来源：Establishing links between biosynthetic gene clusters in fungi and their secondary metabolites: A case study of Aspergillus（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space
导读
曲霉属真菌基因组中蕴含着远超其可见代谢产物的生物合成基因簇（BGC），大量“孤儿”基因簇的产物仍属未知。本研究整合1,373株曲霉基因组与4,724个已知次生代谢产物（SM），通过antiSMASH注释、BiG-SLiCE聚类和分子网络分析，构建了GCF-BGC与MN-SM双层关联网络，并以海洋来源的黑曲霉L14为实验验证菌株，证实了生物信息学预测的可靠性。研究发现曲霉属中与已知代谢产物关联的GCF不足5%，揭示其巨大的未开发生物合成潜力。
研究背景
真菌中编码特定次生代谢产物的基因通常以生物合成基因簇形式共定位于基因组中。全基因组测序揭示，曲霉属物种所含BGC数量远超实验室条件下观察到的SM数量。例如，黑曲霉NRRL3基因组含有86个预测的SM相关BGC，但迄今仅约13个（约15%）的产物得到确认。对37株黑曲霉基因组的比较分析发现了2,717个BGC，归为455个不同的基因簇家族（GCF），远超这些真菌中已表征的代谢产物数量。这种差异凸显了曲霉属巨大的未开发生物合成潜力，以及大量产物未知的孤儿、沉默或隐性BGC的存在。
与此同时，化学信息学领域致力于组织已知化学空间。Reaxys和MIBiG等数据库保存了数十年的分离数据，但这些资源往往与基因组数据库相互孤立。“代谢组基因组学”——整合基因组与代谢组数据的策略——已成为连接这些不同数据集的有力方法。
研究方法
2.1 基因组数据收集
从美国国家生物技术信息中心（NCBI）Genome数据库下载了曲霉属1,373个基因组组装体的综合数据集（访问日期：2024年10月25日）。保留所有组装体，并批量检索相应的基因组FASTA文件用于下游分析。按照属内分类体系（Houbraken等，2020），根据NCBI物种名称分配组（section）。
2.2 使用antiSMASH进行BGC注释
使用antiSMASH（v7.1.0）对每个基因组组装体进行分析，采用真菌分类单元选项预测推定BGC。为减少碎片化基因组组装造成的假阴性，HMM检测严格度设为relaxed（--hmmdetection-strictness relaxed）。执行了簇级比较注释模块（ClusterBlast和SubClusterBlast，使用默认设置），并启用KnownClusterBlast以促进与已表征簇的比较。对每个基因组，从antiSMASH输出中提取预测BGC的总数和BGC类别分布，用于下游比较分析（Blin等，2023）。antiSMASH基于生物合成结构域特征的规则检测，为每个预测BGC分配一个或多个生物合成“区域类型”。被预测为BGC但缺乏可自信归入主要类别的诊断特征的区域，在antiSMASH输出中标记为“generic”。
2.3 BGC水平的系统发育树构建
使用超矩阵方法构建了系统基因组树。使用BUSCO（v5.8.3）以eurotiomycetes_odb10谱系数据集评估基因组完整性，并从每个基因组中提取单拷贝BUSCO直系同源基因。具有重复BUSCO基因ID的单拷贝直系同源基因跨基因组合并。使用MAFFT（v7.525）比对单拷贝直系同源基因的氨基酸序列，用trimAl（v1.5.1）修剪去除比对不良区域，长度短于500个氨基酸位点的比对在串联前被排除。使用catsequences（v1.5）将剩余修剪后的比对串联成超矩阵。使用IQ-TREE（v3.0.1）进行最大似然系统发育推断，由ModelFinder选择最佳拟合氨基酸替换模型。所得树在iTOL中可视化，外环标注显示来自antiSMASH输出的BGC类别定量分布。
2.4 GCF-BGC网络的构建
为获得大规模BGC簇网络并确保在1,373个曲霉基因组的广泛数据集上的计算可扩展性，使用BiG-SLiCE（v1.0.1）将BGC聚类为GCF。BiG-SLiCE基于生物合成结构域内容将每个BGC编码为特征向量，并使用BIRCH算法进行聚类。聚类使用预定义的距离阈值0.4。解析所得的GCF分配以生成GCF-BGC网络，其中节点代表GCF和单个BGC，边表示每个BGC分配给特定GCF（Kautsar等，2021）。
