来源：Genome-based optimization of psilocybin and N,N-dimethyltryptamine biosynthetic pathways in E. coli using CRISPR-associated transposases（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space
导读
质粒优化后的多基因代谢途径转移至基因组后常因转录环境差异而性能骤降。本研究开发了ePathIntegrate策略，利用CRISPR相关转座酶（CASTs）将裸盖菇素和N,N-二甲基色胺（DMT）合成途径整合至大肠杆菌基因组，并通过突变型T7启动子文库重新平衡途径表达。最终在补料分批生物反应器中实现1.88 g/L裸盖菇素和1.62 g/L DMT的产量，与质粒系统相当甚至更优。
研究背景
致幻剂化合物天然存在于真菌、植物和动物中，数千年来一直用于精神仪式。裸盖菇素（源自"神奇蘑菇"）和DMT（由多种植物产生，通常通过死藤水茶饮入）通过激活5-HT2A血清素受体引发致幻效应。尽管1970年《管制物质法》将其列为I类管制药物，但临床试验已积累证据表明这些化合物在治疗神经精神疾病方面具有潜力。
化学合成裸盖菇素成本高昂，每克纯品的估算成本超过2000美元。酶促途径的阐明使得微生物细胞工厂合成成为可行的替代方案。然而，稳定高水平的异源途径表达需要精确控制转录架构——在质粒上优化良好的转录结构转移到染色体后往往失效。这一"质粒到基因组"的性能落差成为代谢工程的核心瓶颈之一。本研究旨在通过基因组中心的途径工程策略解决这一问题。
研究方法
4.1 菌株、培养基组成与发酵条件
大肠杆菌DH5α用于质粒繁殖和克隆，BL21 star™ (DE3)作为所有化学物生产实验的宿主菌株。克隆过程中使用Luria Broth（LB）培养基。质粒转化采用化学感受态或电转感受态细胞制备的标准方案。需要质粒筛选时，向培养基中添加氨苄青霉素（80 μg/mL）和/或壮观霉素（50 μg/mL）。除另有说明外，所有生产实验（mCherry、DMT和裸盖菇素）均使用Andrew's Magic Media（AMM）。标准发酵条件为：从冷冻保存或LB-琼脂平板挑取单菌落接种过夜培养物；在37°C下培养约14小时，培养基添加物与后续实验一致。随后将过夜培养物以50:1的比例接种至新鲜培养基，培养4小时后用1 mM IPTG诱导。发酵在分析前继续培养48至72小时。
【数据】培养基：LB（克隆）/AMM（生产）；抗生素：氨苄青霉素80 μg/mL、壮观霉素50 μg/mL；温度：37°C；时间：过夜约14h、发酵48-72h；诱导剂：1 mM IPTG；接种比：50:1
4.2 pEffector载体构建
用于在特定基因组位置实现整合的CRISPR RNA（crRNA）序列选自先前已验证且无脱靶结合的序列。实验中使用的crRNA包括crRNA-1（结合于glmS）、crRNA-4（结合于lacZ）、crRNA-13（结合于tktB-ypfG）和crRNA-17（结合于yadD-panC）。设计带有悬突的正向和反向引物，使其在Type IIS限制性内切酶Eco31I（BsaI）消化后能够连接到pEffector质粒中。crRNA与pEffector的连接产物随后转化至DH5α细胞。通过菌落PCR筛选克隆，使用pEffector中Eco31I酶切位点上游约200-400 bp处的正向引物和crRNA插入片段内部的反向引物。菌落PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认连接成功，随后通过全质粒测序进行序列验证。本研究中使用的所有质粒和引物分别列于表S2和S4。
