来源：Genome-Wide Identification of the XTH Gene Family in Carya illinoinensis and Heterologous Expression Analysis of CiXTH18 Under Osmotic Stress.（Plants (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
干旱胁迫严重制约木本坚果作物的生长与产量。木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（XTH）基因家族参与植物发育与逆境响应，但在薄壳山核桃（Carya illinoinensis）中的功能尚不清楚。本研究在全基因组水平鉴定出34个CiXTH成员，发现CiXTH18受干旱强烈持续诱导。在拟南芥中异源过表达CiXTH18后，转基因株系在PEG渗透胁迫下主根显著伸长、H₂O₂积累减少、离体叶片失水率降低，且DREB2A与NCED3基因诱导增强。启动子活性分析证实CiXTH18响应ABA处理。
研究背景
干旱胁迫是全球农业生产力和生态系统稳定性的最严峻环境限制因素之一。水分亏缺破坏细胞稳态、损害光合作用、限制养分运输，最终降低作物产量与品质。为应对干旱，植物演化出气孔调节、渗透调节、根系重塑、抗氧化防御及胁迫响应转录重编程等一系列协调的生理生化与分子响应。其中，活性氧（ROS）信号与脱落酸（ABA）介导的通路之间的交互在协调干旱响应中发挥核心作用。干旱破坏细胞氧化还原稳态，导致H₂O₂和超氧阴离子等ROS积累——这些分子既作为信号分子，也驱动氧化损伤。ABA作为干旱信号的主要整合者，通过上调ROS清除系统协调下游适应性响应。XTH基因家族通过调控初生细胞壁中木葡聚糖-纤维素网络的重塑，在胁迫适应过程中调节细胞壁延展性与机械稳定性，但其在薄壳山核桃水分限制条件下的功能 largely 未被表征。
研究方法
4.1 植物材料与根长测量
薄壳山核桃样品采集自中国江苏省句容市。拟南芥（Arabidopsis thaliana）与本氏烟（Nicotiana benthamiana）种子在含有10%（w/v）次氯酸钠和0.05%（w/v）Tween 20的溶液（南京，中国）中表面消毒15分钟，随后用双蒸水冲洗五次。消毒后的种子在4°C春化两天，然后转移至光照培养箱（南京，中国），光周期为16小时光照/8小时黑暗，温度23°C。四周龄的拟南芥和烟草分别用于转化和浸润实验。
对于体外渗透胁迫实验和根长测量，消毒后的拟南芥种子播种在补充有10%和15%（w/v）PEG 6000（南京，中国）的1/2 Murashige and Skoog（MS）培养基（南京，中国）上。发芽后10天评估并量化表型特征。对幼苗拍照后，使用ImageJ软件（https://imagej.net/ij/download.html，2025年8月23日访问）测量根长。0% PEG对照组分析5株幼苗，10%和15% PEG处理组各量化10株幼苗。对于土壤栽培干旱胁迫实验，充分浇水的四周龄幼苗通过浇灌15% PEG溶液进行胁迫处理。处理1天和3天后采集样品，储存于−80°C用于后续qPCR（南京，中国）分析。
【数据】消毒液：10%次氯酸钠+0.05% Tween 20；消毒时间：15min；春化：4°C、2天；培养条件：23°C、16h光照/8h黑暗；PEG浓度：10%、15%（w/v）PEG 6000；根长测量时间：发芽后10天；对照5株、处理各10株；土壤胁迫：15% PEG溶液浇灌；采样时间：1天、3天
4.2 薄壳山核桃XTH家族成员的鉴定与特征分析