2.5 基于结构的代谢产物网络（MN-SM）构建
检索了Reaxys收录的、文献报道的曲霉SM（访问日期：2025年4月18日），作为去重复化和MN构建的结构定义参考集。条目通过Reaxys分离来源注释（如“Isolated from Natural Source”）进行过滤；因此，该数据集应被解释为Reaxys收录的已知SM，而非详尽目录。使用Python（v3.9.13）中的RDKit（v2025.03.2）对简化分子输入线输入系统（SMILES）的规范结构信息进行标准化。为构建MN-SM网络，基于Morgan指纹（半径=2，1024位）计算成对结构相似性作为Tanimoto相似性。候选相似性阈值从0.10到0.90（步长0.05）进行评估。对每个阈值，如果化合物的Tanimoto相似性超过该阈值则连接，分子家族定义为所得图的连通分量。最佳阈值结合客观标准与人工检查确定。具体而言，为防止过度合并，监测最大MN的大小，因为它是最易合并的情况，并随机抽样至少3对簇内化合物对进行结构比较，以确认簇内结构一致性。此外，通过测试阈值评估了MN构建的敏感性。最终阈值被选定为能产生可解释的MN，同时为下游比较分析保持足够分辨率。
2.6 MIBiG已知BGC与SM关联的注释
从MIBiG数据库（v4.0）检索了经过验证的BGC-SM对。这些参考数据作为锚点，连接基因组空间与化学空间（Blin等，2025）。从MIBiG JSON文件中提取化合物名称、SMILES结构、相关BGC序列、MIBiG标识符等信息。对于曲霉SM列表中的每个化合物，通过比较SMILES结构或化合物名称检查MIBiG中的匹配记录，如果找到相应的BGC，则该途径被认为是“已知的”。
2.7 GCF × MN评分矩阵的构建与GCF比率的计算
为将基因组潜力的GCF与化学多样性的MN连接起来，在Python中实施了基于评分的网络策略。构建了联合评分矩阵以评估每个GCF与每个曲霉MN之间的关联。评分算法由连通性驱动。由于MN代表分子家族（结构相似化合物的连通分量），所得的GCF × MN连接应被解释为家族水平关联，而非对单一精确结构的一对一分配。主要内容：（i）数据来源与评分文件：GCF-BGC网络评分文件（文件A）包含来自GenBank的GCF ID和曲霉BGC登录号。MN-SM网络评分文件（文件B）使用MN标识符，MN编号按从左到右、从上到下的顺序分配。文件B中的BGC登录号被替换为MIBiG注释的BGC-SM，这些通过MIBiG JSON文件与GenBank登录号连接。（ii）共享锚点评分与实施：去除重复边后，设Ag为文件A中GCFg的BGC登录号集合，Bm为文件B中与MNm连接的MIBiG来源BGC GenBank登录号集合（存储在“SM”列中）。定义方程（1）和GCF × MN评分矩阵方程（2）：
(1) k(g,m) = |Ag ∩ Bm|
(2) S(g,m) = 20 × k(g,m)
除评分矩阵外，还输出长格式证据表，列出支持每个非零(g,m)对的锚点ID，以促进检查潜在的假阳性/假阴性（见补充材料）。（iii）GCF比率的计算：分析GCF-BGC网络，识别与至少一个在GCF × MN评分矩阵中具有匹配分数的BGC相关的GCF，以计算GCF比率。对每个GCF，如果其任何BGC有分数，则该整个GCF被视为“已知”。随后，通过将未知GCF数除以GCF总数，计算保持“未知”（即未与当前参考集中的任何已知SM连接）的GCF比率。该比率用于估计曲霉物种中尚未在现有数据库中与产物关联的生物合成潜力比例，因此可能不意味着存在新型SM。
2.8 支持曲霉代谢潜力生物信息学预测的实验证据
为验证生物信息学分析结果（即曲霉具有巨大的生物合成潜力）的可靠性，对一株海洋来源真菌黑曲霉L14进行了系统的回顾性分析。对其全基因组鸟枪法测序数据进行了分析。
研究结果
3.1 曲霉基因组聚合与系统发育树分析
