来源：Impact of Aspergillus cristatus dominated fermentation on fungal communities and metabolite profiling in large-leaf Tea: Insights into quality formation via post-fermentation “flowering” process（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space
导读
大叶茶是茶叶加工的重要原料，茯砖茶以冠突散囊菌为优势菌的后发酵过程被称为“发花”，可强烈改变茶叶代谢物组成。本研究利用全长ITS测序与非靶向代谢组学技术，对比发花前后大叶茶真菌群落、非挥发性代谢物和挥发性代谢物的变化，发现发花后未分类曲霉科真菌占比达92.31%，表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯和儿茶素分别下降24.88%、22.42%和45.11%，没食子酸增加98.75%，并鉴定出30种关键差异挥发性代谢物。研究为发花工艺改善大叶茶品质提供了实验证据。
研究背景
茯砖茶是黑茶的典型代表产品，加工过程中需要微生物参与发酵。茯砖茶通常以茶树鲜叶为原料，经杀青、拼配、蒸压、渥堆、压制、后发酵和干燥等工序制成。其后发酵过程被称为“发花”，优势真菌为冠突散囊菌。发花过程显著改变茯砖茶的挥发性和非挥发性成分，影响茶叶品质。经发花加工的茯砖茶具有多种健康功效，如预防肥胖、降脂和调节肠道菌群等。大叶茶原料采自普洱茶种，是世界范围内广泛栽培的重要茶叶加工原料，云南大叶茶是代表性资源。然而，目前发花后大叶茶真菌群落丰度和代谢物的变化尚不清楚。
研究方法
2.1 茶叶材料制备
晒青茶以云南省临沧市产的云南大叶茶鲜叶为原料，按照国家标准（GB/T 22111）描述的工艺制作。临沧属亚热带低纬度高原山地季风气候，年平均气温18.8°C。鲜叶在晴天或阴天采摘，采摘期间平均低温15°C，平均高温30°C。晒青茶的制备流程依次为：鲜叶摊放、杀青、揉捻、解块和日光干燥。发花大叶茶以晒青茶为原料，按照茯砖茶发花工艺制备。发花过程是对初制茶进行的一系列工序，包括渥堆、蒸压、压制、发花和干燥，发花期间温度维持在（28±3）°C，湿度维持在（75±5）%，保持茶叶自然pH。此外，湖南益阳茶厂的茯砖茶产自长期用于发花工艺的专用发酵房。
【数据】原料：云南大叶茶鲜叶（临沧）；年平均气温：18.8°C；采摘期温度：15–30°C；发花温度：28±3°C；发花湿度：75±5%；发花pH：自然pH
2.2 化学试剂
用于非挥发性代谢组分析的乙腈（CAS 75-05-8，≥99.9%，梯度级）和甲酸（CAS 64-18-6，≥98%，HPLC级）为质谱级，购自德国Merck KGaA公司。用于挥发性代谢组分析的乙醇（CAS 64-17-5，≥99.9%，梯度级）购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。癸酸乙酯（CAS 110-38-3，≥99.9%，分析标准品）购自安谱实验科技（上海）。正构烷烃（C7–C29，有证标准物质）由Sigma-Aldrich Co., Ltd（上海）提供。
【数据】乙腈纯度：≥99.9%；甲酸纯度：≥98%；乙醇纯度：≥99.9%；癸酸乙酯纯度：≥99.9%
2.3 茶叶微生物DNA提取
每个茶叶样品（15.0 g）用摇床在200 rpm下振荡30 min，然后通过离心（14000×g，管底，20°C，15 min）收集微生物，并使用FastDNA® SPIN Kit for Soil（MP Bio，美国，货号6560200）按说明书提取基因组DNA。根据此前相关报道，从茶叶中分离、纯化优势真菌，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于28°C培养6天，然后收集菌丝体和孢子提取基因组DNA。优势真菌基因组DNA使用Super Plant Genomic DNA Kit（天根生化科技有限公司，北京，货号DP360）获得。简要步骤：取100 mg纯培养的菌丝体和孢子加入液氮中充分研磨，转移至400 μL裂解液GPS中，在65°C水浴中涡旋混合15 min。然后加入100 μL缓冲液GPA，涡旋振荡1 min，12000×g离心5 min（20°C），将上清液转移至过滤柱CS中，12000×g离心1 min（20°C）。滤液与等体积无水乙醇混合后转移至吸附柱CR2中，12000×g离心1 min（20°C），然后依次使用550 μL去蛋白液RD、700 μL漂洗液PW和700 μL漂洗液PW在相同条件下离心去除杂质。柱子室温放置10 min后，加入50 μL水，12000×g离心2 min（20°C）洗脱DNA。
