来源：Efficient tanshinone metabolic engineering in Salvia miltiorrhiza through modified multiplex CRISPR/Cas9 system（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space
导读
丹参作为治疗心脑血管疾病的传统中药，其脂溶性丹参酮类成分具有显著临床疗效。然而，全植株水平基因编辑效率低下长期制约丹参功能基因组学与代谢工程研究。本研究建立了由内源SmRPS5A启动子驱动的tRNA-gRNA多重敲除系统，在T0代植株中实现单靶点平均编辑效率>90%、双靶点>70%、三靶点>60%的超高效率，并成功通过敲除SmOPR3基因直接诱导雄性不育表型，验证了"推-拉-阻"代谢工程策略在药用植物中的可行性。
研究背景
丹参（Salvia miltiorrhiza）作为全球重要的药用植物，其根部富含的丹参酮类二萜化合物在心血管疾病治疗中展现出显著临床疗效。凭借基因组紧凑、生命周期短、次生代谢途径研究透彻等优势，丹参已成为药用植物研究的典范模型。尽管已建立遗传转化方法和基于CRISPR的基因编辑技术，但现有策略——如发根农杆菌介导的丹参毛状根编辑——突变率通常维持在70%以下，且毛状根缺乏完整植株结构，难以用于发育和组织代谢研究。为突破毛状根再生的局限，亟需开发高效的全植株水平多重基因编辑工具。
研究方法
5.1 植物材料与生长条件
本研究使用的丹参为紫花变种（S. miltiorrhiza var. miltiorrhiza）。组培苗培养于Murashige and Skoog（MS）培养基（PhytoTechnology Laboratory, Shawnee Mission, KS, USA）中，含3%蔗糖和0.5%琼脂，pH 5.6，在可控温室中于25°C、16小时光照/8小时黑暗循环条件下生长。
【数据】培养基：MS；蔗糖：3%；琼脂：0.5%；pH：5.6；温度：25°C；光周期：16h光照/8h黑暗
5.2 载体构建
采用编码萤火虫荧光素酶（fLuc）和纳米荧光素酶（nLuc）的双荧光素酶报告系统（pDuaLUC）进行体外验证。利用内源SmU6启动子设计了两条靶向Nanoluc基因的sgRNA序列（nLuc-sg1和nLuc-sg2）。这些sgRNA被整合到由五种不同启动子驱动的CRISPR/Cas9载体中，分别为：CaMV35S（35S，花椰菜花叶病毒）、来自番茄的SlEF1α pro（Solyc06g005060）、来自丹参基因组的SmEF1α pro（LOC130986776）、SmUBI pro（LOC131015365）和SmRPS5A pro（LOC130988804）（序列见支持信息表S1）。所有载体均以胭脂碱合成酶（Nos）终止子终止。为实现多重基因组编辑，研究通过tRNA-gRNA结构连接两个sgRNA靶点，利用内源tRNA加工机制实现精确编辑。该系统的效率在丹参植株中进行了评估。本研究所用引物见支持信息表S2。
【数据】报告系统：pDuaLUC（fLuc+nLuc）；sgRNA靶点：nLuc-sg1、nLuc-sg2；启动子：5种（35S、SlEF1α、SmEF1α、SmUBI、SmRPS5A）；终止子：Nos
5.3 丹参原生质体分离、转染与编辑效率评估
参照已有方法从丹参幼嫩叶片中分离并纯化原生质体。PEG介导的原生质体转化参照先前方法进行改良。原生质体与测试报告体和报告质粒以10:1比例（10 μg/1 μg）共转化，同时以pLUC和pMut-nLuc分别作为阴性和阳性对照。原生质体样品在黑暗中孵育16–24小时后收集至2 mL离心管中。使用Nano-Glo®Dual-Luciferase® Reporter Assay System（Promega）分析fLuc和NanoLuc活性。丹参原生质体编辑效率通过计算nLuc与fLuc比率的变化来量化。
【数据】共转化比例：10:1（10 μg/1 μg）；孵育时间：16–24h；检测系统：Nano-Glo®Dual-Luciferase®
5.4 重组蛋白表达与催化反应
