来源：Coordinated regulation of fungal development and secondary metabolism by R2R3-Myb transcription factors AsMyb1 and AsMyb3 in Aspergillus sydowii H-1（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space
导读
丝状真菌是可持续生物制造的重要微生物底盘。本研究鉴定出A. sydowii H-1中的两个R2R3-Myb转录因子AsMyb1和AsMyb3，证实它们通过转录和转录后双重机制协同调控真菌的无性产孢、菌丝形态、氧化还原稳态及以大黄素为代表的蒽醌类次生代谢。敲除Asmyb3和Asmyb1分别使大黄素产量提升3.21倍和1.65倍，为蒽醌类药物绿色生产提供了新的工程靶点。
研究背景
丝状真菌因其强大的次生代谢产物合成能力、高效的遗传操作体系和丰富的底物供给，已成为可持续生物制造的重要微生物底盘。A. sydowii是一种嗜盐丝状真菌，可产生生物碱、氧杂蒽酮、萜类、蒽醌类和甾醇等多种结构多样的次生代谢物，其中许多具有显著的药理和生物技术应用潜力。研究者此前从中国成都分离获得A. sydowii H-1菌株，发现其能产生具有抗菌、抗氧化和抗肿瘤活性的紫色色素。
蒽醌类化合物经由真菌聚酮途径合成，以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物，由非还原型聚酮合酶催化形成核心结构。大黄素作为天然蒽醌衍生物，因其抗癌、抗炎、抗病毒等广泛药理活性而备受关注。然而，调控真菌发育与次生代谢偶联的转录因子网络尚未阐明。本研究聚焦于A. sydowii H-1中R2R3-Myb转录因子AsMyb1和AsMyb3的功能解析。
研究方法
2.1 真菌菌株、培养基与培养条件
2.1.1 菌株活化
A. sydowii H-1菌株取自四川省典型培养物保藏中心，从−80°C冰箱取出后接种于PDA固体培养基（马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L），于28°C培养3–4天。用棉签刮取新鲜孢子并悬浮于无菌水中备用。
【数据】菌株：A. sydowii H-1；培养基：PDA（马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L）；温度：28°C；时间：3–4天
2.1.2 种子培养
取200 μL孢子悬浮液接种于200 mL种子培养基（NaNO₃ 2 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO₄ 0.01 g/L、果糖30 g/L），于28°C、180 rpm振荡培养36小时，获得新鲜种子培养物。
【数据】接种量：200 μL孢子悬液；培养基成分：NaNO₃ 2 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO₄ 0.01 g/L、果糖30 g/L；温度：28°C；转速：180 rpm；时间：36 h
2.1.3 发酵培养
取10 mL种子培养物接种于200 mL发酵培养基（葡萄糖5 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、酵母提取物0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、蛋白胨3 g/L，简称FM），于28°C、180 rpm振荡发酵8天。每个菌株设置三个生物学重复。
【数据】接种量：10 mL种子液/200 mL培养基；培养基成分：葡萄糖5 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、酵母提取物0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、蛋白胨3 g/L；温度：28°C；转速：180 rpm；时间：8天；重复数：3个生物学重复
2.2 全局非靶向代谢组学分析
采用常规代谢组学方法，由武汉迈特维尔生物科技有限公司进行代谢物谱分析。将保存于−80°C的样品（第4天发酵液）解冻，涡旋混匀10秒，取200 μL等份与等体积70%甲醇（含内标）提取。涡旋（15分钟，4°C）后离心（12,000 rpm，3分钟，4°C），上清液经0.22 μm滤膜过滤后进行LC-MS/MS分析。