薄壳山核桃基因组序列从NCBI数据库获取（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，2025年8月19日访问）。对应XTH家族结构域（PF00722和PF06955）的Hidden Markov Model（HMM，V. 3.0）配置文件从Pfam数据库获取（http://pfam.xfam.org/，2025年8月19日访问）。使用HMMER软件扫描薄壳山核桃蛋白序列中的这些结构域，显著性阈值为1 × 10⁻⁵。候选XTH蛋白进一步使用SMART数据库（https://smart.embl.de/，2025年8月19日访问）验证，手动去除冗余序列。使用ExPASy ProtParam工具预测所鉴定CiXTH蛋白的理化性质，包括分子量（MW）、等电点（pI）和蛋白长度。
【数据】HMM模型：PF00722、PF06955；阈值：1×10⁻⁵；数据库：NCBI、Pfam、SMART、ExPASy ProtParam；访问日期：2025年8月19日
4.3 CiXTH基因的系统发育分析
拟南芥蛋白从TAIR网站下载（https://www.A.thaliana.org/，2025年8月19日访问）。大麦（H. vulgare）和水稻（O. sativa）蛋白从NCBI网站下载（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，2025年8月19日访问）。这些序列使用ClustalW 2.1软件进行比对。使用MEGA 11软件以邻接法构建系统发育树，参数如下：Poisson模型、成对删除、1000次bootstrap重复。使用iTOL网站（https://itol.embl.de/upload.cgi）修饰系统发育树，2025年5月20日访问。
【数据】比对软件：ClustalW 2.1；建树软件：MEGA 11；方法：邻接法；模型：Poisson；缺失处理：成对删除；bootstrap：1000次
4.4 CiXTH基因表达模式分析
通过重新分析公开可用的干旱处理薄壳山核桃转录组数据来研究CiXTH基因的表达水平。从转录组数据集中提取CiXTH基因的FPKM值，用于评估其在干旱胁迫下的转录响应。为可视化相对表达变化，基于干旱处理样品相对于相应对照样品的表达水平计算倍数变化值。使用TBtools v2.303生成热图，展示干旱处理下CiXTH基因的表达模式。
【数据】数据来源：公开转录组数据；表达量指标：FPKM；可视化工具：TBtools v2.303
4.5 RNA提取与qRT-PCR分析
使用TRIzol试剂按照制造商说明书从植物组织中提取总RNA，以500 ng总RNA为模板，使用PerfectStart Uni RT&qPCR Kit（Thermo Fisher Scientific，上海，中国）通过逆转录合成第一链cDNA。使用QuantStudio One（Thermo Fisher Scientific，上海，中国）和PerfectStart Uni RT&qPCR Kit进行qPCR。
对于RT-qPCR分析，分别用15% PEG处理四周龄的WT、OE11和OE15拟南芥植株0、1和3天。在每个时间点收集叶片并立即在液氮中冷冻。所有采样组均制备三个独立的生物学重复。以ELF1a作为参考基因。使用2⁻ΔΔCT方法计算相对表达水平。RT-qPCR分析所用引物列于表S1中。
【数据】RNA提取：TRIzol法；cDNA模板量：500ng；试剂盒：PerfectStart Uni RT&qPCR Kit；仪器：QuantStudio One；PEG处理：15%、0/1/3天；参考基因：ELF1a；计算方法：2⁻ΔΔCT；生物学重复：3个
4.6 拟南芥转化与ROS积累检测
从薄壳山核桃基因组中分离CiXTH18的编码序列，获得1029 bp的开放阅读框（ORF）。将该基因克隆到带有GFP标签的修饰pCAMBIA1305载体中。将重组载体导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株，用于拟南芥转化。
为检测ROS积累，按照先前描述的方法进行3,3′-二氨基联苯胺（DAB）染色。从培养基中收取7日龄的WT、OE11和OE15拟南芥幼苗，分别进行15% PEG处理6小时和12小时。渗透处理后，将幼苗完全浸没在1 mg/mL DAB染色液中，室温避光孵育8小时。染色孵育后，使用95%（v/v）乙醇进行叶绿素脱色。完全脱色后，在光学显微镜下观察并拍照。