将SmOPRs的开放阅读框（ORFs）PCR扩增后连接到限制性酶线性化的pGEX-4T-1表达载体中。所得重组质粒命名为pGEX-SmOPRs，编码N端谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签融合蛋白，转化至E. coli BL21(DE3)化学感受态细胞（TransGen Biotech, China）进行异源表达。细菌培养浓度、IPTG浓度、诱导温度和时间的条件均已优化。以9S,13S-OPDA（Cayman Chemical, USA, Item No. 88520, CAS No. 85551-10-6）作为酶活性测定底物。反应体系包含50 mM磷酸钾缓冲液、1 mM NADPH、100 ng 9S,13S-OPDA、120 μL纯化蛋白（1 mg/mL），用水补足至200 μL。反应在室温下孵育60分钟。随后，反应混合物用乙酸乙酯萃取五次，氮气吹干，重新溶解于甲醇中，通过UPLC-TQ-MS分析。
【数据】底物：9S,13S-OPDA（100 ng）；NADPH：1 mM；磷酸钾缓冲液：50 mM；纯化蛋白：120 μL（1 mg/mL）；反应体积：200 μL；温度：室温；时间：60min；萃取：乙酸乙酯×5次
5.5 植物转化
通过冻融法将构建体导入农杆菌菌株C58C1和GV3101。采用叶盘法通过农杆菌介导获得转基因毛状根和植株。植物转化和阳性植株筛选由顺风生物科技（海南）有限公司完成。
【数据】农杆菌菌株：C58C1、GV3101；转化方法：冻融法、叶盘法
5.6 突变检测
突变体基因组DNA进行Hi-TOM测序。使用位点特异性引物扩增靶向区域，随后进行条形码标记和双端150 bp测序。使用在线Hi-TOM平台（http://www.hi-tom.net/hi-tom/）分析突变频率。此外，还利用PCR和亚克隆Sanger测序进行编辑效率的统计分析。
【数据】测序平台：Hi-TOM；读长：双端150 bp
5.7 RNA-seq与数据分析
RNA-seq文库制备和双端测序均在Illumina HiSeq X平台（Novogene, Beijing, China）上完成。使用DEGseq R包鉴定差异表达基因（DEGs），筛选标准为|log2 FC|≥1且校正后q值≤0.005。分别使用GOseq R包和KOBAS软件进行DEGs的Gene Ontology（GO）和KEGG富集分析。热图基于三次生物学重复的平均FPKM值，使用Morpheus工具（https://software.broadinstitute.org/morpheus/）生成。RNA-seq数据已存入NCBI数据库，登录号为PRJNA1236866。JA和丹参酮生物合成基因见支持信息表S4。
【数据】DEGs筛选标准：|log2 FC|≥1，q≤0.005；生物学重复：3次；NCBI登录号：PRJNA1236866
5.8 定量分析（LC-QQQ-MS）
JA、OPDA和JA-Ile等茉莉酸类物质采用已建立的方法提取。50 mg研磨植物材料用异丙醇-水-盐酸溶液（2:1:0.002，V/V/V）提取30分钟，随后用二氯甲烷继续提取30分钟。有机层在氮气下蒸发，残留物溶于70%甲醇。内源JAs使用ACQUITY UPLC I-Class系统配6500 QTRAP质谱仪进行定量。流动相为乙腈（A）和0.05%甲酸-水（B），流速0.4 mL/min。梯度洗脱程序：0–3.5分钟，10% A；3.5–4分钟，10–95% A；4–8分钟，95% A。进样量1 μL，采用MRM分析模式。
【数据】提取溶剂：异丙醇-水-盐酸（2:1:0.002）；提取时间：30min×2；流速：0.4 mL/min；进样量：1 μL；检测方式：MRM
研究结果
2.1 SmOPR3作为JAs通量守门人
鉴于JA在次生代谢调控中的关键作用，研究靶向JA生物合成中的关键节点基因SmOPRs进行功能评估。由于MeJA处理可促进JA生物合成，研究分析了MeJA诱导的毛状根（图1A）。结果显示，SmOPR1/3的表达水平在MeJA处理后的不同时间点显著升高。组织特异性表达谱显示SmOPR1/2/3在各组织中普遍表达：SmOPR1在花冠和纤维根中优先表达，SmOPR2在地上组织（未成熟种子、花萼和叶片）中高表达，而SmOPR3在地上和地下组织中均维持组成型高表达水平（图1B），提示其在JA生物合成中不可或缺。结构建模揭示所有SmOPR蛋白均含有保守的Oxidored_FMN结构域。系统发育分析将SmOPR1和SmOPR2归入双子叶植物特异性亚家族I，而SmOPR3与亚家族II成员聚为一支——该亚家族被公认为催化9S,13S-OPDA的核心家族。序列比对发现三种异构体存在两个主要可变区（MVRI和MVII），但底物结合基序HGAN/H（His-Gly-Ala-Asn/His）在进化上高度保守，确保了还原多种OPDA构型所必需的催化架构。在优化GST融合OPRs异源表达并纯化后（图1C），体外酶活测定显示出不同的催化效率：SmOPR1未检测到9S,13S-OPDA转化活性，SmOPR2表现出有限的底物利用能力，而SmOPR3能将9S,13S-OPDA完全转化为9S,13S-OPC 8:0（图1D）。这些发现确立了SmOPR3作为JA生物合成的主要效应因子。
