来源：Single-cell approach dissecting agr quorum sensing dynamics in Staphylococcus aureus.（Nat Commun）| 编译：DNA Lab Space
导读
金黄色葡萄球菌的agr群体感应系统通过自诱导肽（AIP）调控毒力基因表达，四种agr型别（I–IV）间存在交叉抑制，但其单细胞层面的激活动态与相互作用层级尚不清晰。本研究借助mother-machine微流控芯片、延时显微镜与深度学习图像分析，对同源及天然agr型菌株实现了大规模单细胞量化。研究发现agr-IV基础激活水平高且对AIP高度敏感，agr-III则几乎无响应；AIP-IV可抑制预激活的agr-I，而AIP-I对agr-IV无抑制作用，揭示不对称交叉抑制。空间分隔共培养实验进一步定义了四种可重复的agr互作模式。
研究背景
金黄色葡萄球菌是重要的人类病原共生菌，可导致从轻度皮肤感染到致命性心内膜炎和假体关节感染等多种疾病。其致病性的关键驱动因素是产生包括外毒素在内的大量毒力因子。在定植和慢性感染期间，毒素产生通常减少，但在急性侵袭性疾病中被激活。agr系统是毒力和毒素调控的核心，这一双组分群体感应系统通过分泌的AIP感知群体密度。系统包含由P2和P3启动子分别控制的RNAII和RNAIII两个转录本：RNAII编码agr操纵子（agrD前体、agrB外排泵、agrC传感器组氨酸激酶、agrA转录因子），RNAIII作为下游小RNA效应物调控毒力基因翻译并编码δ-毒素。细胞外AIP被AgrC感知后触发AgrA磷酸化，进而激活P2形成正反馈环路，上调RNAII表达并增加AIP分泌。高浓度AIP存在时，磷酸化AgrA还激活P3直接上调下游基因。四种agr型别由不同AIP定义并具有交叉抑制能力，但群体水平的测量往往掩盖调控异质性，其激活动态与互作层级仍不清楚。
研究方法
菌株与培养条件
本研究所用菌株列于表1。同源Newman菌株（简写为NM-I、NM-II、NM-III和NM-IV）由Bo Shopsin提供，源自Geisinger等人13的工作。原作者将天然agr位点替换为从天然agr菌株中分离的四种agr型别之一。全基因组测序显示仅存在少量突变，可能是在agr系统删除或插入过程中引入的（多态性列于补充表8）。
表1 本研究所用菌株与质粒
金黄色葡萄球菌菌株：NM-I（EG802，agr-I，agr序列来源INTCT8325-4，ST8型，无质粒，Geisinger等13）；NM-II（EG803，agr-II，来源IRN6607（502a），ST8型）；NM-III（EG804，agr-III，来源IRN3984，ST8型）；NM-IV（EG805，agr-IV，来源IRN4850，ST8型）。各菌株分别携带本研究所构建的P3序列完全匹配的P3-gfp报告质粒（pALC1484-P3seq2-GFP、pALC1484-P3seq2-GFP、pALC1484-P3seq4-GFP、pALC1484-P3seq3-GFP）。天然agr菌株LAC（agr-I，ST8型）、502a（agr-II，ST5型）、MW2（agr-III，ST1型）、MNTG（agr-IV，ST2276型）均携带pDB59质粒（Yarwood等7）。
大肠杆菌菌株：DC10B（dam+ Δdcm ΔhsdRMS endA1 recA1，Monk等75）；IM08B（SA08BΩPN25-hsdS（CC8-1）（SAUSA300_0406）整合于essQ和cspB基因之间，Monk等76）。
质粒：pALC1484（pALC1484骨架，Cm10抗性，GFP报告，无P3来源，Kahl等57）；pALC1484-P3seq2-GFP（报告P3来源MW2）；pALC1484-P3seq3-GFP（报告P3来源RN4850）；pALC1484-P3seq4-GFP（报告P3来源EG804）；pDB59（pUC18/pC194骨架，Cm10抗性，YFP报告，来源MN8，Yarwood等7）。
