来源：PoNoxA mediates the crosstalk between fungal immune signaling and antimicrobial metabolite biosynthesis to enhance pathogen defense and food preservation（LWT）| 编译：DNA Lab Space
导读
活性氧（ROS）在真菌生理中扮演双重角色，但NADPH氧化酶（NOX）如何协调真菌代谢产物与化学防御仍不清楚。本研究以平菇（Pleurotus ostreatus）为模型，揭示了PoNoxA和PoNoxB两个NOX亚型在抵御褐斑病病原Pseudomonas tolaasii中的差异功能。PoNoxA过表达显著增强抗病性，其沉默则增加感病性。通过代谢组学与转录组学整合分析，研究鉴定出PoNoxA特异性上调有机氧化合物、脂肪酰基和萜类生物合成途径，促进3-辛酮、1-辛烯-3-醇和（−）-二氢香苇醇三种抗菌代谢物的积累。这些代谢物对P. tolaasii和Escherichia coli表现出广谱抗菌活性，并能将采后香蕉和辣椒的货架期延长4–6天。
研究背景
活性氧（ROS）是真菌代谢中高度活跃的分子，既作为有氧呼吸的副产物产生，也在菌丝形态发生、营养摄取和胁迫适应等细胞机制中发挥调控作用。真菌通过合成与清除酶的复杂网络维持ROS稳态，其中NADPH氧化酶（NOX）是调控ROS生成的核心。NOX催化O₂还原为超氧阴离子（O₂⁻）和过氧化氢（H₂O₂），这些酶在从酵母到丝状真菌的进化中高度保守，通常包含多个亚型（如NoxA、NoxB、NoxC），产生ROS以调控真菌发育、胁迫防御和宿主互作等关键生物学过程。
目前对真菌NOX功能的认识多来自模式生物，如非致病酵母Saccharomyces cerevisiae、人类致病性Aspergillus属和作物病原菌Fusarium graminearum。在Aspergillus fumigatus中，NOX来源的ROS介导细胞壁完整性和哺乳动物宿主毒力；在F. graminearum中，存在四个不同的NOX亚型，各具特化功能：NoxA和NoxB调控子实体形成，NoxC（或NoxR）控制孢子萌发。然而，NOX在食用真菌中对病原防御的调控作用，尤其是其与抗菌代谢物生物合成的关联，仍然缺乏深入研究。本研究以平菇为模型，系统探究PoNoxA和PoNoxB在抗褐斑病防御中的功能差异及其代谢调控机制。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
平菇野生型（WT）菌株为源自ACCC50994的单核体，保藏于中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）。PoNoxA和PoNoxB的过表达（OE）和RNA干扰（RNAi）菌株按照Li等（2024）先前描述的方法构建。具体而言，所构建的转基因菌株包括PoNoxAOE（PoNoxA过表达菌株）、PoNoxARNAi（PoNoxA敲低菌株）、PoNoxBOE（PoNoxB过表达菌株）和PoNoxBRNAi（PoNoxB敲低菌株）。WT和转基因菌株均在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上、25 ± 1°C、完全黑暗条件下培养14天，如前人报道（Hou等，2022）。细菌病原P. tolaasii菌株FS-1a由农业微生物学国家重点实验室提供（Wang, Song等，2024）。抗菌活性评估中，E. coli菌株ATCC 25922在Luria-Bertani（LB）培养基中、37°C、振荡（180–200 rpm）条件下无菌培养，方法参照Zhang等（2026）。
【数据】培养基：PDA；温度：25 ± 1°C；时间：14天；光照：完全黑暗；细菌培养基：LB；细菌培养温度：37°C；转速：180–200 rpm
2.2 PoNoxA和PoNoxB突变体对褐斑病的敏感性测试
敏感性评估中，PoNoxA和PoNoxB突变体菌株分别与P. tolaasii（调整至OD₆₀₀值为1.0）在PDA培养基表面、25 ± 1°C共培养4天（B. Yan & Ma, 2023）。为确保突变体的预培养，被测平菇菌株在共培养启动前7天接种于PDA培养基。平菇菌丝生长的抑制率计算公式如下：
(1) 抑制率 = (C₀ − Cn) / (C₀ − 菌饼直径) × 100%
其中C₀为对照平板中菌丝直径，Cn为共培养平板中菌丝直径，菌饼直径为7 mm。
【数据】病原菌OD₆₀₀：1.0；共培养温度：25 ± 1°C；共培养时间：4天；预培养时间：7天；菌饼直径：7 mm
2.3 基于UPLC-MS的代谢组学分析
代谢物分析中，取0.5 g各新鲜菌丝样品置于单独聚乙烯管中，用液氮研磨成细粉。质谱分析的样品制备按照先前报道的方法进行（Sabino Ferrari等，2021）。代谢物分离和检测使用超高效液相色谱（UPLC）系统（Acquity I-Class PLUS，Waters，美国）耦合四极杆飞行时间（QTOF）质谱仪（Xevo G2-XS，Waters，美国），流程参照Sabino Ferrari等（2021）的方案。所有实验测量均设置四个生物学重复以确保可重复性。随后，使用R软件中的ropls包（版本1.6.3）进行主成分分析（PCA）。差异表达代谢物（DEMs）在配对比较中定义为满足两个标准：变量投影重要性（VIP）≥ 1.0且差异倍数（FC）≥ 2.0或≤ 0.5。