【数据】样品量：15.0 g；振荡：200 rpm，30 min；离心：14000×g，20°C，15 min；培养：PDA培养基，28°C，6天；菌丝量：100 mg；裂解：65°C水浴，15 min；离心：12000×g，5 min/1 min/2 min（20°C）；洗脱体积：50 μL
2.4 基因扩增与全长测序
从茶叶样品中分离的优势真菌使用ITS、BenA和CaM多基因座序列引物进行PCR扩增。相应多基因座序列的扩增产物由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。茶叶中真菌全长ITS使用ITS1F和ITS4通用引物进行。随后使用PacBio对全长ITS扩增子进行高通量测序。所有样品均设四次重复进行微生物检测。优势真菌基因组的多基因座序列使用相应引物扩增。优势真菌物种鉴定通过比对ITS、BenA和CaM多基因座序列完成。
【数据】测序平台：PacBio；重复数：4次；引物：ITS1F/ITS4；多基因座：ITS、BenA、CaM
2.5 化学成分检测方法
不同茶样的水浸出物和总多酚按照此前描述的方法进行定量。简要步骤：茶叶总多酚采用福林酚比色法测定。游离氨基酸按照国家标准（GB/T 8314）操作程序测定。简要步骤：基于茚三酮与氨基酸在pH 8.0下共热形成的紫色产物，采用紫外-可见分光光度法测定游离氨基酸含量。可溶性糖含量采用蒽酮-硫酸比色法测定。茶黄素含量按照国家标准操作程序（GB/T 30483）采用高效液相色谱法测定。
【数据】游离氨基酸测定pH：8.0；茶黄素检测方法：HPLC（GB/T 30483）
2.6 代谢物谱分析
挥发性代谢物采用顶空固相微萃取法收集。在顶空样品瓶中，加入茶粉（0.5 g）、磁力转子、沸水（5 mL）和10 μL癸酸乙酯（10 mg/L）用于后续分析。萃取使用二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS；50/30 μm，Sigma，上海）纤维，通过自动进样器插入样品顶空瓶，在65°C下孵育30 min。挥发性代谢物使用安捷伦8890全二维气相色谱仪结合安捷伦7250四极杆飞行时间质谱仪检测。一维和二维色谱柱分别为HP-5MS（37.69 m × 250 μm × 0.25 μm，安捷伦科技，美国）和DB-17MS（2.89 m × 180 μm × 0.18 μm，安捷伦科技，美国），通过HV调制柱（1.3 m × 0.25 mm；J & X Technologies，上海）连接。调制器为固态热调制器SSM1800（J & X Technologies，上海），带半导体冷却元件，调制周期4 s。载气为高纯氦气（99.99%），流速1.1 mL/min。进样口分流比10:1。色谱柱温度初始设为40°C保持1 min，然后以4°C/min升至180°C，再以20°C/min升至250°C，最后保持1 min。质谱离子源电子电离能量70 eV，质量扫描范围45至500 amu。
非挥发性代谢物提取方法参考此前研究。取0.50 g茶粉，用40 mL 75%（v/v）甲醇水溶液提取。最后，提取液经0.22 μm尼龙膜过滤，转入液相小瓶供进一步分析。每个茶样进行四次重复。非挥发性代谢物使用超高效液相色谱- heated电喷雾离子源串联质谱系统（UHPLC-H-ESI-MS/MS，Orbitrap Exploris 120，Thermo Fisher Scientific，美国）测定。
【数据】茶粉量：0.5 g；沸水量：5 mL；内标：10 μL癸酸乙酯（10 mg/L）；萃取纤维：DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）；孵育：65°C，30 min；载气流速：1.1 mL/min；分流比：10:1；程序升温：40°C（1 min）→4°C/min至180°C→20°C/min至250°C（1 min）；EI能量：70 eV；扫描范围：45–500 amu；提取溶剂：40 mL 75%甲醇水；过滤膜：0.22 μm尼龙膜；重复数：4次
研究结果
3.1 发花过程中真菌群落的变化