对于Newman菌株，表中标明了原始菌株标识符及用于互补Newman agr敲除菌株的agr位点来源。这些菌株被转化了P3启动子序列完全匹配的P3-gfp报告质粒，对应序列见补充表9。所有天然agr菌株均转化了pDB59质粒。
携带pDB59 P3-yfp报告质粒的额外金黄色葡萄球菌菌株（LAC：agr-I；502a：agr-II；MW2：agr-III；MNTG：agr-IV）由Alexander Horswill提供。
过夜培养时，将单菌落接种于3 ml胰蛋白胨大豆肉汤（TSB；BD）中，添加10 µg ml⁻¹氯霉素（Cm10）维持质粒，并加入0.01% Tween20以减少聚集和生物膜形成（用于显微实验）。培养条件为37°C、220 rpm振荡。
合成AIP购自Cambridge Research Biochemicals（现为BIOSYNTH，AIP-I、-II、-III、-IV目录号分别为CRB1000249、CRB1001687、CRB1001688、CRB1001689）。储备液用DMSO配制，储存于−20°C。使用前将AIP用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，按指定浓度加入生长培养基。DMSO浓度保持在影响生长或agr信号传导的阈值以下。对照样品接受2.5% PBS代替AIP，与AIP稀释所用缓冲液浓度一致。
【数据】培养基：TSB；抗生素：10 µg ml⁻¹氯霉素；添加剂：0.01% Tween20；温度：37°C；转速：220 rpm；AIP储备液溶剂：DMSO；储存温度：−20°C；AIP稀释液：PBS；对照：2.5% PBS
P3-gfp质粒构建与细菌转化
为四种同源Newman菌株构建了P3序列完全匹配的报告质粒（表1）。各agr型别的P3启动子使用Taq Phusion（Thermo）扩增。寡核苷酸（购自Microsynth Switzerland）和扩增用基因组DNA（gDNA）列于补充表9。在本研究菌株中，NM-I、NM-II和MW2共享相同P3序列，NM-III具有独特P3序列，NM-IV和MNTG共享相同P3序列。扩增产物通过适当限制性内切酶（补充表9）连接到pALC1484质粒57中的gfpuv基因。所有构建体经PCR和测序验证。化学感受态大肠杆菌DC10B或IM08B先转化质粒，再通过电穿孔转化至相应Newman菌株。需要指出，本研究构建的P3-gfp质粒仅含P3启动子，而pDB59同时携带P2和P3启动子，且针对MN8菌株优化7，可能影响AgrA结合效率并提高P3激活所需的磷酸化AgrA浓度。
【数据】聚合酶：Taq Phusion；感受态细胞：E. coli DC10B或IM08B；转化方法：电穿孔；P3序列共享关系：NM-I/NM-II/MW2相同，NM-III独特，NM-IV/MNTG相同
基于酶标仪的agr激活测定
将自诱导肽（AIP）在PBS中进行两倍系列稀释（25 µl）。将过夜培养物用PBS洗涤两次后稀释至OD600 nm为0.5，再以OD600 nm为0.0025的接种量接种于含10 µg ml⁻¹氯霉素的TSB中。使用iD3酶标仪（Molecular Devices）在15分钟间隔、48小时内间歇振荡测量600 nm吸光度和荧光（GFP激发：475 nm，发射：525 nm；YFP激发：500 nm，发射：540 nm）。agr激活起始时间定义为GFP测量值首次超过10⁶ a.u.阈值的时间。
【数据】AIP稀释方式：两倍系列稀释（25 µl）；接种OD600：0.0025；氯霉素浓度：10 µg ml⁻¹；测量间隔：15 min；总时长：48 h；GFP激发/发射：475/525 nm；YFP激发/发射：500/540 nm；激活阈值：10⁶ a.u.
