适应性实验室进化提升酿酒酵母丁酸耐受性并实现与丁酸梭菌共培养

📅 2026-08-16 📰 Microb Cell Fact 2026 Aug 3 📂 研究进展 👁 19

来源：Adaptive laboratory evolution of Saccharomyces cerevisiae enhances butyric acid tolerance and enables co-cultivation with Clostridium tyrobutyricum.（Microb Cell Fact）| 编译：DNA Lab Space

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导读

丁酸作为重要的工业平台化合物，其微生物发酵生产常受限于产物抑制效应。本研究采用适应性实验室进化策略，将酿酒酵母逐步驯化至耐受20 g/L丁酸，进化后的BA20菌株在10 g/L丁酸胁迫下乙醇生产力较野生型提升近3倍。全基因组测序揭示突变涉及调控过程、细胞稳态及膜/细胞壁重塑相关基因。将进化酵母与丁酸梭菌共培养，实现了乙醇与丁酸的分工合成，补料分批发酵获得20.31 g/L丁酸和28.18 g/L乙醇，乙醇浓度较野生型共培养提高4倍。

研究背景

生物技术过程的效率提升对减少化石资源依赖至关重要。此前研究已构建了丁酸梭菌与酿酒酵母的共培养体系，结合酶法酯化和原位萃取，乙基丁酸浓度可达24 g/L。然而，酵母有限的酸耐受性成为该体系的瓶颈——有机酸积累导致胞内酸化及代谢压力，迫使工艺需先培养酵母再接种产酸菌，延长了整体流程。适应性实验室进化（ALE）为提升酿酒酵母酸耐受性提供了可行路径。本研究旨在通过ALE策略获得丁酸耐受型酵母，并评估其与丁酸梭菌共培养生产酯前体（乙醇与丁酸）的可行性。

研究方法

微生物菌株

丁酸梭菌DSM 2637和酿酒酵母DSM 3799购自德国微生物菌种保藏中心（DSMZ，Braunschweig，德国）。梭菌细胞在含40%甘氨酸水溶液的厌氧条件下于-80°C保存；酵母细胞在相同温度下有氧保存。野生型酿酒酵母作为适应性实验室进化的亲本菌株。

培养基与培养条件

酿酒酵母预培养以1%（v/v）冷冻培养物接种。预培养在300 mL带挡板摇瓶中于有氧条件下进行，每瓶含100 mL预培养培养基，在摇床培养箱（Infors HAT, Ecotron, Infors AG, Bottmingen, Switzerland）中32°C、150 rpm培养17小时。YPG培养基作为预培养培养基，每升含：10 g酵母提取物、20 g蛋白胨和20 g葡萄糖。

酵母酸耐受性通过不同丁酸浓度下的生长、葡萄糖消耗和乙醇产量进行评估。主培养以10%（v/v）酵母预培养物接种，在150 mL血清瓶（工作体积100 mL）中37°C、150 rpm培养，瓶口以丁基橡胶塞和铝盖密封，置于培养箱中。选择37°C以匹配共培养条件。已有研究表明32°C与37°C的温度差异对酿酒酵母乙醇产量无显著影响。主培养使用YPG培养基或补充不同浓度丁酸的YPG培养基。所有酵母培养中，初始葡萄糖浓度为50 g/L，初始pH设为6.0，培养过程中不控制pH。

最大生产力Pmax和最大葡萄糖消耗速率rs,max按相邻数据点间的最大斜率计算。比速率（qs和qP）基于所考虑时间区间内的平均生物量确定。生物量计算中，细胞干重（CDW）根据实验确定的光密度（OD）与CDW线性相关性估算（CDW = 0.35·OD + 0.05，R² = 0.99）。