【数据】MeJA处理浓度：100 μM；毛状根苗龄：21天；SmOPR3催化底物：9S,13S-OPDA；产物：9S,13S-OPC 8:0；SmOPR1转化率：未检出；SmOPR2转化率：有限；SmOPR3转化率：完全转化
2.2 SmRPS5A pro驱动丹参原生质体高效CRISPR/Cas9编辑系统
Cas9表达水平是决定基因组编辑效率的关键因素，内源启动子在植物系统中进行精确遗传操作具有天然优势。为确定丹参CRISPR/Cas9编辑的最佳调控元件，研究系统比较了五种驱动Cas9在原生质体中表达的启动子变体：SlEF1α pro（番茄来源）和异源CaMV35S pro（35S pro），以及三个内源启动子SmEF1α pro、SmUBI pro和SmRPS5A pro。所有构建体均使用天然SmU6启动子表达sgRNA。启动子区域（起始密码子上游约2 kb）从番茄或丹参基因组DNA中PCR扩增，克隆至含Cas9的编辑载体中（图2A）。瞬时表达分析显示各启动子间编辑效率差异显著（图2B）。组成型SmUBI pro在两个位点的编辑效率分别为9.6%和30.5%，低于35S pro（41.7%和35.0%）和SlEF1α pro（69.8%和65.1%）。值得注意的是，内源SmEF1α pro优于其番茄同源基因（SlEF1α pro），编辑率达73.5%和69.5%。引人注目的是，SmRPS5A pro构建体展现出无与伦比的效率，在nLuc-sg1位点产生接近饱和的98.5%和90.7%编辑效率——与阳性对照Mut-nLuc相当（图2B）。这些发现凸显了SmRPS5A启动子在丹参中实现高效CRISPR/Cas9编辑的巨大潜力。
【数据】SmUBI pro编辑效率：9.6%、30.5%；35S pro：41.7%、35.0%；SlEF1α pro：69.8%、65.1%；SmEF1α pro：73.5%、69.5%；SmRPS5A pro：98.5%、90.7%
2.3 丹参高效多重基因组编辑系统的开发
植物中利用CRISPR-Cas系统进行多基因编辑需要同时表达多个Cas基因和sgRNAs以形成多转录元件系统。为简化该系统，研究利用RNA自切割工具和植物内源RNA加工机制，将多转录元件转化为双转录和单转录元件。为评估候选启动子的体内编辑性能和多基因编辑能力，研究构建了基于CRISPR/Cas9的靶向SmOPR3敲除系统，使用发根农杆菌菌株C58C1进行毛状根转化（图2C），采用tRNA（转移RNA）策略。通过SNP分析和全基因组脱靶位点扫描，研究鉴定了两条靶向SmOPR3主要可变区II（MVR II）的sgRNAs（SmOPR3-sg1和SmOPR3-sg2）（图2D）。这些sgRNAs与SmOPR1和SmOPR2存在显著核苷酸差异，确保了对SmOPR3的靶标特异性。启动子构建体转化分别获得64、64、64、64和62个毛状根系（对应SlEF1α pro、35S pro、SmEF1α pro、SmUBI pro和SmRPS5A pro载体）。Hi-TOM测序显示五种启动子均成功实现敲除事件（图2E），但效率差异显著，从20.3%到93.6%不等。与原生质体数据一致，观察到的模式凸显三个关键发现：（1）SmUBI pro和SlEF1α pro在SmOPR3-sg2位点活性极低（20.3%和49.2%），与其在SmOPR3-sg1位点的中等表现（87.5%和70.8%）形成对比；（2）35S pro和SmEF1α pro在SmOPR3-sg2位点实现中等效率（53.1%和62.5%），但在SmOPR3-sg1位点保持强劲编辑（92.2%和90.6%）；（3）SmRPS5A pro表现出卓越性能，实现96.3%和91.9%的编辑率，与原生质体数据一致。该系统性评估确立了SmRPS5A pro作为丹参多重基因组编辑最高效的内源启动子，其性能超过毛状根系统中常用启动子。
【数据】毛状根系数量：64/64/64/64/62（对应5种启动子）；SmOPR3-sg2编辑效率：SmUBI pro 20.3%、SlEF1α pro 49.2%、35S pro 53.1%、SmEF1α pro 62.5%、SmRPS5A pro 91.9%；SmOPR3-sg1编辑效率：SmUBI pro 87.5%、SlEF1α pro 70.8%、35S pro 92.2%、SmEF1α pro 90.6%、SmRPS5A pro 96.3%