Mother-machine微流控装置
微流控装置模具由Martin Ackermann提供，设计与制造方法已发表58。装置包含6个独立重复通道，每个通道含约4000个盲端培养室（高度：0.93 µm；长度：25 µm；宽度：1.2–1.6 µm），垂直于主流通道（高度：21 µm；宽度：200 µm）排列。制造时，将聚二甲基硅氧烷（PDMS；Sylgard 184硅酮弹性体试剂盒，Dow Corning）与固化剂按10:1比例混合，浇注到模具上，脱气10分钟，80°C固化1小时。切割装置，打孔（0.75 mm）作为入口/出口，等离子体键合到#1.5玻璃载玻片（Corning）上。
总流速0.5 ml h⁻¹进入装置并分流到两条平行的21 µm高、200 µm宽主流通道中，平均流速约1.6 × 10⁴ µm s⁻¹（v = Q/A）。每条主流通道独立供应其对应的mother-machine培养室组。由于培养室仅0.93 µm高，高度差阻止了对流；溶质仅通过扩散进入培养室。因此，当供应AIP时，每个培养室入口的边界条件始终是含全浓度AIP的新鲜培养基。沿25 µm培养室长度的扩散在数秒内完成（代谢物和短肽约1–6秒59,60），确保化学环境空间均匀。GFP荧光谱沿培养室长度方向均匀（补充图15；每µm培养室长度的log₁₀（强度+1）斜率为−0.0045 log₁₀(AU) µm⁻¹）。
【数据】PDMS与固化剂比例：10:1；脱气时间：10 min；固化条件：80°C、1 h；打孔直径：0.75 mm；总流速：0.5 ml h⁻¹；通道尺寸：21 µm高×200 µm宽；平均流速：~1.6 × 10⁴ µm s⁻¹；培养室尺寸：0.93 µm高×25 µm长×1.2–1.6 µm宽；扩散时间：~1–6 s；荧光均匀性斜率：−0.0045 log₁₀(AU) µm⁻¹
连通室微流控装置
装置模具通过SU-8光刻在硅片上制造。设计包含两条20 µm高、100 µm宽的流通通道，每条通道供液一个100个室对的网格（每个室：高度0.85 µm；50 µm × 50 µm）。每对室由0.4 µm宽、3 µm长的纳米通道分隔，允许溶质扩散但阻止细胞迁移。该配置可在相邻室中共同培养不同菌株，并具有数百个平行重复。制造时，PDMS按5:1比例混合，浇注到模具上，脱气20分钟，80°C固化2小时。切割装置，加热（120°C，20分钟），打孔（1.5 mm）作为入口/出口，异丙醇冲洗，等离子体键合到#1.5玻璃载玻片（VWR）。agr激活变化通常起源于纳米通道附近并向室内传播（补充图12，补充数据5和6）。
每条20 µm高、100 µm宽流通通道以0.25 ml h⁻¹灌注，对应平均流速约3.5 × 10⁴ µm s⁻¹（v = Q/A）。对流仅发生在这些较高的流通通道中；溶质进入0.85 µm高浅室的途径受扩散限制。由于每个室由独立的流通通道供液，两个互作群体之间不存在营养竞争。扩散主导的……
【数据】通道尺寸：20 µm高×100 µm宽；室尺寸：0.85 µm高×50 µm×50 µm；纳米通道：0.4 µm宽×3 µm长；PDMS与固化剂比例：5:1；脱气时间：20 min；固化条件：80°C、2 h；加热处理：120°C、20 min；打孔直径：1.5 mm；灌注流速：0.25 ml h⁻¹；平均流速：~3.5 × 10⁴ µm s⁻¹
研究结果
用于单细胞agr定量的Mother-machine微流控装置
本研究使用mother-machine微流控装置在含或不含合成同源AIP的培养基之间动态切换（图1a）。Mother-machine芯片具有中央流通通道和垂直侧室，可捕获细菌（图1b），在过量细菌被洗出的同时实现持续生长且无细胞聚集。持续培养基流还确保自身产生的AIP无法积累。虽然mother-machine通常用于将杆状细菌严格单排排列，但球形金黄色葡萄球菌细胞常呈二维分布并排排列（图1c）。尽管如此，细胞仍局限于单一成像平面，允许单细胞图像分析。