系统基因组树由IQ-TREE从包含1,373个分类单元和169,342个氨基酸位点的串联超矩阵推断而来。ModelFinder选择Q.YEAST + I + R5作为最佳拟合氨基酸替换模型。将每个菌株的BGC丰度数据整合到系统发育树中，以检查次生代谢潜力的系统发育分布。每个菌株均通过antiSMASH分析。在每个菌株的外圈，用不同颜色和高度标记BGC的类型和数量，以一目了然地比较各菌株的BGC信息。计算了所有菌株中antiSMASH预测的BGC类型频率。前15种BGC类型用各种颜色标记，其余低频BGC类型统称为“Other”（聚合的低频类别），以黑色标记（图1）。BGC类型包括I型聚酮合酶（T1PKS）、核糖体肽合成酶（NRPS）、萜烯等。值得注意的是，物种众多的组（如Nigri、Flavi）形成了最大的分支，而仅由一个或少数物种代表的组则相应分支。总体上，antiSMASH分析从1,373个基因组中预测了66,316个BGC。每个基因组的簇数差异很大，范围从1到108个BGC。例如，一株塔宾曲霉（A. tubingensis）含有108个簇，为观察到的最高值。多个其他Nigri组成员，如黑曲霉（A. niger）和A. latus，也携带异常庞大的BGC补体，通常超过80个簇。相比之下，一些基因组显示出小得多的SM库，最低的是一株A. cristatus菌株，仅检测到1个BGC。总体而言，大多数基因组编码数十个簇，强调即使产量最少的曲霉仍具有一定次生代谢能力。总BGC数包括多种生物合成类型，主要类别概括如下：PKS簇约14,900个，绝大多数为I型PKS途径，另有较小的III型PKS亚组（683个簇）；NRPS簇约11,200个经典NRPS簇，加上约11,900个NRPS样基因簇，这些NRPS相关簇共同代表了次生代谢组中最重要的部分之一；萜烯合酶簇约7,364个，反映环状萜烯和meroterpenoids的基因。特别是，在全属中鉴定出约4,700个PKS-NRPS杂合簇（即同时含PKS和肽合成酶组分的基因簇）。许多基因组还含有其他类型的杂合簇（例如，观察到PKS-萜烯、NRPS-萜烯和PKS-吲哚组合），反映真菌组装复杂多模块途径的倾向。这些杂合BGC对每个基因组编码的SM整体多样性贡献显著。这种系统基因组学视角使我们能够将进化关系与SM潜力联系起来。将总BGC数映射到系统发育上，突出了分支特异性趋势。组水平比较显示，主要曲霉组之间的BGC和GCF丰富度均存在显著差异（见补充材料）。例如，Nigri组的每基因组BGC/GCF中位数高于Flavi和Fumigati组。总体而言，稳健的物种系统发育与全面的BGC谱分析相结合，支持了曲霉属生物合成能力的组特异性趋势。
3.2 BGC聚类分析与GCF-BGC网络的建立
获得曲霉系统发育树后，使用BiG-SLiCE将所有预测BGC聚类为不同的GCF，以整理大型BGC数据集。每个GCF代表一组序列组成和功能相似的BGC，通常编码一类具有相似骨架结构的代谢产物。聚类前，结果发现1,373株曲霉菌株含有66,316个BGC，可分类为5,617个GCF。大多数GCF由几十个高度相似的BGC组成，也存在许多大型GCF，包含多株菌的BGC，可能代表曲霉中广泛存在的重要代谢途径。聚类过程中允许杂合簇，例如PKS和NRPS模块的混合方法，可归入多个GCF，更好地反映这些簇的复杂性（Robey等，2021）。聚类分析后，有64,096个BGC和3,742个GCF参与网络图构建，2,220个BGC和1,875个GCF未参与网络图绘制。这些GCF如图2A所示，标注了其功能与比例。为更直观地呈现聚类结果，构建了GCF-BGC网络图（图2B，见补充材料），其中GCF与BGC之间的关系及其分类见补充材料。在该网络中，每个节点代表一个BGC，边连接节点，边的紧密程度反映BGC之间的相似性。基因组成高度相似的BGC紧密连接形成家族，线条的深浅和粗细代表每个BGC与其所属GCF之间的相关性。该方法提供近线性可扩展性，同时不损害生物学相关性（Kautsar等，2021）。簇大小差异很大，从数百个成员的大型家族到单例。具体而言，689个GCF（18.4%）是仅含一个BGC的单例，而大多数（81.6%）GCF包含多个BGC。平均每个GCF包含约17个BGC，突出簇大小的偏斜分布。少数GCF成员特别多，而其他大多数规模较小。这种不均匀分组强调了数据集中生物合成途径的整体多样性。特别是，最大的GCF包含1,317个BGC，被注释为β-内酯生物合成簇家族。