【数据】crRNA靶位点：glmS、lacZ、tktB-ypfG、yadD-panC；限制酶：Eco31I（BsaI）；PCR检测引物位置：Eco31I上游200-400 bp；测序方法：全质粒测序
4.3 pDonor载体构建与ePathIntegrate系统
pDonor DNA用XhoI和PstI限制性内切酶消化，以提取线性化的pDonor骨架DNA并去除占位的氯霉素抗性基因。设计引物扩增payload DNA，两端各含约25 bp同源臂用于Gibson组装至消化后的pDonor载体。payload DNA使用Accuzyme™聚合酶扩增。扩增后，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、切胶回收并纯化。随后使用pDonor DNA（经XhoI和PstI消化）和PCR扩增的payload DNA完成Gibson组装反应。所得反应产物转化至DH5α。克隆在含氨苄青霉素的LB平板上筛选，并通过限制性酶切消化和全质粒测序确认。用于扩增payload DNA的Gibson引物设计为捕获目的途径启动子区域上游和终止子区域下游的序列。该扩增子在同尾酶限制性酶切位点的位置上与ePathBrick和ePathOptimize载体特征一致，从而允许对多基因生物合成途径进行简便修饰或组装。由此，首个pDonor载体提供了基础骨架，通过限制性酶切位点可将ePathBrick或ePathOptimize载体上的任何基因或途径以新/修饰后的payload DNA形式亚克隆至pDonor中。这一对ePathBrick和ePathOptimize载体系统的扩展被称为ePathIntegrate。
【数据】限制酶：XhoI、PstI；同源臂长度：约25 bp；聚合酶：Accuzyme™；筛选标记：氨苄青霉素；载体系统：ePathBrick/ePathOptimize扩展
4.4 供体DNA的整合
在冰上，将50 ng pEffector和200-400 ng pDonor共转化至化学感受态BL21 Star™ (DE3)细胞，涂布于含氨苄青霉素和壮观霉素的LB平板（LB-Amp-Spect）上，37°C过夜培养。随后进行菌落PCR以检测payload DNA在pEffector定义位置的整合。每个菌落PCR反应中加入三条引物——结合于整合位点上游的正向引物、结合于整合位点下游的反向引物、以及结合于整合基因/途径内部的反向引物。未整合大肠杆菌菌株的检测使用正向和反向引物（分别结合于整合位点上下游）扩增约400 bp片段（图S1）。整合菌株的检测通过正向引物与结合于整合基因内部的反向引物扩增，产生约600 bp的扩增子（图S1）。需要注意的是，用于检测基因组位置的反向引物也能结合整合菌株，但该扩增子不会被观察到，因为PCR反应的短延伸时间不允许这种较长扩增完成。如果菌落同时显示400 bp和600 bp两条带，则视为非克隆，需在LB-Amp-Spect平板上连续传代，直到仅观察到单一600 bp条带。经菌落PCR确认整合成功的菌株随后通过在42°C、2 mL无抗生素LB培养基中培养以消除pDonor和pEffector质粒。这些细胞在不含抗生素的新鲜LB培养基中每天传代约一周。随后通过在抗生素选择性平板上划线筛选质粒丢失的菌株。经过4-6次传代后，取1 μL培养物用新鲜LB稀释1000倍，从中取100 μL涂布于无抗生素LB平板，37°C过夜培养。从该平板挑取单菌落分别在LB平板、LB-Amp平板和LB-Spect平板上划线。在LB上生长但不在LB-Amp（表明pDonor质粒已去除）或LB-Spect（表明pEffector质粒已去除）上生长的菌落保存于−80°C，用于后续发酵筛选。
【数据】共转化量：pEffector 50 ng、pDonor 200-400 ng；筛选平板：LB-Amp-Spect；PCR产物：未整合400 bp、整合600 bp；质粒消除：42°C、2 mL LB无抗生素、约1周传代；稀释涂布：1000倍稀释、100 μL涂布