图1 agr型别决定AIP敏感性与agr激活异质性。a 实验设计：细菌在mother-machine微流控芯片中短暂暴露于合成同源AIP 7.5小时。方框填充颜色反映实验阶段（亦用于e、f）。每次实验至少重复三次。b Mother-machine芯片示意（上）及嵌入细菌（下）。培养基以0.5 ml h⁻¹流速经注射泵供应，洗去自身产生的AIP和过量细菌，确保仅受合成AIP刺激。agr激活通过P3-gfp报告质粒监测。c 金黄色葡萄球菌NM-I暴露于三种AIP-I浓度的代表性图像序列。对照重复接受2.5% PBS代替AIP。相差图像与GFP荧光叠加（两者对比度均经调整以便可视化）。垂直灰线标记AIP移除时间，绿线显示平均单细胞GFP强度。比例尺，5 µm。d 合成同源AIP暴露期间（每列上方标注浓度）及AIP移除后（灰线，加/减符号）的单细胞agr激活（GFP强度，任意单位a.u.）。AIP暴露从时间0开始，之前时段用于（e）中作为-AIP（前）。每行代表一种agr型别。点颜色反映log₁₀细胞计数。所有重复的细胞合并分析，每个条件平均分析3,003,583个细胞（补充表1）。e AIP暴露期间agr-ON细胞平均百分比（阈值：100 AU）。每个点代表一个生物学重复（N = 3–7次独立mother-machine实验，接种来自不同日期培养物，详见补充表1）；柱状条显示平均值±SD。f 与（d）相同数据的指定时间间隔内log₁₀ agr激活直方图：-AIP（前），暴露开始前2小时（−2至0 h）；+AIP，AIP暴露最后2小时（5.5–7.5 h）；-AIP（后），AIP移除后3–5小时（10.5–12.5 h）。g 第三次1.5小时指数期传代培养物的RT-qPCR，分别用256 nM合成AIP（红色）或对照培养基（黄色）刺激。以管家基因hu归一化的相对表达量显示四个基因。彩色点代表重复（N = 3个来自独立培养物的生物学重复，在不同日期进行）；黑色柱状条显示平均值±SD。目标表达不可检测的样品（检测限（LOD）：Ct ≥ 30）在ΔCt/ΔΔCt计算中被赋予LOD Ct值，并以三角形符号显示。未刺激与AIP刺激条件之间的统计比较使用线性混合效应模型按基因进行，以log₁₀转换的相对表达为结果变量，菌株×AIP浓度作为固定效应，生物学重复作为随机截距。双侧配对比较（256 nM vs. 对照）使用估计边际均值获得。显著性表示为ns（p ≥ 0.05）、（p < 0.05）、（p < 0.01）和（p < 0.001）。精确双侧p值见补充表3。qPCR机器图标来自flaticon.com。
研究使用同源金黄色葡萄球菌Newman菌株（ST8），其天然agr位点被替换为四种agr型别之一13（简写为NM-I、-II、-III和-IV）。通过显微镜和P3-gfp报告质粒监测agr激活，该质粒在agr激活时产生荧光（图1c，示例视频见补充数据1）。单细胞GFP强度通过定制图像分析流程提取，该流程利用StarDist2D23和DeLTA2.024，并在新型金黄色葡萄球菌数据上重新训练，以确保准确的球菌分割和追踪（详见"方法"）。
研究在批量培养中通过酶标仪验证了报告性能与AIP活性，确认所有菌株的agr系统功能正常，以及添加合成同源AIP对agr激活强度和时间的调节作用（补充图1a–f）。
【数据】AIP暴露时间：7.5 h；培养基流速：0.5 ml h⁻¹；GFP激活阈值：100 a.u.；平均分析细胞数：3,003,583个/条件；NM-IV未刺激时agr-ON比例：19%；NM-I：2%；NM-II：0.2%；NM-III：0.9%；NM-I完全激活所需AIP浓度：256 nM；NM-II最高agr-ON比例：88%；NM-III在256 nM时最高agr-ON：12 ± 3%；双峰分布观察浓度范围：4–64 nM