丁酸梭菌预培养在厌氧条件下于150 mL血清瓶中进行，每瓶含100 mL改良PY+X培养基。改良PY+X培养基每升含：10 g酵母提取物、5 g肉蛋白胨、5 g胰蛋白胨、5 g葡萄糖和40 mL盐溶液。盐溶液每升含0.25 g CaCl₂·2H₂O、0.50 g MgSO₄·7H₂O、1 g KH₂PO₄、1 g K₂HPO₄、10 g NaHCO₃和2 g NaCl。通过添加1 M HCl溶液将pH校正至5.5。为确保厌氧条件，培养前培养基用氮气吹扫30分钟。预培养以1%（v/v）冷冻培养物接种，在摇床培养箱中150 rpm、37°C培养24小时。

酵母适应性实验室进化策略

野生型酿酒酵母菌株（DSM 3799）作为ALE的亲本菌株。ALE通过反复连续转接并逐步提高酸浓度进行。

▲ 用于提高酿酒酵母丁酸耐受性的适应性实验室进化（ALE）策略示意图；BA：丁酸

首先，在300 mL摇瓶中用100 mL YPG预培养培养基、32°C、150 rpm条件下以1%（v/v）野生型酵母菌株培养预培养物。后续酵母细胞ALE也在摇瓶中于有氧条件下进行，以最大化细胞生长并增加ALE期间积累的世代数。YPG培养基作为基础培养基，根据各选择阶段加入指定浓度的丁酸（pH₀ = 6.0）。从5 g/L丁酸开始，每个选择阶段浓度增加1 g/L，共16个选择阶段。培养24小时后，部分发酵液在4500 rpm离心2分钟（Centrifuge Z383K, Hermle Labortechnik GmbH, Wehingen, Germany）。沉淀用0.9% NaCl溶液洗涤两次，然后重悬于丁酸浓度提高1 g/L的新鲜YPG培养基中。离心前调整培养体积，使每个新胁迫阶段开始时初始光密度约为1，确保起始条件可比。每个选择阶段，部分种群以细胞库形式保存，获得适应酵母种群BA5–BA20。细胞库制备方法：将0.5 mL细胞悬浮液与0.5 mL 80%（v/v）甘油溶液在冻存管中混合，于-80°C保存。世代数根据光密度（OD）测量按公式（1）计算：

n = ln(OD终/OD始) / ln2

基因组测序

对野生型酵母菌株、种群BA9和种群BA20的基因组DNA进行Illumina全基因组测序分析。将ALE实验中的冷冻保存细胞在含20 g/L葡萄糖的YPG培养基中、300 mL带挡板摇瓶（每瓶100 mL培养基）中32°C、150 rpm培养至指数生长期（17小时），然后离心并用0.9% NaCl洗涤两次。所得细胞沉淀保存在Eppendorf管中于-80°C存放，随后干冰运输。文库制备、测序、读段比对和生物信息学分析由Novogene Co., Ltd（Martinsried, Germany）完成。Novogene提供的详细技术信息已包含在补充材料中。BA9和BA20的测序读段比对到本研究构建的野生型亲本菌株的de novo组装基因组上，作为变异检测的参考序列。为鉴定与丁酸胁迫适应相关的遗传变化，单核苷酸多态性（SNPs）和结构变异根据其在不同种群间的频率动态进行筛选。由于BA9和BA20作为进化种群而非克隆分离株进行测序，基因型判定在种群水平而非单个克隆水平进行解读。特别关注在野生型中不存在、在BA9中以中等频率出现、并在BA20中达到固定或接近固定的突变，这表明其在适应性进化过程中逐渐富集。进一步数据分析使用g:Profiler完成。

共培养

酿酒酵母与丁酸梭菌的共培养在pH控制条件下进行：pH 6.0、37°C、200 rpm，使用1 L规模生物反应器（HABITAT Research Bioreactor Systems, IKA Werke GmbH & Co. KG, Staufen im Breisgau, Germany）。使用Engel等人描述的MP2opt培养基，这是基于P2培养基优化的合成梭菌培养基。培养基每升含1.9 g (NH₄)₂SO₄、0.5 g KH₂PO₄、0.5 g K₂HPO₄、0.2 g MgSO₄·7H₂O、0.015 g Fe(II)SO₄·7H₂O、0.01 g MnSO₄·xH₂O和1 mL维生素溶液。维生素溶液每升含2 mg 4-氨基苯甲酸、2 mg硫胺素HCl和0.01 mg D-生物素。共培养以补料分批方式进行，初始葡萄糖浓度为50 g/L，整个发酵过程中通过连续补料将葡萄糖浓度维持在约20至40 g/L之间。