4.5 启动子文库创建与表征
包含突变启动子Z70、Z55、Z35和Z15的文库通过标准定点突变（SDM）技术创建。该过程涉及互补引物对，通过将五个碱基对的T7 RNA聚合酶结合强度位点替换为简并核苷酸实现突变。定点突变在pDonor-mCherry上进行，该载体含有共有T7启动子作为模板DNA（图S2）。所得PCR产物立即用DpnI消化以消除模板DNA，然后转化至化学感受态DH5α。转化后收集所有菌落并提取质粒DNA。为避免生长选择偏差，不进行液体培养基培养。为进一步分析，将提取的质粒DNA文库与pEffector质粒DNA共转化至BL21 Star™ (DE3)化学感受态大肠杆菌中。按照上述方法，完全整合的菌落消除pDonor和pEffector质粒。将单个无质粒菌落接种于48孔板中2 mL AMM培养基，37°C过夜培养。培养15小时后，将培养物以50:1比例接种至2 mL AMM中，37°C培养4小时，然后用1 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导。使用BioTek Cytation 5酶标仪和黑壁96孔板测量OD650和mCherry荧光。为保持在仪器线性检测范围内，所有样品在分析前稀释10倍。记录650 nm（而非更标准的600 nm）处的吸光度，以避免mCherry激发/发射光谱的干扰。
【数据】突变方法：定点突变（SDM）；突变位点：5 bp T7 RNA聚合酶结合位点；模板：pDonor-mCherry；DpnI消化去除模板；诱导：1 mM IPTG；检测仪器：BioTek Cytation 5；样品稀释：10倍；检测波长：OD650
研究结果
2.1 质粒优化构建体的基因组直接表达导致菌株性能不佳
基于质粒的系统在补料分批生物反应器发酵中实现了高水平的裸盖菇素和降裸盖菇素产量，峰值滴度分别为1.46 ± 0.13 g/L和1.58 ± 0.08 g/L。利用CASTs将先前优化的裸盖菇素和降裸盖菇素途径构建体整合至大肠杆菌基因组位置GL1（glm）、GL4（lacZ）、GL13（tkb）和GL17（yadD-panC）的初步尝试获得了成功，但在小规模48孔板发酵系统中的滴度相比质粒系统大幅降低。这一结果表明，顶级构建体的身份在质粒和基因组表达模式之间并不保守（图2B）。基因组整合版本的pSilo16或Gymdi30构建体的裸盖菇素最高滴度仅达到7.1 ± 0.7 mg/L，降裸盖菇素滴度稍好，为88 ± 6 mg/L。这些滴度与Gymdi30、pSilo16和pNor的质粒表达系统形成鲜明对比，后者分别达到380 ± 50 mg/L、230 ± 90 mg/L和260 ± 10 mg/L的产量（图2B）。此外，表现不佳的菌株显示出4-羟基色氨酸（4-HTP）的积累，这表明第一个外源途径酶PsiD的功能降低——PsiD负责将4-HTP脱羧生成4-羟色胺。在所有测试的基因组位置均观察到类似趋势。
为探究途径性能不佳的原因，将ePathOptimize启动子组（包含用于生成上述质粒优化途径的启动子）在整合至GL1、GL4、GL13和GL17后进行终点mCherry表达筛选。对T7、C4、H10和G6启动子在整合系统中的表征揭示了其与质粒系统中表达的显著偏差（原始启动子组（蓝色），图3A），这可能解释了基因组整合系统中观察到的裸盖菇素和降裸盖菇素滴度下降的原因。当在基因组上表达时，T7启动子的mCherry表达与质粒表达相似，而基因组上的C4、H10和G6启动子与多拷贝pET载体中相同构建体的表达相比，mCherry荧光大幅降低。这一结果的差异性尤其引人注目——基因组上的单拷贝能够达到多拷贝质粒骨架上T7启动子实现的最高等效表达。这一结果表明拷贝数本身并不能解释低性能，而且可以开发新的启动子来填补这一功能表达差距。同样值得注意的是，每个启动子在每个基因组位置的绝对和相对功能启动子强度总体相似（见原始启动子组中的分组数据点，图3A），但H10和C4在GL1处例外，其表达强度的相对顺序与这些启动子在GL4、GL13和GL17处观察到的趋势相反。这一观察趋势与先前一项研究一致，即启动子在不同基因组位置保持相似的相对表达强度。然而，这些启动子在四个测试位点的绝对表达相似这一点并不常见。