agr型别决定AIP敏感性与agr激活异质性
研究在mother-machine中持续富营养流条件下，量化了0–256 nM合成同源AIP短暂暴露7.5小时期间的agr激活。在无合成AIP（对照，2.5% PBS）条件下，NM-I、NM-II和NM-III未检测到agr激活（GFP信号），表明自身产生的AIP低于其P3激活阈值（图1d）。然而，NM-IV表现出升高的基础agr激活。这一模式在将单细胞数据二值化为agr-OFF和agr-ON状态（100 a.u. GFP阈值）时同样明显：未受刺激的NM-IV细胞中有19%处于agr-ON状态，而NM-I、NM-II和NM-III分别为2%、0.2%和0.9%（图1e）。这种二值分类确认NM-IV升高的基础agr激活反映了一个实质性的激活亚群，而非GFP分布的边缘尾部。
在mother-machine中短暂暴露于合成同源AIP时，四种agr型别之间检测到显著的AIP敏感性差异。添加AIP后，NM-I和NM-II表现出剂量依赖性激活，而NM-IV从16 nM起即达到完全激活平台（>95% agr-ON）（图1d–f）。NM-I完全激活需要256 nM，NM-II即使在最高测试浓度下也从未超过88% agr-ON（图1e，补充图2和补充电影1）。NM-III在高达256 nM时仍无响应，仅一小部分细胞开始响应（最大agr-ON 12 ± 3%，图1e），与其在批量培养中延迟自诱导一致——批量培养中自身产生的AIP可以积累（补充图1c）。
这些mother-machine实验中单细胞agr激活的分布在对应三个实验阶段的特定观察间隔呈双峰（图1f）。此处双峰指直方图中两个不同的峰，代表agr-OFF和agr-ON细胞，揭示了在低至中等AIP浓度（4–64 nM）下显著的QS异质性。相对峰高取决于agr型别和AIP浓度，较高的AIP水平使更多细胞转入agr-ON状态。
在具有不同遗传背景的天然agr实验室菌株（LAC-I，ST8；502a-II，ST5；MW2-III，ST1和MNTG-IV，ST2276）中使用替代性P3-yfp报告构建体7观察到了相似模式（补充图3a–c和补充电影2，示例视频见补充数据2）。LAC-I和502a-II菌株表现出浓度依赖性agr激活，MW2-III对其同源AIP几乎无响应，MNTG-IV表现出升高的未刺激基础agr激活和高AIP敏感性，且所有响应性agr型别均可观察到双峰agr激活。
NM-I、-II和-IV对AIP刺激的agr系统响应时间基本不受AIP浓度影响，但在agr型别间存在差异。NM-IV响应快速且一致（达到50% agr-ON的平均时间0.6小时），NM-I较慢（1.4小时），NM-II最慢（2.5小时，补充图4a）。NM-III和天然MW-III均未达到50% agr-ON阈值，因此无法计算响应时间（补充……
【数据】AIP浓度范围：0–256 nM；NM-IV完全激活阈值：≥16 nM（>95% agr-ON）；NM-I完全激活：256 nM；NM-II最高激活：88%；NM-III最大响应：12 ± 3%（256 nM）；双峰分布浓度：4–64 nM；NM-IV达到50% agr-ON时间：0.6 h；NM-I：1.4 h；NM-II：2.5 h
交叉抑制的不对称性
（此部分原文节选未完整提供，根据已有结果段落推断并忠实翻译可见部分）
研究进一步将同源与异源AIP组合使用，探索交叉抑制的动态特征。AIP-IV可抑制预激活的agr-I，而AIP-I对agr-IV无抑制作用，表明agr型别间的交叉抑制存在不对称性。
【数据】交叉抑制关系：AIP-IV抑制agr-I；AIP-I不抑制agr-IV
空间分隔共培养中的agr互作模式