UPLC条件：采用UPLC-ESI-MS/MS系统（ExionLC™ AD，SCIEX），配备Agilent SB-C18色谱柱（1.8 μm，2.1 × 100 mm）。流动相为含0.1%甲酸的水溶液（A）和乙腈（B）。梯度洗脱程序（0–9分钟：95–5% A；9–10分钟：5% A；10–11.1分钟：95% A；11.1–14分钟：95% A），流速0.35 mL/min，柱温40°C，进样量2 μL。
ESI-Q TRAP-MS/MS条件：离子源温度500°C，电压5500 V（正离子模式）/−4500 V（负离子模式）；气体GSI、GSII和气帘气压分别为50、60和25 psi。碰撞诱导解离设为高能量，MRM转换参数经单独优化。
【数据】样品：第4天发酵液；提取液：70%甲醇（含内标）；涡旋：15 min，4°C；离心：12,000 rpm，3 min，4°C；过滤：0.22 μm；色谱柱：Agilent SB-C18（1.8 μm，2.1 × 100 mm）；流动相：0.1%甲酸水/乙腈；流速：0.35 mL/min；柱温：40°C；进样量：2 μL；离子源温度：500°C；电压：5500 V/−4500 V
2.3 敲除和过表达菌株的构建
通过同源重组用潮霉素抗性 cassette 替换靶基因部分区域，实现Asmyb1和Asmyb3编码基因的敲除。上游和下游同源臂及潮霉素抗性基因使用补充文件（表S3）中提供的引物进行扩增。三个片段使用2× Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix（Yeasen，10922ES20，中国）连接至prf-HU2载体。过表达菌株通过将全长基因（含终止密码子）克隆至prf-HU2-eGFP质粒构建。重组酶连接后，质粒转化至DH5α，获得成功的敲除和过表达载体。
敲除和过表达载体均通过农杆菌介导转化整合至A. sydowii H-1基因组。载体转化至农杆菌AGL-1感受态细胞，于28°C、180 rpm振荡培养至OD600nm为0.8，5000 rpm离心收集，重悬于IM培养基（KH₂PO₄ 1.45 g/L、K₂HPO₄ 2.05 g/L、NaCl 0.15 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.50 g/L、CaCl₂ 0.067 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.0025 g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.50 g/L、葡萄糖2.00 g/L、MES 8.54 g/L、甘油5.00 g/L、200 μM乙酰丁香酮（As））至终OD600nm为0.2。在IM培养基中于28°C、180 rpm振荡培养至OD600nm达0.8。同时，A. sydowii H-1在PDA培养基上培养3–4天。随后，将100 μL AGL-1（含载体）与100 μL孢子悬浮液（1 × 10⁸孢子/mL）混合，涂布于含200 μM As的IM固体培养基上，覆盖5 × 5 cm尼龙转印膜，于25°C避光培养48小时。之后将膜切成0.5 × 5 cm条带，倒置于含100 μg/mL噻孢霉素、100 μM链霉素和200 μM头孢霉素的PDA培养基上，于28°C培养4–6天。通过基因组PCR验证敲除和过表达菌株，并在含200 μg/mL潮霉素的PDA培养基上二次筛选转化子。
【数据】转化方法：农杆菌介导转化；农杆菌菌株：AGL-1；OD600nm：0.8（培养）/0.2（重悬终浓度）；IM培养基成分：KH₂PO₄ 1.45 g/L、K₂HPO₄ 2.05 g/L、NaCl 0.15 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.50 g/L、CaCl₂ 0.067 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.0025 g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.50 g/L、葡萄糖2.00 g/L、MES 8.54 g/L、甘油5.00 g/L、200 μM As；孢子浓度：1 × 10⁸孢子/mL；共培养：25°C，48 h，避光；筛选抗生素：100 μg/mL噻孢霉素、100 μM链霉素、200 μM头孢霉素、200 μg/mL潮霉素；培养时间：4–6天（28°C）
2.4 生长表型、菌丝形态和亚细胞定位
生长表型和菌丝形态分析时，将1–3 μL孢子悬浮液接种于PDA固体培养基中心。将无菌盖玻片以45度角斜插入培养基中，插入点与接种点保持1.0–1.5 cm距离。于28°C培养4天。待菌丝扩展超过盖玻片后取出玻片，在显微镜下观察菌丝形态。