【数据】质粒系统峰值滴度：裸盖菇素1.46 ± 0.13 g/L、降裸盖菇素1.58 ± 0.08 g/L；基因组整合最高滴度：裸盖菇素7.1 ± 0.7 mg/L、降裸盖菇素88 ± 6 mg/L；质粒对照产量：Gymdi30为380 ± 50 mg/L、pSilo16为230 ± 90 mg/L、pNor为260 ± 10 mg/L；代谢物积累：4-HTP
2.2 基因组上突变T7启动子文库的表征产生启动子强度分布
为优化靶途径的基因组表达性能，我们开发了一组新的中等强度T7突变启动子，填补了先前ePathOptimize启动子组留下的性能空白。通过定点突变构建了新的启动子文库（L1，表S3），产生约200个新启动子，在GL1位点进行评估（图3C）。选择在初始筛选中显示出理想终点mCherry荧光（介于共有T7和H10突变体之间）的特定启动子进行进一步表征。最终的一组附加启动子（Z70、Z55、Z35和Z15）根据其相对于共有T7的功能强度命名——Z55启动子在基因组上的终点mCherry表达约为共有T7的55%（表1）。这些启动子与三个先前表征的启动子（T7、C4和G6）组合，生成一个7成员功能文库，用于平衡基于基因组的途径表达（新启动子组，图3A）。随后对这些新启动子在基因组上的瞬时表达进行筛选，结果显示终点表达与功能启动子活性指标之间具有一致性（图S3）。
将四个新突变启动子克隆至高拷贝pETM6质粒骨架上进行终点质粒表达表征。数据分析显示，四个新突变体的表达强度与其在基因组筛选中表现存在偏差——每个启动子在质粒系统中表现出几乎相同的表达，四个突变体均落在T7表达的33%至36%之间（图3A-表1）。本工作中评估的所有突变启动子在未诱导状态下均显示出严格控制表达（图3AB）。所有启动子的独特序列及其与共有T7相比的终点表达强度总结见表1。
【数据】新启动子文库：约200个；Z55表达：约为共有T7的55%；质粒表达范围：33-36%的T7表达；启动子成员：7个（T7、C4、G6、Z70、Z55、Z35、Z15）
2.3 基因组上裸盖菇素途径的重新优化显著提升性能
来自裸盖菇（Psilocybe cubensis）的外源裸盖菇素途径由PsiD、PsiK和PsiM组成，被克隆至新表征的七成员启动子组中单一启动子的控制之下，采用随机组合ePathIntegrate方法。这些构建体随后被混合、经限制性酶切消化验证，并整合至GL1、GL4和GL17基因组位置。整合经菌落PCR确认和质粒消除后，所得菌株在48孔板中从4-羟基吲哚生产裸盖菇素的能力被测试，每个基因组位置筛选19株（理论文库大小的2.7倍）至38株（理论文库大小的5.4倍）之间（图S4-S6）。所得基因组整合文库在每个基因组位置产生了一系列裸盖菇素产量水平，每种情况下顶级构建体消耗了所有4-羟基吲哚底物，产生约300 mg/L（约1 mM）的裸盖菇素。这一性能与优化的质粒构建体相当，远超初始质粒优化构建体的基因组筛选结果（图2B）。
每个基因组位置的顶级菌株（GL1：#2、#12、#19；GL4：#18；GL17：#6、#13和#18）进一步在重复实验中评估并进行序列验证，以确定顶级构建体中存在哪些启动子（图4A；表S1中菌株S45-S51）。测序结果显示，七个菌株中有六个含有T7共有序列。然而，GL17菌株#6（S48，表S1）含有Z55启动子。这一测序结果表明，强途径表达对于最佳裸盖菇素途径性能是必要的，导致领先候选物中启动子身份趋同。此外，T7构建体在所有三个基因组位置上的相似高性能与上述mCherry表达分析结果一致。有趣的是，对假定等效菌株（例如GL1 #2、#12和#19，图4A；S45-S47，表S1）的全基因组测序分析揭示了若干差异。在上述组中，未观察到脱靶途径整合，但分别检测到4、3和2个突变（包括插入、缺失和替换）。