▲ Comparison of cultivation performance under 10 g L¯ 1 butyric acid stress between the wild-type ( A – C ) and the evolved BA20 cells ( D – F ). V = 100 mL; sealed serum bottles; T = 37°C; 150 rpm; pH₀ = 6.0; n = 3

【数据】菌株：酿酒酵母DSM 3799、丁酸梭菌DSM 2637；预培养：1% v/v接种，32°C（酵母）/37°C（梭菌），150 rpm，17 h（酵母）/24 h（梭菌）；主培养：10% v/v接种，37°C，150 rpm，初始葡萄糖50 g/L，pH₀ 6.0；CDW相关性：CDW = 0.35·OD + 0.05，R² = 0.99；ALE：起始丁酸5 g/L，每阶段递增1 g/L，共16阶段，每阶段24 h转接，4500 rpm离心2 min，0.9% NaCl洗涤两次，初始OD约1；细胞库：0.5 mL细胞悬液+0.5 mL 80%甘油，-80°C保存；共培养：pH 6.0，37°C，200 rpm，1 L反应器，MP2opt培养基，初始葡萄糖50 g/L，维持20-40 g/L

研究结果

耐酸酵母的开发

前期研究表明，酿酒酵母在与丁酸梭菌共培养中的表现受限于其对丁酸的低耐受性。在低至5 g/L浓度时即观察到抑制效应，15 g/L时乙醇生产几乎完全被抑制。为解决这一限制，本研究在明确选择压力下对酿酒酵母进行ALE以增强其丁酸耐受性。基于酸胁迫耐受性筛选，ALE以5 g/L丁酸的选择压力启动。进化持续15次连续转接，每次递增1 g/L，最终达到20 g/L的酸浓度（选择水平SL5-20）。酵母细胞在培养24小时后转接至下一选择水平。进化酵母种群根据其进化过程中施加的丁酸浓度命名为BA5-BA20。各选择水平的生长通过光密度（OD）监测。

▲ 不同选择压力（SL）下酿酒酵母在丁酸浓度递增过程中的适应性实验室进化（ALE）生长情况。SL编号表示丁酸浓度（g L⁻¹）。A SL05–SL13；B SL13–SL20。虚线表示转接至新SL的时间点。YPG培养基中添加丁酸；V = 100 mL；T = 32°C；150 rpm；pH₀ = 6.0；好氧条件；n = 3

随着ALE过程中选择压力的增加，观察到生长逐渐下降，选择水平9为例外——该水平出现显著生长下降。基于OD测量，ALE全程共进化约25代，反映了胁迫条件下的有限生长。在如此严苛的胁迫条件下，大部分种群难以存活，仅剩部分存活细胞贡献生长。这种情况下，进化适应可能更多地受细胞存活而非细胞复制驱动。

为进一步了解ALE过程中的动态变化，还分析了产物形成和底物消耗。在任何ALE水平均未检测到高浓度副产物，如甘油（最高2 g/L）或乙酸（最高0.5 g/L）。

▲ 不同选择水平(SL)下、丁酸浓度递增的ALE中底物消耗与产物形成。A 乙醇生产；B 葡萄糖消耗。SL编号表示丁酸浓度(g L⁻¹)。具体数值表示24小时时单位生物量的产物形成和底物消耗。CDW由OD相关性得出。YPG培养基添加丁酸；V = 100 mL；T = 32°C；150 rpm；pH₀ = 6.0；好氧条件；n = 3。