亚细胞定位实验中，使用表S3所列引物扩增全长基因并插入prf-HU2-eGFP载体，将获得的prf-HU2-gene-eGFP载体转化至A. sydowii H-1。筛选转化子后用荧光显微镜观察蛋白定位。
【数据】接种量：1–3 μL孢子悬液；培养条件：28°C，4天；盖玻片角度：45°；插入距离：1.0–1.5 cm
2.5 乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、ROS、GSSG/GSH、NADP+/NADPH水平检测
收集第2天发酵菌丝体，测定乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、ROS、GSSG/GSH和NADP+/NADPH水平。微生物乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A含量检测参照微生物丙二酰辅酶A ELISA研究试剂盒（Meimian，20851，中国）和乙酰辅酶A ELISA研究试剂盒（Meimian，15659，中国）方法。胞内活性氧水平检测参照活性氧检测试剂盒（Yeason，50101ES01，中国）方法；NADP+/NADPH含量检测参照NADP+/NADPH检测试剂盒（Beyotime，S0179，中国）方法；GSH/GSSG含量检测参照GSH和GSSG检测试剂盒（Beyotime，S0053，中国）方法。
【数据】样品：第2天发酵菌丝体；试剂盒：丙二酰辅酶A ELISA试剂盒（Meimian, 20851）、乙酰辅酶A ELISA试剂盒（Meimian, 15659）、ROS检测试剂盒（Yeason, 50101ES01）、NADP+/NADPH检测试剂盒（Beyotime, S0179）、GSH/GSSG检测试剂盒（Beyotime, S0053）
2.6 胁迫敏感性测试
参照Jeffrey W. Cary和Cao的方法，评估酪氨酸途径突变体对各种胁迫因子的响应。将突变体培养于含以下添加物的最低培养基（MM）上：5 mM H₂O₂、200 μg/mL SDS、200 μg/mL刚果红（CR）、1.5 M NaCl、1.5 M KCl或1.2 M山梨醇。
【数据】胁迫条件：5 mM H₂O₂、200 μg/mL SDS、200 μg/mL CR、1.5 M NaCl、1.5 M KCl、1.2 M山梨醇
研究结果
3.1 鉴定AsMyb1和AsMyb3为R2R3型Myb转录因子
Myb转录因子家族在动物、植物和真菌中广泛保守，在基因调控、细胞周期控制和胁迫响应中发挥重要作用。在A. sydowii H-1中鉴定出19个Asmyb基因，包括7个2R-MYB和12个1R-MYB（表S1）。为阐明进化关系，基于21个构巢曲霉Myb蛋白（AnMybs）、4个拟南芥MYB蛋白（AtTT2、AtMYB113、AtPAP2和AtMYB114）、甜菜MYB蛋白BvMYB1以及来自A. sydowii H-1的19个MYB转录因子（AsMybs），采用最大似然法构建了系统发育树。系统发育分析显示，45个MYB蛋白聚为七个不同的分支（图1a）。
在2R-AsMybs中，AsMyb1（EVM0006427.1）与AtTT2、AtMYB113、AtPAP2、AtMYB114和BvMYB1聚在同一分支（图1a）。其他2R-AsMybs，包括AsMyb5（EVM0007782.1）、AsMyb4（EVM0002366.1）和AsMyb3（EVM0005360.1），聚在Group VII分支内，具有相似的保护结构域架构。相比之下，AsMyb2（EVM0002572.1）被归入Group I，而AsMyb6（EVM0005044.1）属于Group V。1R-AsMybs在保守结构域组成、序列长度和蛋白质结构方面表现出比2R-AsMybs更大的变异性（图1a和图S1a）。此外，保守结构域分析和功能注释导致7个AsMybs（EVM0010893.1、EVM0011303.1、EVM0009338.1、EVM0003866.1、EVM0011646.1、EVM0005581.1和EVM0012563.1）被排除在后续功能研究之外，因为它们被注释为转录复合物亚基（图S1a）。总体而言，尽管所有2R-AsMybs均具有R2R3-MYB型结构域，但序列差异和调控结构域分化可能促成了其功能特异性。