为通过化学发光法定量测量ROS水平，将培养在半强度MS（1/2 MS）培养基上的8株7日龄拟南芥幼苗转移至96孔微孔板中，在100 μL双蒸水（ddH₂O）中预孵育8小时。新鲜配制含有30% PEG、鲁米诺和辣根过氧化物酶（HRP）的工作液，每孔加入100 μL该溶液进行6小时胁迫处理。用微孔板读数器记录化学发光强度，量化6小时处理期间的累积ROS产生量。
【数据】ORF长度：1029 bp；载体：pCAMBIA1305（含GFP标签）；农杆菌菌株：GV3101；DAB染色：1 mg/mL、室温避光8小时；脱色：95%乙醇；ROS定量：8株幼苗、96孔板、100μL ddH₂O预孵8小时、30% PEG+鲁米诺+HRP工作液100μL、处理6小时
4.7 启动子活性分析
从薄壳山核桃基因组DNA中扩增CiXTH18起始密码子上游2000 bp基因组序列，分别独立克隆到pCAMBIA1381（ProCiXTH18::GUS）和pGreenII0800载体（ProCiXTH18::LUC）中。两个构建体均导入根癌农杆菌GV3101并浸润本氏烟叶片。浸润后48小时，用溶于0.1%（v/v）乙醇的100 μM ABA处理叶片，或等体积溶剂作为对照。处理后48小时，从每株植物的三片叶片采集叶盘，共三株独立植物。GUS染色通过将叶盘在X-Gluc底物溶液中37°C避光孵育过夜，然后用70%乙醇脱色。使用发光成像系统量化荧光素酶活性。
【数据】启动子序列长度：2000 bp；载体：pCAMBIA1381、pGreenII0800；ABA浓度：100 μM（溶于0.1%乙醇）；处理时间：48小时；GUS染色：X-Gluc底物、37°C过夜；脱色：70%乙醇；样本：3株×3片叶
4.8 失水速率测定
对于离体叶片失水实验，从4周龄WT、OE11和OE15植株上采集发育状态相近的完全展开莲座叶。每个基因型分析8片叶。离体后立即记录初始鲜重，随后在相同环境条件下室温保存。离体后2、4和8小时再次记录鲜重。失水速率计算公式如下：失水速率（%）= [(W₀ − Wₜ)/W₀] × 100%，其中W₀代表初始鲜重，Wₜ代表相应时间点的鲜重。
【数据】叶片数：每基因型8片；测量时间点：0、2、4、8小时；计算公式：失水率(%)=[(W₀−Wₜ)/W₀]×100%
4.9 统计分析
所有实验均设置不少于三个生物学重复，具体细节在各图注中标明。统计分析通过单因素方差分析（one-way ANOVA）进行。
【数据】生物学重复：≥3个；统计方法：one-way ANOVA
研究结果
2.1 CiXTH成员的鉴定与理化特征分析
为全面鉴定薄壳山核桃中的XTH家族，我们使用HMMER（V. 3.0）和BLASTP（2.14.0）对薄壳山核桃基因组数据库进行搜索。初步筛选鉴定出41个推定的XTH候选基因。随后使用SMART和NCBI CDD数据库进行结构域验证，排除了缺乏保守XTH结构域（PF00722）或编码蛋白短于200个氨基酸的序列。最终鉴定出34个XTH基因，命名为CiXTH1-CiXTH34（表S1）。
使用ExPASy ProtParam工具预测CiXTH蛋白的理化性质（表S1）。预测蛋白长度范围为241个氨基酸（CiXTH9，25.24 kDa）至346个氨基酸（CiXTH15，39.99 kDa）。理论等电点（pI）变化范围从4.69（CiXTH13）到9.47（CiXTH34），表明电荷性质和相互作用潜力存在显著差异。值得注意的是，所有CiXTH蛋白均表现出负的总平均亲水性（GRAVY）值，表明它们主要是亲水性蛋白（表S1）。
【数据】候选基因数：41个；最终鉴定：34个（CiXTH1-CiXTH34）；蛋白长度范围：241 aa（CiXTH9，25.24 kDa）~346 aa（CiXTH15，39.99 kDa）；pI范围：4.69（CiXTH13）~9.47（CiXTH34）；GRAVY：全部为负值