在7 g/L酸浓度下，乙醇生产和底物摄取出现明显下降，这是对升高胁迫条件的响应。ALE早期阶段观察到的显著波动可能反映了种群异质性或酸胁迫增加下的瞬时生理不稳定性。在后续选择水平11-20中，比乙醇产量和葡萄糖消耗稳定在恒定水平，而绝对乙醇产量和底物消耗下降。这一观察可能表明，能够在高酸浓度下维持代谢活性的耐胁迫亚群被逐步筛选出来。然而，升高的酸浓度限制了生物量形成，导致绝对乙醇产量和底物消耗下降。

每个ALE阶段的细胞均经冷冻保存、在非选择性预培养中复苏，随后在含10 g/L丁酸的培养基中培养，以比较其在恒定胁迫水平下对丁酸的适应性。

▲ Evaluation of acid tolerance at different stages of ALE; P 24h represents the average volumetric ethanol productivity calculated over a 24 h interval; asterisks indicate significant differences compared to the wild-type strain (p < 0.05);YPG medium supplemented with 10 g L¯ 1 butyric acid; V = 10

进化种群的乙醇产量最初低于野生型，但在ALE过程中逐步上升。这一初始下降可能归因于细胞来自胁迫条件，尚未对所处环境达到最优适应，导致性能降低。随后，随着ALE过程中有利突变的积累，耐受性逐步改善，最终筛选出更具耐受性的酵母种群。值得注意的是，乙醇时空产率自BA9起显著提升，达到0.77 ± 0.01 g/L/h，是前一ALE水平产率的2倍。结合SL9期间观察到的生长和产量变化，中间种群BA9可能代表适应过程中的一个过渡阶段。与野生型相比，进化种群BA7-BA20在丁酸胁迫下乙醇生产力显著增强，确认适应成功（p < 0.05，Welch's t检验，独立样本）。进化终种群BA20细胞还在不同丁酸浓度下进行了额外测试，并与野生型细胞进行了比较。图5直接比较了生长、乙醇产量和葡萄糖消耗。由于副产物（如乙酸和甘油）浓度较低（< 0.5 g/L），为清晰起见未在图中展示。

▲ 进化后的BA20细胞的表型稳定性。A 生长曲线；B 葡萄糖消耗和乙醇产量。V = 100 mL；T = 37°C；150 rpm；pH₀ = 6.0；厌氧条件；n = 3

总体而言，进化酵母种群BA20在酸胁迫下表现出显著增强的生产力（见表2）。

表2 野生型与BA20细胞在不同丁酸（BA）浓度下的最大底物消耗速率（rs,max）和最大生产力（Pmax）比较

|------------|------------------------|---------------------|--------------------------|-----------------------|

| 0 | 6.56 ± 0.50 | 2.91 ± 0.04 | 8.44 ± 0.24 | 4.02 ± 0.06 |

| 5 | 2.87 ± 0.44 | 1.49 ± 0.03 | 5.48 ± 0.09 | 2.91 ± 0.22 |

| 10 | 0.72 ± 0.44 | 0.41 ± 0.02 | 2.28 ± 0.44 | 1.14 ± 0.04 |

| 15 | 0.29 ± 0.17 | 0.25 ± 0.01 | 0.50 ± 0.28 | 0.35 ± 0.03 |

值得注意的是，进化种群即使在无酸胁迫条件下也表现出加速的乙醇生产，最大乙醇生产力显著提高。同样，无酸条件下最大葡萄糖消耗速率也观察到增加。这表明对酸胁迫的适应不仅提高了丁酸耐受性，还增强了乙醇生产。此外，BA20在5 g/L丁酸条件下维持了乙醇生产，与无胁迫条件无显著差异。酸胁迫进一步增加导致乙醇产量下降。然而，在15 g/L丁酸条件下，BA20产生的乙醇浓度约为野生型在相同胁迫条件下的2倍（c乙醇,BA20 = 6.25 ± 0.25，c乙醇,WT = 3.04 ± 0.10）。此外，还观察到野生型和进化种群BA20在生长大幅下降的情况下仍产生高浓度乙醇，这促使对比消耗和比生产力进行比较（表3）。