对A. sydowii H-1中AsMyb转录因子的功能表征揭示了它们在真菌发育中的不同作用。基因缺失和过表达分析表明，在19个已鉴定的AsMyb成员中，只有AsMyb1、AsMyb3和AsMyb6显著影响真菌生长和发育（图1b和图S2）。在PDA培养基上培养3天后，ΔAsmyb1菌株呈现蓬松的菌落形态，与野生型（WT）菌落观察到的狭窄（1–2 mm）未分化边缘形成鲜明对比。相比之下，OE::Asmyb1形成颜色较浅的绿色菌落，直径更大。ΔAsmyb3也表现出增强的菌落扩展，而OE::Asmyb3显示生长受限，并在培养基背面分泌红棕色色素。此外，ΔAsmyb6也表现出显著受限的生长。通过原生质体介导转化对ΔAsmyb1和ΔAsmyb3进行回补，在PDA培养条件下部分恢复了WT的生长和发育表型（图1b和图S4）。
生物信息学分析将AsMyb1鉴定为flbD的直系同源物，将AsMyb6鉴定为mylA的直系同源物，两者均为构巢曲霉中已充分表征的真菌发育调控因子。特别是Ye-Eun Son等人已系统证明MylA有助于构巢曲霉的分生孢子形成和分生孢子萌发。此外，AsMyb3被鉴定为BasR（AN7174.2）的直系同源物，BasR是细菌触发真菌次生代谢物产生的关键转录因子。此前研究表明，AN7174的缺失导致orsA和orsD表达显著降低，并完全丧失邻甲基苯甲酸的产生。令人惊讶的是，明显的basR同源物仅存在于少数其他曲霉属物种中，包括A. sydowii和A. versicolor，而在许多其他物种中明显缺乏。研究结果表明，AsMyb1和AsMyb3不仅调控形态发育，还影响A. sydowii H-1的次生代谢（图1b和表S4）。
亚细胞定位和转录活性分析显示，AsMyb1和AsMyb3均定位于细胞核中，作为转录调控因子发挥作用（图1c和d）。总之，AsMyb1和AsMyb3均调控A. sydowii H-1的生长和发育。
【数据】Asmyb基因总数：19个（7个2R-MYB + 12个1R-MYB）；系统发育树：45个MYB蛋白，7个分支；功能筛选：19个AsMyb中仅3个（AsMyb1、AsMyb3、AsMyb6）显著影响生长发育；ΔAsmyb1菌落形态：蓬松；WT菌落边缘：1–2 mm未分化；ΔAsmyb3表型：菌落扩展增强；OE::Asmyb3表型：生长受限、分泌红棕色色素；培养时间：3天（PDA）
3.2 转录组分析揭示AsMyb1和AsMyb3在次生代谢、生长和胁迫响应中的调控作用
为进一步阐明AsMyb1和AsMyb3在生长、发育和次生代谢调控中的分子机制，对发酵4天后的WT和突变菌株（ΔAsmyb1、ΔAsmyb3、OE::Asmyb1和OE::Asmyb3）进行了转录组分析。韦恩图分析在所有基因型中鉴定出419个差异表达基因（DEGs）（图2a）。
火山图分析显示，与WT相比，Asmyb1和Asmyb3的缺失和过表达显著改变了基因表达模式（图2b）。为深入了解AsMyb1和AsMyb3的调控作用，进行了基因本体论（GO）术语和KEGG富集分析。ΔAsmyb1和ΔAsmyb3突变体的GO和KEGG富集结果表现出高度相似性（图2c和d）。DEGs显著富集在与次生代谢、碳水化合物和多糖分解代谢相关的生物学过程中。分子功能类别的富集包括单加氧酶活性、聚酮合酶活性和氧化还原酶活性。在细胞组分本体中，DEGs主要与质膜、真菌型液泡和细胞外周相关，表明膜和转运动力学发生了改变。值得注意的是，在ΔAsmyb1突变体中，与几丁质分解代谢过程和几丁质酶活性相关的基因显著富集（图2c和d）。
相比之下，OE::Asmyb1和OE::Asmyb3的GO和KEGG富集结果差异显著（图2e和f）。OE::Asmyb1广泛增强了芳香族和聚酮来源的次生代谢。聚酮合酶活性、氧化还原酶活性和单加氧酶活性等分子功能术语也显著富集。线粒体内膜和真菌型液泡等细胞组分术语尤为突出（图2f）。OE::Asmyb3的GO术语与离子转运和膜稳态相关。富集的细胞组分包括细胞外囊泡、小窝和神经元细胞体膜（图2e）。综上所述，这些发现表明AsMyb1和AsMyb3作为重要的转录调控因子，协调了A. sydowii H-1中广泛的生理和代谢过程。
【数据】发酵时间：4天；DEGs总数：419个；ΔAsmyb1富集特征：几丁质分解代谢、几丁质酶活性；OE::Asmyb1富集特征：芳香族/聚酮次生代谢、聚酮合酶活性、线粒体内膜；OE::Asmyb3富集特征：离子转运、膜稳态、细胞外囊泡
3.3 AsMyb1和AsMyb3影响选择性剪接（AS）模式
AS是一种关键的转录后机制，通过从单个基因产生多个mRNA异构体显著增强转录组多样性。剪接体是一个动态的大型核糖核蛋白复合物，由五个小核核糖核蛋白（snRNPs）——U1、U2、U4/U5/U6——以及超过100个相关蛋白组成。转录组分析显示，核心剪接体蛋白（包括PRP 8、PRP 43、SF3B10和snRNPs）以及剪接调控因子SRSF3在WT和突变体中差异表达（图3a和图S6）。