2.2 薄壳山核桃XTH成员的系统发育分析
为研究CiXTH家族的进化关系和分类，使用来自薄壳山核桃、大麦（Hordeum vulgare）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）的蛋白序列构建系统发育树（图1）。所得系统发育将XTH蛋白分为四个主要进化支：Group I/II、Group III-A、Group III-B和早期分化群。其中，Group I/II是最大的进化支，包含23个CiXTH成员。Group III-A和Group III-B分别包含四个和五个成员。其余两个基因CiXTH25和CiXTH33归属于早期分化群，与该进化支在XTH超家族中的进化保守性一致。
【数据】进化支数量：4个；Group I/II：23个CiXTH成员；Group III-A：4个；Group III-B：5个；早期分化群：CiXTH25、CiXTH33
2.3 CiXTH蛋白的结构特征与保守基序
为系统研究CiXTH家族成员的结构组织和保守特征，进行了保守结构域鉴定和基序分析。如图2A、B所示，所有CiXTH蛋白均包含两个特征性结构域：Glyco_hydro_16结构域和XET_C结构域，二者共同构成糖苷水解酶家族16（GH16）所有成员共有的标志性β-果酱卷（β-jelly roll）折叠结构。除CiXTH4、CiXTH9、CiXTH15、CiXTH18、CiXTH21、CiXTH24、CiXTH25、CiXTH27和CiXTH28外，所有其他成员均预测含有信号肽，表明它们可能参与蛋白分泌。值得注意的是，只有CiXTH4、CiXTH9、CiXTH15、CiXTH18和CiXTH28被预测含有跨膜结构域，提示其在膜相关过程中具有潜在作用。使用MEME进行的保守基序分析在所有CiXTH蛋白中鉴定出十个不同基序（图2C）。其中，基序1和基序7在所有CiXTH成员中普遍存在，表明它们在薄壳山核桃中具有保守功能。此外，保守催化结构域ExDxE在CiXTH9、CiXTH24和CiXTH25中缺失，表明它们可能在进化过程中发生了功能分化。
【数据】保守结构域：Glyco_hydro_16 + XET_C；含信号肽成员：除CiXTH4/9/15/18/21/24/25/27/28外全部；含跨膜结构域：CiXTH4、CiXTH9、CiXTH15、CiXTH18、CiXTH28；保守基序数：10个；基序1和7：全部成员普遍存在；ExDxE缺失：CiXTH9、CiXTH24、CiXTH25
2.4 CiXTH蛋白的基于结构的序列比对
为进一步表征CiXTH蛋白的结构特征，以两个已解析晶体结构的XTH蛋白为参考进行基于结构的序列比对：PttXET16-34（PDB ID: 1UN1）代表Group I/II，TmNXG1（PDB ID: 2UWA）代表Group III-A。如图3所示，除CiXTH9外，所有CiXTH蛋白均含有保守的催化ExDxE基序，其中第一个谷氨酸残基作为催化亲核试剂启动酶促反应，第二个谷氨酸残基作为通用酸碱催化剂促进底物结合和切割。结构比较揭示，Loop 2区域——先前已证明在决定木葡聚糖内转糖苷酶（XET）与木葡聚糖内水解酶（XEH）酶学活性中起关键作用的区域——在Group III-A成员中相对于其他组显著延长。此外，在大多数Group I/II成员中保守的Loop 3序列WATRGG在Group III-A成员中被WATxxG替代，表明存在亚家族特异性的结构适应，具有潜在的功能意义。
【数据】参考结构：PDB ID 1UN1（PttXET16-34，Group I/II）、2UWA（TmNXG1，Group III-A）；ExDxE基序：除CiXTH9外全部含有；Loop 2：Group III-A显著延长；Loop 3序列：Group I/II为WATRGG，Group III-A为WATxxG
2.5 CiXTH基因的干旱响应表达谱