第二大GCF含1,186个BGC，主要由NRPS样基因簇组成（可能包括铁载体途径）。第三大GCF含924个BGC，主要分类为generic簇（基于特征无法自信归入主要生物合成类别的预测BGC）。总体上，GCF因此可归类为熟悉的SM类别，包括NRPS样（肽）簇、T1PKS、III型PKS（T3PKS）等。这种按核心生物合成结构域对GCF的分类提供了SM潜力的概览：少数类别（如NRPS样和PKS簇）主导最大和最保守的家族，而更多特定类别出现在较小的家族中。总之，通过BiG-SLiCE聚类和网络分析，曲霉中数万个BGC成功按其功能聚类为数千个GCF，并建立了GCF-BGC网络，使我们能够更好地理解曲霉中GCF的功能多样性和分布，为天然产物发现提供线索。
3.3 SM聚类分析与MN-SM网络的构建
为理解已知曲霉SM之间的关系，收集并整理了Reaxys数据库中所有关于曲霉SM的信息。Reaxys返回了4,789条标注为从曲霉分离的记录。去除无明确SMILES的条目后，保留4,724个具有SMILES的SM用于进一步分析。使用分子指纹和Python脚本，化学信息学方法计算了两个化合物之间的Tanimoto相似性系数。通过以相同间隔（0.10–0.90，步长0.05）设置相似性阈值，分析了17个脚本结果以确定最佳Tanimoto阈值。然后构建了MN-SM网络图。
3.4 通过共现评分连接GCF-BGC与MN-SM网络
3.5 与已知SM生物合成途径相关的GCF统计汇总
3.6 黑曲霉L14在不同培养条件下的生长特性及其生物合成潜力验证
为验证黑曲霉L14的生物合成潜力，研究了其在不同培养条件或与其他真菌共培养实验下的生长特性。黑曲霉L14在水稻固体培养基上生长（图6A），在静态液体培养基中生长（图6B）。通过OSMAC策略和全局转录机器工程（gTME），黑曲霉L14被证明能产生非寻常的聚酮类和非核糖体肽类化合物。这些实验结果验证了生物信息学分析预测的可靠性——即曲霉具有巨大的未被开发的生物合成潜力。
【数据】菌株：黑曲霉L14；培养条件：水稻固体培养基、静态液体培养基；激活策略：OSMAC、gTME；产物类型：非寻常聚酮类、非核糖体肽类
讨论与解读
本研究以曲霉属为范例，实施了一套整合的生物信息学工作流程来评估其次生代谢潜力。分析过程包括建立曲霉系统发育树、构建GCF-BGC和MN-SM网络，以及利用MIBiG数据库评估每个GCF与每个MN之间的锚点共现评分。最终，研究发现曲霉中与MN相关的GCF不足5%，表明曲霉具有巨大的代谢潜力，主要涉及PKS和NRPS途径。为增强生物信息学分析的可靠性，通过实验验证了分析结果，证明曲霉可通过不同激活方法（OSMAC、共培养等）产生非寻常的聚酮类和非核糖体肽类SM，从而证实了生物信息学分析的可靠性。该研究促进了新型真菌SM的发现，并为菌株工程和发酵优化提供了路线图，以可持续生产高价值生物基化学品。
【数据】GCF与MN关联比例：<5%；主要途径：PKS、NRPS；验证方法：OSMAC、共培养
编译者解读
本研究展示了“基因组-代谢组”双层网络策略在真菌天然产物挖掘中的系统化应用。其方法学亮点在于将大规模基因组数据（1,373株）与化学数据库（Reaxys）通过MIBiG锚点进行家族水平关联，以不足5%的已知关联比例定量揭示了曲霉属的巨大生物合成暗物质。实验验证部分选择OSMAC与gTME策略激活沉默基因簇，体现了计算预测与实验激发策略的衔接。局限在于Reaxys收录的SM偏向已知化合物，可能低估实际关联比例；且GCF-MN关联仅为家族水平，精确到具体化合物的映射仍需后续验证。该框架为其他微生物属的BGC-SM关联研究提供了可移植的技术范式。
参考来源
Ying J. Establishing links between biosynthetic gene clusters in fungi and their secondary metabolites: A case study of Aspergillus. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134535
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134535