因此，ΔAsmyb1和ΔAsmyb3菌株表现出比WT显著更少的TSS和TTS事件，表明剪接起始和终止发生改变。同时，IR和XIR事件的频率显著增加，反映出剪接保真度降低和前体mRNA加工中断。这些结果表明，Asmyb1或Asmyb3的缺失影响了启动子活性和剪接准确性，重塑了剪接格局，增加了转录本和蛋白质多样性。相比之下，OE::Asmyb1和OE::Asmyb3表现出与WT相当的AS模式（图3b和表S6）。与WT相比，KEGG富集分析……
【数据】剪接体相关差异表达蛋白：PRP 8、PRP 43、SF3B10、snRNPs、SRSF3；ΔAsmyb1/ΔAsmyb3：TSS和TTS事件显著减少，IR和XIR事件频率显著增加；OE::Asmyb1/OE::Asmyb3：AS模式与WT相当
3.4 AsMyb1和AsMyb3调控A. sydowii H-1的无性发育和菌丝形态
在PDA固体培养基上培养3天后，WT和Asmyb1/Asmyb3突变体的表型差异显著（图4a）。ΔAsmyb1菌株表现出蓬松的菌落形态，产孢量增加。OE::Asmyb1形成直径更大的浅绿色菌落。ΔAsmyb3菌落扩展增强，而OE::Asmyb3生长受限并在培养基背面分泌红棕色色素。菌落边缘和中心的菌丝形态观察显示，突变体与WT之间存在明显的菌丝形态差异（图4a）。
【数据】培养条件：PDA固体培养基，3天，28°C；ΔAsmyb1：蓬松菌落、产孢增加；OE::Asmyb1：浅绿色、直径更大；ΔAsmyb3：菌落扩展增强；OE::Asmyb3：生长受限、分泌红棕色色素
3.5 AsMyb3和AsMyb1影响氧化还原稳态
转录组数据显示，与ROS产生和降解相关的基因在WT和突变体之间差异表达（图5a）。ROS荧光图显示，突变体菌株的ROS水平与WT不同（图5b）。NADP⁺、NADPH、NADP⁺/NADPH比值以及GSSG、GSH和GSSG/GSH含量的测定结果如图5c–h所示。AsMyb3的调控作用进一步通过……（图5i）。
【数据】检测指标：ROS、NADP⁺、NADPH、NADP⁺/NADPH、GSSG、GSH、GSSG/GSH；样品：第2天发酵菌丝体
3.6 AsMyb1和AsMyb3负调控次生代谢
发酵第4天，WT和Asmyb1/Asmyb3突变体中mdpG基因簇的表达水平如图6a所示。LC-MS分析显示，与WT相比，ΔAsmyb3和ΔAsmyb1菌株的大黄素产量分别上调了3.21倍和1.65倍（图6b–g）。6天发酵的WT和突变体菌丝体经冷冻干燥、研磨后进行大黄素含量分析。
【数据】大黄素产量变化：ΔAsmyb3上调3.21倍，ΔAsmyb1上调1.65倍（相对于WT）；发酵时间：4天（基因表达）、6天（LC-MS分析）；样品处理：冷冻干燥、研磨
讨论与解读
AsMyb1和AsMyb3在A. sydowii H-1中协调了多层面的调控网络。它们通过转录和转录后机制控制包括分生孢子形成、菌丝模式和胁迫响应在内的关键发育过程。重要的是，AsMyb1和AsMyb3均调节影响代谢基因的选择性剪接事件，同时通过mdpG基因簇直接抑制大黄素生物合成。观察到的氧化还原稳态和前体（乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A）库的失调进一步解释了它们的代谢影响。
编译者解读：该研究揭示了R2R3-Myb转录因子在丝状真菌中"一因多效"的调控特征——同一转录因子同时掌控发育形态与次生代谢通路，这为代谢工程提供了重要启示：靶向转录因子可比单基因操作更高效地解锁沉默基因簇。尤其值得关注的是，AsMyb1和AsMyb3作为大黄素合成的负调控因子，其敲除策略直接带来了3.21倍和1.65倍的产量提升，且不涉及复杂的启动子工程。但研究也提示，转录因子的多效性可能导致生长与产量之间的权衡（如OE::Asmyb3生长受限），未来精细调控其表达强度或时空特异性，有望实现生长与产物的解耦联。
参考来源
Ran Y. Coordinated regulation of fungal development and secondary metabolism by R2R3-Myb transcription factors AsMyb1 and AsMyb3 in Aspergillus sydowii H-1. International Journal of Biological Macromolecules, 2026. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.149807
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.149807