮液中添加AS，激活Vir基因表达，从而驱动T-DNA从农杆菌细胞（遗传转化的"启动者"）向受体细胞（遗传转化的"接收者"）转移。在此过程中，受体细胞的生理状态决定性影响转化效率。近期研究表明，优化受体细胞的活力和数量可显著增强T-DNA转移效率，包括：（I）增强细胞代谢活性——预培养西瓜不定根外植体可提高细胞分裂能力[38]；（II）调节细胞密度——增加地衣中受体细胞数量可扩大有效转化界面[39]；（III）优化处理时机——在对数生长期共培养受体细胞可最大化T-DNA整合效率[40]。因此，增加活细胞数量可优化ATMT系统。
为优化基因转化系统，本研究探索了多种SR21预处理方法，旨在通过增加活细胞数量来提高转化效率。台盼蓝是细胞培养中最常用的区分活细胞和死细胞的染料之一。具有完整膜结构的活细胞能排斥台盼蓝而不被染色，而膜受损的死细胞具有通透性，允许台盼蓝进入并将细胞染成蓝色。因此，台盼蓝染色提供了一种简单快速区分活细胞和死细胞的方法。
本研究首次比较了三种不同的预处理方法：（I）水处理（方法1）；（II）1 × BSS溶液和蔗糖溶液处理（方法2）；（III）纤维素酶和蜗牛酶处理（方法3）。结果如图S3所示，方法2显著更有效。与水处理和纤维素酶预处理相比，方法2处理后的活细胞数量明显更高，表明其预处理效率更优。这些发现为进一步优化ATMT系统提供了基础。
为减轻高浓度Cefotaxime sodium可能带来的抗生素污染风险，本研究探索了基于营养缺陷的替代筛选策略。研究中替换了固体培养基的碳源，具体而言，以果糖、蔗糖、木糖、糖蜜和乙酸钠（各30 g/L）作为替代碳源，替换初始筛选培养基中的葡萄糖（30 g/L）。结果如图S4-A所示。AGL-1在含果糖或蔗糖的培养基上生长旺盛，而在以木糖、糖蜜或乙酸钠为碳源时生长完全被抑制。考虑到观察便利性和SR21的生长特性，选择乙酸钠作为筛选培养基的碳源进行进一步验证。
为进一步优化筛选培养基中乙酸钠的浓度并验证其对SR21生长的影响，本研究在不同乙酸钠浓度下培养SR21和AGL-1（结果如图S4B-C所示）。结果表明，虽然AGL-1在较低乙酸钠浓度下可以存活，但在20 g/L及以上浓度时其生长被完全抑制。
【数据】三种预处理方法：水处理、1×BSS+蔗糖处理、纤维素酶+蜗牛酶处理；替代碳源：果糖/蔗糖/木糖/糖蜜/乙酸钠各30 g/L；乙酸钠完全抑制AGL-1浓度：≥20 g/L
3.3 脂肪酸合成途径代谢重构
在成功建立遗传转化系统的基础上，本研究进一步将其应用于SR21的代谢工程改造。针对EPA合成，研究对SR21中不完整的脂肪酸合酶（FAS）途径进行了代谢重构，实现了源自FAS途径的EPA从头合成。图5展示了FAS途径代谢重构过程。典型FAS途径的代谢过程如图5A所示，相关转化子在FAS途径代谢重构过程中的发酵结果如图5B所示，转化子的气相色谱检测结果如图5C所示。
【数据】FAS途径代谢重构；EPA从头合成；气相色谱检测确认产物
3.4 "推-拉-阻"策略强化DHA合成
针对DHA合成，研究通过实施"推-拉-阻"代谢工程策略强化了SR21中的聚酮合酶（PKS）途径。图7展示了相关转化子的表征结果。序列比对结果如图7A所示。SR21-ΔPEX10的发酵结果如图7B所示，SR21-ΔPEX10-ACC1的发酵结果如图7C所示，SR21-ΔPEX10-DGAT的发酵结果如图7D所示，SR21-ΔPEX10-ACC1-DGAT的发酵结果如图7E所示。
与野生型菌株相比，工程菌株的脂质含量增加至77.14%，DHA和PUFA水平分别提升至55.10%和70.47%。
3.5 5 L生物反应器验证
在5 L生物反应器中比较了转化子与野生型的EPA含量。图6A为转化子在48 h的光学显微镜检查结果，图6B为野生型在48 h的光学显微镜检查结果。图6C比较了转化子与野生型的细胞干重（DCW），图6D比较了转化子与野生型的EPA含量。
【数据】5 L反应器；48 h；DCW和EPA含量对比详见原文图6
讨论与解读
本研究首次报道了tRNAGly介导的CRISPR/Cas9编辑系统，其中tRNA-gRNA被证明可有效敲除内源基因。借助这一遗传工具包，研究在SR21中成功实施了代谢"推-拉-阻"合成生物学策略。在生物量不变的条件下，转化子的总脂肪酸（TFA）积累能力提高至细胞干重的77.14%。此外，DPA、DHA和总PUFA的比例分别达到15.80%、55.10%和70.47%，为高纯度DHA生产提供了稳健的底盘菌株。
同时，本研究首次完成了SR21中FAS途径的代谢重构，实现了源自FAS途径的EPA从头生物合成。这是首次尝试通过PKS和FAS双途径生产PUFA。综上，本研究开发的遗传工具为裂殖壶菌的代谢工程提供了有效且实用的方法。SR21-ΔPEX10-ACC1-DGAT菌株有望通过进一步发酵优化实现高纯度DHA生产，而异源组装的FAS途径则促进了裂殖壶菌中EPA和DHA的共生产。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，本研究的核心价值在于为裂殖壶菌这一工业底盘补齐了遗传工具短板。tRNAGly启动子驱动gRNA的策略巧妙利用了内源RNA Pol III转录元件，避免了外源启动子在异源宿主中活性不足的常见问题。"推-拉-阻"策略的系统性思维——同时强化前体供应（推）、靶标合成（拉）、阻断竞争途径（阻）——为其他产油微生物的代谢工程提供了可复制的范式。FAS途径的异源组装实现EPA与DHA双途径共生产，是PUFA生物合成领域的重要概念突破。值得注意的是，5 L反应器规模的数据仍有限，放大生产的稳定性与成本效益尚需进一步验证。
参考来源
Duan Y. CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering for enhanced PUFA production in Schizochytrium limacinum. Chemical Engineering Journal, 2025. DOI: 10.1016/j.cej.2025.164320
DOI: 10.1016/j.cej.2025.164320