2.4 基于优化编辑系统产生SmOPR3敲除株系
为评估优化后的多重CRISPR/Cas9系统在稳定转基因植株中的适用性，研究使用SmRPS5A pro驱动的构建体进行农杆菌GV3101介导的转化（图2C）。经筛选和培养后获得三个独立再生株系（命名为Smopr3–1至Smopr3–3）。PCR扩增和Sanger测序确认突变体在SmOPR3-sg1和SmOPR3-sg2两个靶位点均发生双等位编辑。Smopr3–1在各位点表现出杂合双等位突变，伴有非同义替换（图3A）；Smopr3–2表现为纯合双等位缺失，缺失跨度46 bp（覆盖两个sgRNA靶点）。两种突变类型均诱导移码突变，导致SmOPR3功能完全丧失。Smopr3–3株系则表现为一种杂合突变形式。表型特征分析显示，突变体与野生型在地上部形态上无可见差异。
【数据】突变株系：3个（Smopr3–1、Smopr3–2、Smopr3–3）；Smopr3–1突变类型：杂合双等位+非同义替换；Smopr3–2突变类型：纯合双等位46 bp缺失；Smopr3–3突变类型：杂合突变
2.5 SmOPR3缺失对JAs和丹参酮的影响
转录组和代谢通量分析显示，SmOPR3缺失破坏了JA信号传导，并使丹参酮水平降低16–66%。Smopr3突变体中JA生物合成、信号转导和丹参酮生物合成相关基因的表达水平发生显著变化（图4A）。OPDA积累量增加超过43倍，表明JA生物合成通量在OPDA节点受阻。
【数据】丹参酮降低幅度：16–66%；OPDA积累倍数：>43倍
2.6 SmCPS1和SmKSL1缺失对丹参酮的影响
CRISPR介导的核心途径基因（SmCPS1/SmKSL1）敲除完全阻断了丹参酮生物合成，并将香叶基香叶基二磷酸（GGPP）通量重定向至替代途径。图5A展示了基于PCR扩增Sanger测序的Smcps1和Smksl1 T0纯合突变体三个靶点的代表性编辑形式。
【数据】丹参酮生物合成：完全阻断；GGPP通量：重定向至替代途径
2.7 SmCPS3和SmCPS4缺失对丹参酮的影响
竞争分支基因（SmCPS3/SmCPS4）的双重敲除增强了丹参酮积累。图6A展示了SmCPS3/SmCPS4敲除载体构建及靶点编辑效率。图6B展示了基于PCR扩增Sanger测序的Smcps3和Smcps4 T0纯合突变体三个靶点的代表性编辑形式。竞争分支基因敲除后，更多代谢通量流向丹参酮生物合成途径。
【数据】丹参酮积累：增强（原文未给出具体倍数）
2.8 高效多重基因组编辑在种质创新、代谢调控和底盘开发中的应用
通过SmOPR3敲除获得的JA缺陷型光温敏雄性不育（PHGMS）株系表现出花药不开裂和花粉败育的表型，且可通过外源MeJA施用恢复育性（图7A）。该表型直接证明了JA在丹参生殖发育中的关键调控作用。
【数据】雄性不育表型：花药不开裂、花粉败育；恢复方式：外源MeJA
讨论与解读
本研究建立的tRNA-gRNA多重CRISPR系统由内源SmRPS5A pro驱动，在丹参中实现了前所未有的编辑效率，全面超越了此前报道的毛状根和原生质体再生方法。与单基因修饰或RNAi沉默不同，该多重编辑策略能够系统解析复杂代谢网络。传统毛状根系统中的表型筛选往往无法重现生殖性状，而本研究的全植株方法直接将遗传编辑与功能结果相关联——如T0植株中JA调控的雄性不育表型所示。未来，单基因或多基因的多重编辑将实现多维种质创新，包括缩短生长周期、诱导单倍体、增强抗逆性和提高药用组织产量等。JA信号在丹参中充当双重功能调节因子，协调环境胁迫响应与代谢通量控制。作为整合生物/非生物胁迫信号的中心枢纽，JA通过将代谢通量重定向至特化代谢物来协调防御优先级。在Smopr3突变体中，超过43倍的OPDA积累证实了通量受阻效应。
编译者解读：该研究最值得称道之处在于将"启动子筛选—多重编辑系统优化—代谢通量调控"形成完整闭环，SmRPS5A启动子近饱和的编辑效率为药用植物基因编辑树立了新标杆。通过"推-拉-阻"策略实现丹参酮代谢通量重定向，展示了合成生物学思维在药用植物次生代谢工程中的实际威力。JA信号在发育与代谢间的双重角色也为植物激素多效性提供了新证据。未来若能将此平台拓展至更多药用植物，有望加速高活性天然产物的异源生产与种质创新。
参考来源
期刊：Chemical Engineering Journal, 2025
DOI: 10.1016/j.cej.2025.168709
DOI: 10.1016/j.cej.2025.168709