为优先筛选功能表征的候选基因，我们分析了公开可用的干旱处理薄壳山核桃转录组数据，以热图形式可视化（图4）。基于倍数变化值量化表达变化。CiXTH基因在干旱处理后表现出不同的表达模式。值得注意的是，八个基因（CiXTH9、CiXTH14、CiXTH17、CiXTH21、CiXTH22、CiXTH25、CiXTH27和CiXTH33）在所有检测时间点均未检测到表达，表明它们在这些条件下可能处于转录失活状态，或具有高度特异的时空表达模式而未在该数据集中捕获。相比之下，其余26个基因表现出不同程度的干旱响应表达。其中，CiXTH18随干旱暴露时间延长呈现渐进性表达增加。这一表达趋势，加上其与AtXTH29（一个先前已被表征为参与干旱胁迫的基因）在系统发育上的紧密聚类，表明CiXTH18表现出强烈的干旱诱导性，并将其确定为干旱相关胁迫条件下进一步功能分析的候选基因。
【数据】无表达基因：CiXTH9、CiXTH14、CiXTH17、CiXTH21、CiXTH22、CiXTH25、CiXTH27、CiXTH33（共8个）；干旱响应基因：26个；CiXTH18：随干旱时间渐进上调
2.6 CiXTH18异源表达与拟南芥PEG渗透胁迫下性能改善相关
鉴于CiXTH18强烈的干旱诱导性，在CaMV 35S启动子下过表达CiXTH18的转基因拟南芥植株被用于功能表征。在鉴定T3纯合株系后，qPCR分析显示CiXTH18在OE11和OE15转基因植株中表达量最高（图S1）；选择这两个株系用于所有后续实验。为评估转基因植株在PEG诱导渗透胁迫下的表现，将WT、OE11和OE15的种子播种在补充有10%和15% PEG 6000的1/2 MS培养基上。如图5A和图5B所示，在10% PEG诱导的渗透胁迫下，OE11和OE15转基因株系的根长分别比WT植株增加35%和71%。在更严重的胁迫条件（15% PEG）下，OE11和OE15的根长仍显著大于WT，分别增加21.5%和45.4%（图5A和图5B）。这些结果表明，CiXTH18异源表达似乎与PEG介导的渗透胁迫下更长的初生根长度相关。
为进一步检测氧化响应，将7日龄幼苗进行15% PEG处理0小时、6小时和12小时，然后进行3,3′-二氨基联苯胺（DAB）染色以检测H₂O₂积累（图5C）。在对照条件下（0小时），WT和转基因株系之间的染色强度没有明显差异。然而，在渗透胁迫6和12小时后，WT叶片表现出比OE11和OE15株系更强的DAB染色，表明H₂O₂过度积累。此外，通过鲁米诺-HRP化学发光法量化了15% PEG诱导渗透胁迫引发的总ROS积累，使用微孔板读数器在6小时处理期间连续记录发光信号。如图5D所示，野生型（WT）幼苗的总相对发光单位（RLU）显著高于OE11和OE15。这些结果表明，CiXTH18过表达株系在渗透胁迫下积累的ROS水平较低。
【数据】10% PEG下根长增加：OE11 +35%、OE15 +71%；15% PEG下根长增加：OE11 +21.5%、OE15 +45.4%；DAB染色时间点：0、6、12小时；RLU检测：7日龄幼苗、15% PEG、6小时；统计：one-way ANOVA with Tukey's test（ p < 0.05, p < 0.01, p < 0.005）
2.7 CiXTH18过表达株系在离体叶片脱水过程中失水减少
为评估CiXTH18过表达是否影响植株的保水能力，进行了离体叶片失水实验。如图6A和图6B所示，在室温脱水条件下，OE11和OE15株系的离体叶片失水速率显著低于WT。在脱水2小时时，WT叶片失水率约为20%，而OE11和OE15的失水率分别约为12%和10%。在脱水4小时时，WT失水率约为40%，OE11和OE15分别约为28%和22%。在脱水8小时时，WT失水率约为55%，OE11和OE15分别约为42%和35%。这些结果表明，CiXTH18过表达能够减少离体叶片的失水速率，从而提高植株的保水能力。
【数据】脱水时间点：0、2、4、8小时；2h失水率：WT约20%、OE11约12%、OE15约10%；4h失水率：WT约40%、OE11约28%、OE15约22%；8h失水率：WT约55%、OE11约42%、OE15约35%；样本数：n=8；统计：one-way ANOVA with Tukey's test（ p < 0.05, p < 0.01, p < 0.005）