在连通室微流控装置中，NM-I与NM-II、NM-III或NM-IV分别共培养。每个连通室侧维持1982 ± 271个细胞的群落。扩散性串扰导致四种可重复的agr互作模式：稳定-优势（一个群体持续agr-ON，另一个被抑制）、稳定-双激活（两个群体均持续agr-ON，存在微小时间差异）、延迟-双激活（一个群体持续agr-ON，另一个延迟后激活）和不稳定-双激活（一个群体持续agr-ON，另一个表现出波动性激活）。互作结果主要由agr型别配对决定，并受遗传背景影响。
图5 连通室微流控共培养揭示agr互作模式。a 连通室微流控装置示意（室50 × 50 µm）。不含合成AIP的生长培养基以0.25 ml h⁻¹分别独立供应上下通道（20 × 100 µm）。室间纳米通道（0.4 µm间隙）阻止细胞混合但允许可溶性因子（包括AIP）扩散。NM-I与NM-II、NM-III或NM-IV共培养。每次实验进行四次，每次重复涵盖多达35个室对，每个连通室侧维持1982 ± 271个细胞的群落。b 接种后选定时间点的P3-gfp荧光代表性图像序列（相差与log₁₀转换GFP叠加；对比度经调整以便可视化）。箭头标记纳米通道；两种agr型别（代表性示例）标注于两侧。比例尺，10 µm。c 每种菌株配对的互作类别分布（每行一个配对，总和100%）：稳定-优势（一个群体持续agr-ON，另一个被抑制）、稳定-双激活（两者持续agr-ON，存在微小时间差异）、延迟-双激活（一个群体持续agr-ON，第二个群体延迟后激活）和不稳定-双激活（一个群体持续agr-ON，第二个群体表现出波动性激活）。比例已标注。持续或最初占优势的agr型别以颜色标示（除稳定-双激活中的相等（绿色）外，所有情况下均为NM-I（橙色））。来自四次生物学重复的连通室对合并分析。与NM-II组合中的一个室对因难以分类而被排除。各类别计数列于补充表6。
【数据】室尺寸：50 × 50 µm；通道尺寸：20 × 100 µm；灌注流速：0.25 ml h⁻¹；纳米通道间隙：0.4 µm；每侧细胞数：1982 ± 271；重复次数：4次；最大室对数：35对/重复
讨论与解读
本研究通过化学可控的微流控环境和单细胞显微技术，量化了四种agr型别在同源和天然菌株中的agr激活动态。测量揭示了agr型别特异的AIP敏感性差异：agr-III始终表现出最低的AIP敏感性，而agr-IV高度敏感且无AIP刺激时即表现出升高的基础激活。观察到的双峰agr激活可能源于亚群细胞——部分细胞持续处于agr-OFF状态，或在持续AIP供应下发生罕见的ON→OFF转换。功能上，异源AIP以型别特异方式抑制agr，包括AIP-IV对agr-I的意外部分抑制。最后，邻近群体间的相互作用形成不同类别，在同源配对中结果主要由agr型别驱动，而在天然菌株中更具多样性并受早期群体特征影响。
在同源和天然金黄色葡萄球菌菌株中，agr-III对同源AIP无响应而agr-IV是响应性最强的agr型别，与先前批量培养研究一致12,13,25。agr-III系统仍具功能性，酶标仪实验和agr-III双侧连通室实验中延迟但强劲的自诱导证明了这一点。在这些批量环境中，agr-III的激活晚于其他agr型别，与mother-machine观察一致——仅最高测试浓度的合成……
编译者解读
本研究最值得称道之处在于将mother-machine微流控从杆状菌扩展到球菌体系，并借助深度学习分割实现了大规模单细胞层面的QS量化——平均每个条件分析超过300万个细胞，这一数据规模在细菌群体感应研究中极为突出。agr-IV的基础激活和agr-III的近乎沉默形成鲜明对比，提示不同agr型别在感染生态位中可能采取截然不同的"博弈策略"。连通室共培养揭示的四种互作模式为理解菌株竞争与毒力演化提供了可量化框架。局限在于同源Newman菌株与天然菌株背景的差异，以及微流控环境中缺乏宿主免疫等生理因素，后续研究可向体内模型延伸验证。
PMID: 42162019