表3 野生型与BA20细胞在不同丁酸（BA）浓度下的最大比底物消耗速率（qs,max）和最大比生产力（qP,max）比较。CDW由OD相关性推导

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（注：表3数值数据在原文节选中不完整，此处仅列框架）

▲ 酿酒酵母BA20与酪丁酸梭菌共培养；A 光密度与葡萄糖消耗；B 产物生成；§Mp2opt培养基；V = 1 L；T = 37°C；200 rpm；NaOH控制pH为6；n = 3

【数据】ALE：起始5 g/L丁酸，递增至20 g/L，共16个选择水平，约25代；副产物：甘油最高2 g/L，乙酸最高0.5 g/L；BA9乙醇时空产率：0.77 ± 0.01 g/L/h（为前一水平的2倍）；BA7-BA20乙醇生产力显著增强（p < 0.05）；BA20 vs WT最大乙醇生产力（无酸胁迫）：4.02 ± 0.06 vs 2.91 ± 0.04 g/L/h；BA20 vs WT最大葡萄糖消耗速率（无酸胁迫）：8.44 ± 0.24 vs 6.56 ± 0.50 g/L/h；15 g/L丁酸下乙醇浓度：BA20为6.25 ± 0.25 g/L，WT为3.04 ± 0.10 g/L

共培养结果

（注：共培养结果部分在原文节选中未完整呈现，但根据摘要，补料分批共培养获得20.31 ± 2.43 g/L丁酸和28.18 ± 3.37 g/L乙醇，乙醇浓度较野生型提高4倍。）

【数据】共培养：补料分批，丁酸产量20.31 ± 2.43 g/L，乙醇产量28.18 ± 3.37 g/L；与野生型相比乙醇浓度提高4倍

讨论与解读

本研究通过逐步增加丁酸胁迫下的连续转接，成功驱动了酿酒酵母的适应性实验室进化，获得了酸耐受性增强的酵母菌株。进化终种群BA20对丁酸的耐受性显著提高，在高达10 g/L浓度下仍能维持乙醇生产而无明显抑制。ALE过程中酸耐受性逐步增强，与越来越耐受的亚群被选择一致。选择水平9出现的生长下降与BA9细胞在丁酸胁迫下乙醇生产力的提升同时发生，可能表明存在强烈偏好丁酸耐受表型的选择压力。与涉及更多世代数的常规长期ALE实验相比，本研究在相对有限的世代数内完成。与许多报道的ALE策略不同——这些策略调整转接间隔以允许恢复并最大化各选择水平下的世代数——本实验设计维持了持续的高选择压力。由此导致的生长减少和较低的世代数表明，进化适应在该情境下可能更多由细胞存活而非复制驱动。

全基因组变异分析提示适应可能与调控过程、细胞稳态、膜和细胞壁重塑的变化相关。与产酸菌丁酸梭菌的共培养展示了高效且平衡的底物利用，表明两种生物之间存在稳定的劳动分工。

编译者解读

本研究展示了ALE在工业菌株改良中的实用价值——不依赖基因工程手段，仅通过定向选择压力即可获得耐受性显著提升的菌株。值得注意的是，进化后的酵母不仅获得了酸耐受性，还在无胁迫条件下表现出更高的乙醇生产速率，提示耐受性进化可能伴随代谢通量的全局重排。从合成生物学应用角度看，该策略避免了转基因生物的相关监管障碍，具有直接工业转化潜力。然而，研究也存在局限：进化种群而非单克隆的测序策略虽能捕捉群体水平动态，但难以精确定位因果突变；约25代的有限进化代数可能未充分挖掘耐受性提升空间。未来若能将基因组数据与代谢模型整合，有望进一步解析耐受机制并指导理性改造。

参考来源

Oehlenschläger K, Bauschatz S, Schepp E, Holtmann D, Ulber R. Adaptive laboratory evolution of Saccharomyces cerevisiae enhances butyric acid tolerance and enables co-cultivation with Clostridium tyrobutyricum. Microb Cell Fact. PMID: 42547894. DOI: 10.1186/s12934-026-03078-8.

PMID: 42547894

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