【数据】筛选规模：每基因组位置19-38株；理论文库覆盖：2.7x-5.4x；最佳产量：约300 mg/L（约1 mM）裸盖菇素；测序菌株：7株（S45-S51）；含T7启动子：6/7；含Z55启动子：1/7；突变数：GL1 #2为4个、#12为3个、#19为2个
2.4 DMT途径的基因组整合与优化
DMT生物合成途径以色氨酸为底物，经色氨酸脱羧酶和吲哚乙胺N-甲基转移酶两步催化生成。研究团队将DMT途径构建体整合至基因组后，同样观察到产量下降现象。通过应用新表征的启动子文库重新平衡途径表达，基因组整合的DMT生产菌株在摇瓶水平实现了与质粒系统相当的产量。随后在补料分批生物反应器中进行放大验证。
2.5 补料分批生物反应器放大生产
在补料分批生物反应器放大实验中，基因组整合的DMT生产菌株（N = 2）和裸盖菇素生产菌株（N = 3）分别进行了发酵测试。DMT放大过程中监测了代谢物浓度、OD600和葡萄糖浓度；裸盖菇素放大同样记录了这些参数。代表性过程数据还显示了反应器温度、pH和溶解氧的变化趋势。最终，基因组编码的菌株在补料分批生物反应器中实现了1.88 g/L裸盖菇素和1.62 g/L DMT的产量。
【数据】裸盖菇素产量：1.88 g/L；DMT产量：1.62 g/L；反应器规模：补料分批；重复数：DMT为N=2、裸盖菇素为N=3；监测参数：代谢物浓度、OD600、葡萄糖浓度、温度、pH、溶解氧
讨论与解读
本研究首次报道了利用CASTs将功能异源途径整合至大肠杆菌基因组并进行代谢平衡，所得生产指标与质粒系统最高报告值相当或更优。研究还表明，在质粒表达系统中提供大功能表达范围的启动子，在基因组表达背景下不一定产生相似的功能表达范围（反之亦然）。
此外，本工作收集的数据似乎与先前几项研究的发现存在冲突——本研究中由给定启动子控制的mCherry构建体在不同基因组位置评估时，功能表达强度没有显著变化。G6、H10、C4和T7启动子在四个测试基因组位置之间的平均差异仅为15%。而用于比较的三项先前研究主要评估了一个启动子在许多不同基因组位置的表达，本工作则评估了有限位置上的多个启动子。Urtecho等人进行的与本工作更具可比性的研究测试了许多启动子在不同基因组位置的表现，与我们的mCherry表达结果类似，他们发现虽然绝对表达有所不同，但启动子的相对强度在不同位点保持一致。
编译者解读：本研究的技术核心在于将"质粒优化"思维延伸至"基因组优化"——通过CASTs实现多基因途径的基因组整合，并以突变启动子文库重新平衡表达。这一策略直面了合成生物学中长期被忽视的问题：质粒与基因组转录环境的差异。1.88 g/L裸盖菇素的产量证明了基因组整合策略的工业潜力，同时全基因组测序揭示的脱靶整合与突变也提醒我们，CAST介导的菌株工程仍需要在递送特异性和基因组稳定性方面进一步优化。该方法为天然产物细胞工厂的构建提供了可推广的范式。
参考来源
Abrahms ZN. Genome-based optimization of psilocybin and N,N-dimethyltryptamine biosynthetic pathways in E. coli using CRISPR-associated transposases. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102490
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102490