2.8 WT、OE11和OE15中干旱响应基因的表达分析
为探究CiXTH18过表达是否影响干旱响应基因的表达，通过qRT-PCR检测了DREB2A和NCED3在WT、OE11和OE15植株中的相对表达水平。如图7所示，在15% PEG处理0、1和3天后，OE11和OE15中DREB2A和NCED3的表达水平均显著高于WT。在处理3天时，OE11和OE15中DREB2A的表达量分别约为WT的3.5倍和4.2倍；NCED3的表达量分别约为WT的2.8倍和3.5倍。这些结果表明，CiXTH18过表达增强了干旱响应基因DREB2A和ABA生物合成相关基因NCED3的诱导表达。
【数据】处理：15% PEG、0/1/3天；DREB2A（3天）：OE11约WT的3.5倍、OE15约WT的4.2倍；NCED3（3天）：OE11约WT的2.8倍、OE15约WT的3.5倍；参考基因：EF1a；生物学重复：3个；统计：one-way ANOVA with Tukey's test（ p < 0.01, * p < 0.005）
2.9 CiXTH18启动子的ABA响应活性
为验证CiXTH18是否响应ABA信号，将CiXTH18启动子（起始密码子上游2000 bp）分别与GUS和LUC报告基因融合，通过农杆菌浸润瞬时转化本氏烟叶片。如图8A所示，GUS组织化学染色显示，ABA处理后的叶片蓝色明显加深，表明启动子活性增强。图8B和图8C显示，100 μM ABA处理24小时后，LUC发光强度显著高于对照组。这些结果表明，CiXTH18启动子具有ABA响应活性，CiXTH18的表达受ABA信号正调控。
【数据】启动子长度：2000 bp；ABA浓度：100 μM；处理时间：24小时；GUS染色：X-Gluc底物、37°C过夜；LUC检测：发光成像系统；生物学重复：4个；统计：t test（* p < 0.05）
讨论与解读
植物细胞壁重塑是植物应对环境胁迫的核心适应机制。XTH家族通过调控初生细胞壁中木葡聚糖-纤维素网络的修饰，在胁迫适应过程中调节细胞壁延展性与机械稳定性。本研究在薄壳山核桃中全基因组鉴定出34个CiXTH成员，系统发育分类将其归入四个进化支，与其他植物物种中XTH家族的进化架构一致。薄壳山核桃中Group I/II成员的扩张尤为显著，该进化支广泛关联于胁迫响应的细胞壁重塑和快速细胞伸长过程。转录组分析显示，大部分CiXTH基因响应干旱胁迫，其中CiXTH18表现出最显著且持续的诱导表达。功能研究证实，CiXTH18异源表达与拟南芥在PEG渗透胁迫下初生根伸长、H₂O₂积累减少、离体叶片失水率降低以及干旱响应基因DREB2A和NCED3的增强诱导相关。启动子活性分析确认CiXTH18响应ABA处理。
编译者解读：该研究通过全基因组鉴定结合异源表达验证的策略，系统筛选并功能验证了薄壳山核桃XTH家族中响应干旱的关键成员CiXTH18。方法上采用多数据库联用和HMM搜索，鉴定流程规范可靠；功能验证从根长、ROS积累、失水率、下游基因表达到启动子活性分析，层层递进，证据链完整。CiXTH18作为木本经济树种干旱响应的候选基因，为后续通过基因工程改良薄壳山核桃抗旱性提供了有价值的靶点。值得注意的是，研究主要在拟南芥中异源验证，其在薄壳山核桃中的天然功能及分子机制仍有待进一步探索。
参考来源
Wu J, Zhang Y, Zhang H, Bai N, Ye Y. Genome-Wide Identification of the XTH Gene Family in Carya illinoinensis and Heterologous Expression Analysis of CiXTH18 Under Osmotic Stress. Plants (Basel). PMID: 42588822.
PMID: 42588822