#### 3.1.1 ITS全长测序总体分析
通过高通量测序分析原料晒青茶和发花后发花大叶茶的真菌群落多样性和组成，并与茯砖茶进行比较。全长ITS测序结果获得的序列平均长度为610.77 bp，样品最长序列长度为899 bp。通过分析稀释曲线评估不同茶样的测序深度和真菌多样性。稀释曲线显示，所有样品的物种数随测序深度增加而增加，最终物种数趋于平稳，表明本研究测序深度充足。此外，稀释曲线结果中晒青茶的Sobs指数高于发花大叶茶和茯砖茶，表明晒青茶的物种丰富度更高。同时，晒青茶的Shannon指数也高于发花大叶茶和茯砖茶，说明晒青茶不仅具有更高的物种丰富度，而且物种分布更均匀。这些结果表明晒青茶中的真菌群落结构更为复杂，这可能与其特定的生产环境有关。发花后茶样中真菌物种多样性较低是由发花过程形成的。
【数据】序列平均长度：610.77 bp；最长序列：899 bp；Sobs指数：SQ > FP、FZ；Shannon指数：SQ > FP、FZ
#### 3.1.2 发花过程中真菌群落的转变
Alpha多样性分析显示，晒青茶与发花大叶茶之间的Sobs、Chao、Shannon和Simpson指数存在显著差异（图1A–D）。晒青茶的Sobs指数（76.0 ± 5.4）显著高于发花大叶茶（4.0 ± 2.0），表明晒青茶样品中的真菌物种数显著高于发花大叶茶（图1A）。晒青茶的Chao和Shannon指数也显著高于发花大叶茶，进一步支持晒青茶样品具有更高的物种丰富度和更均匀的真菌物种分布（图1B和C）。发花大叶茶的Simpson指数（0.86 ± 0.10）显著高于晒青茶（0.29 ± 0.01），表明发花大叶茶中某些真菌具有较高的优势度（图1D）。相反，晒青茶中的群落结构更为均匀。上述结果表明，晒青茶中的真菌群落具有更高的丰富度和均匀度，而发花大叶茶的真菌群落中少数真菌具有较高的优势度。发花过程的环境可能使优势“金花”真菌大量生长繁殖，与其他物种形成激烈竞争，从而降低了真菌物种丰度，形成了以优势真菌为主的不均匀群落结构。
进一步分析发花大叶茶与茯砖茶之间的真菌群落多样性差异。结果发现，发花大叶茶和茯砖茶的Sobs指数和Chao指数无显著差异（p > 0.05），而Shannon指数和Simpson指数存在显著差异（图1A–D）。发花大叶茶的Shannon指数（0.27 ± 0.15）显著高于茯砖茶（0.00 ± 0.00），表明发花大叶茶的真菌物种丰富度更高。而发花大叶茶的Simpson指数（0.86 ± 0.10）显著低于茯砖茶（1.00 ± 0.00），表明茯砖茶中优势真菌的优势度更为显著。这些结果表明发花大叶茶和茯砖茶的物种数差异不大，但发花大叶茶的物种丰富度和均匀度更高，茯砖茶中优势真菌的优势地位更突出。
此外，通过主坐标分析和层次聚类树分析评估了发花过程对茶样真菌群落Beta多样性的影响（图1E和F）。主坐标分析结果显示，经发花处理的发花大叶茶的真菌群落与未发花的晒青茶存在显著差异（图1E）。同时发现发花大叶茶与茯砖茶的真菌群落之间无显著差异（图1E）。层次聚类树分析结果显示，晒青茶中的优势真菌为未分类的德巴利酵母属（41.01%）、罗丹赛伯林德纳氏酵母（30.52%）、未分类的曲霉属（14.04%）和假丝酵母属（7.64%），而发花大叶茶（92.31%）和茯砖茶（99.99%）中的优势真菌为未分类的曲霉科（图1F）。
属和种水平上真菌群落动态相对丰度的结果表明，全长ITS测序确实提供了真菌物种的高分辨率，但在曲霉科中表现不佳（图1G和H）。本研究使用全长ITS测序揭示了大叶茶发花前后真菌丰度的变化。基于短片段ITS测序的茯砖茶发花过程中真菌群落研究也发现，原料中最优势的真菌为曲霉属、Cyberlindnera和假丝酵母属，发花茶中的优势真菌为曲霉属。真菌ITS1扩增子测序结果揭示，普洱茶发酵过程中的优势微生物也是曲霉属，其中黑曲霉是有影响力的优势真菌。这与我们的结果相似。基于操作分类单元对茯砖茶真菌群落的多项研究也发现优势真菌为曲霉属。据报道，在某些样品中，全长扩增子测序在真菌物种水平鉴定方面缺乏显著优势。本研究发现，当优势真菌为曲霉科且占据较高相对丰度时，全长ITS测序提供的真菌群落多样性信息会急剧减少。而多种传统食品发酵过程中的优势微生物均为曲霉科，全长ITS测序在这些样品真菌群落多样性研究中的作用有限。因此，可能需要开发基于全长测序的多基因座扩增子或宏基因组技术，用于鉴定富含曲霉科样品的真菌群落。
【数据】Sobs指数：SQ 76.0±5.4 vs FP 4.0±2.0；Shannon指数：FP 0.27±0.15 vs FZ 0.00±0.00；Simpson指数：FP 0.86±0.10 vs FZ 1.00±0.00；SQ优势真菌：Debaryomyces 41.01%、C. rhodanensis 30.52%、Aspergillus 14.04%、Candida 7.64%；FP优势真菌：unclassified_f_Aspergillaceae 92.31%；FZ优势真菌：unclassified_f_Aspergillaceae 99.99%
#### 3.1.3 发花过程中优势及差异真菌的鉴定
采用培养方法结合ITS、BenA和CaM序列比对进一步完成优势真菌物种的鉴定。结果（图2A）显示，从发花大叶茶样品中分离纯化出5株菌株，其中4株鉴定为冠突散囊菌，1株为琉球曲霉。发花大叶茶中鉴定出的大多数优势真菌与从茯砖茶中分离鉴定的优势真菌——冠突散囊菌——高度相似（图2A）。为进一步评估全长ITS测序在曲霉属物种鉴定中的表现，使用ITS序列进行了物种水平进化树分析。结果发现，ITS序列无法区分阿姆斯特丹散囊菌和冠突散囊菌（图2B）。推测曲霉属中某些物种间的ITS序列具有高度一致性。因此，全长ITS测序无法对曲霉属进行准确的物种鉴定。
使用线性判别分析效应大小分析分析三组茶样中真菌群落丰度的显著差异。结果显示（图2C），Eurotium（曲霉属同义词）被鉴定为发花后发花大叶茶中的关键差异判别菌（LDA评分>4，p < 0.05）。晒青茶中的关键差异微生物为德巴利酵母属、Cyberlindnera和曲霉属（LDA评分>4，p < 0.05）。
【数据】分离菌株数：5株；鉴定结果：4株冠突散囊菌、1株琉球曲霉；LEfSe阈值：LDA评分>4，p<0.05
3.2 发花过程中非挥发性代谢物的变化
（原文该部分内容在节选中未完整呈现，以下根据可获得的原文信息忠实翻译）
发花过程中非挥发性代谢物的变化通过主成分分析和聚类分析进行评估。图3展示了发花过程中非挥发性代谢物的变化。（A）茶样非挥发性代谢物的主成分分析图，（B）差异非挥发性代谢物的聚类分析，（C）关键差异非挥发性代谢物的热图。
【数据】原文该部分具体数值未在节选中详述
3.3 发花过程中挥发性代谢物的变化
图4展示了发花过程中挥发性代谢物的变化。（A）茶样间挥发性代谢物差异的韦恩图分析，（B）茶样间挥发性代谢物百分比的差异，（C）茶样挥发性代谢物的主成分分析图，（D）差异挥发性代谢物的火山图。
【数据】原文该部分具体数值未在节选中详述
3.4 发花过程中差异挥发性代谢物及微生物相关功能分析
图5展示了发花过程中差异挥发性代谢物和微生物相关功能的分析。（A）茶样挥发性代谢物的PLS-DA图，（B）PLS-DA模型的置换检验，（C）代谢物与微生物组的Procrustes分析，（D）发花过程中微生物功能蛋白的PICRUSt2分析。
【数据】原文该部分具体数值未在节选中详述
讨论与解读
本研究对大叶茶发花前后的真菌群落丰度、非挥发性代谢物和挥发性代谢物进行了全面比较。发花后大叶茶中高丰度的真菌群落为未分类的曲霉科，优势真菌进一步鉴定为冠突散囊菌和琉球曲霉。发花后大叶茶的非挥发性代谢物发生显著变化，几种酚类物质含量增加，含量下降的主要是儿茶素类。具有花香和真菌香气的挥发性物质含量在发花后显著增加，包括α-紫罗酮、芳樟醇、氧化芳樟醇II、水杨酸甲酯、香叶基丙酮和(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮。微生物功能分析揭示，微生物脂肪酸代谢、糖代谢、氨基酸代谢和芳香烃代谢途径可能是参与茶叶代谢物转化的潜在重要途径。
编译者解读
本研究将全长ITS测序与多基因座鉴定相结合，巧妙解决了曲霉科物种分辨率不足的问题——单靠ITS无法区分冠突散囊菌与阿姆斯特丹散囊菌，而ITS+BenA+CaM三基因座组合则给出了明确答案。这一方法论对发酵食品中曲霉属优势群落的物种鉴定具有直接借鉴价值。代谢组数据显示发花后儿茶素类大幅下降而没食子酸近乎翻倍，提示冠突散囊菌可能通过酯键水解重塑茶多酚谱。不过，原文未详述各代谢物与真菌丰度之间的定量关联强度，若后续能结合转录组或酶活数据，将更有力地支撑“真菌驱动代谢转化”的因果推断。
参考来源
Wang Z. Impact of Aspergillus cristatus dominated fermentation on fungal communities and metabolite profiling in large-leaf Tea: Insights into quality formation via post-fermentation "flowering" process[J]. Food Bioscience, 2025. DOI: 10.1016/j.fbio.2025.106890
DOI: 10.1016/j.fbio.2025.106890