【数据】样品量：0.5 g；生物学重复：4个；VIP阈值：≥ 1.0；FC阈值：≥ 2.0或≤ 0.5；软件：ropls包（版本1.6.3）
2.4 RNA提取与RNA-seq分析
使用RNA Prep Pure Plant Kit（天根生物技术，北京，中国）从0.5 g各新鲜菌丝样品中提取总RNA，严格按制造商推荐方案操作。使用NEBNext® Ultra™ RNA Library Prep Kit for Illumina® NovaSeq6000（New England Biolabs，MA，美国）构建短读长文库，严格按试剂盒说明书操作。每个样品的属性序列中引入索引代码以实现后续样品区分（Yan等，2022）。所有实验测量均设置至少四个生物学重复以确保可重复性。清洁读段通过第三代PacBio长读长测序技术比对到平菇菌株PC9的参考基因组（基因组序列档案（GSA）登录号：CRA032861）。差异表达基因（DEGs）通过定量分析鉴定，显著DEGs定义为同时满足两个标准：每千碱基转录本每百万映射读段的片段数（FPKM）表达值≥ 1.5且错误发现率（FDR）≤ 0.05（Lodi等，2025）。
【数据】样品量：0.5 g；生物学重复：≥ 4个；FPKM阈值：≥ 1.5；FDR阈值：≤ 0.05；参考基因组：PC9（GSA：CRA032861）
2.5 抗菌活性实验
PoNox关联代谢物（NLMs）的抗菌能力通过琼脂扩散法和肉汤稀释法评估。测试细菌分别在无菌LB营养肉汤中、37°C培养12小时。琼脂扩散法中，原始菌悬液用无菌LB营养肉汤连续稀释至10⁵倍稀释液（Hossain, 2024）。随后，取100 μL调整后的菌悬液用无菌L形涂布棒均匀涂布于整个LB琼脂平板表面（d = 7 cm），每个平板分别补充终浓度为1、2、4、6、8、10或25 mM的抗菌剂。平板随后在37°C过夜培养（约12–14小时），之后用血球计数板进行菌落计数。
肉汤稀释法中：取40 μL上述调整后的菌悬液接种到4000 μL LB肉汤中。LB肉汤预先补充终浓度为1、2、4、6、8、10或25 mM的抗菌剂。接种后的肉汤样品在37°C、200 rpm振荡培养6小时，随后用分光光度计进行细菌计数。以生理盐水中孵育的菌悬液作为空白组。最后，抗菌率按以下公式计算：
(2) 抗菌率（%）= (Nc − Nt) / Nc × 100%
其中Nt和Nc分别表示处理组和空白组中形成的细菌菌落数（Zhang, Wang等，2022）。剂量-抑制曲线通过将归一化抑制率对对数抗菌浓度作图构建，并确定IC₅₀（半数抑制浓度）。S形模型的拟合优度用决定系数（R²）评估；R²值> 0.9视为拟合良好，这是抗菌剂量-响应分析中常用的标准（Balouiri等，2016；Orhan等，2010）。
【数据】细菌预培养温度：37°C；预培养时间：12h；稀释倍数：10⁵；涂布体积：100 μL；平板直径：7 cm；抗菌剂浓度梯度：1、2、4、6、8、10、25 mM；琼脂扩散法培养条件：37°C、12–14h；肉汤稀释法接种量：40 μL/4000 μL；振荡培养条件：37°C、200 rpm、6h；IC₅₀拟合R²阈值：> 0.9
2.6 采后水果、蔬菜和食用菌的保鲜
真菌来源的抗菌代谢物（尤其是萜类和C8化合物）作为天然化合物，代表了一种有前景的采后管理生化策略，可规避化学残留和某些物理方法高能耗的局限性（Ramudingana等，2025）。为验证平菇来源抗菌化合物对采后农产品（包括水果、蔬菜和食用菌）保鲜的适用性，研究评估了其对香蕉（Musa spp.）、辣椒（Capsicum annuum）、双孢蘑菇（Agaricus bisporus）和秀珍菇（P. geesteranus）的保鲜效果。香蕉和辣椒被选为代表性、高度易腐的非寄主商品，以评估代谢物在多种农产品类型中的广谱潜力。实验前，选择四种代表性采后产品的新鲜完整样品，要求无果皮褐变、无虫害侵染或无机械损伤。使用小型喷雾瓶将500 μL抗菌化合物（IC₅₀浓度）喷洒到圆形滤纸（d = 100 mm）上。随后，将样品和润湿的滤纸放入透明PET塑料密封盒（185 × 120 × 65 mm）中，两者不直接接触，分别在15°C下储存。每天监测保鲜效果直至所有样品变质，失重率计算为相对于初始重量的失重百分比（由初始重量与最终重量之差计算）（In Sokra等，2024）。腐烂严重程度采用4级评分系统评估：0 = 无腐烂；1 = 轻度腐烂（≤25%的...
【数据】抗菌物体积：500 μL；滤纸直径：100 mm；储存盒尺寸：185 × 120 × 65 mm；储存温度：15°C；监测频率：每天；IC₅₀浓度应用
研究结果
3.1 PoNoxA和PoNoxB在平菇代谢物生物合成与代谢中的调控作用
为研究PoNoxA和PoNoxB在平菇代谢物生物合成与代谢中的调控作用，使用基于LC-QTOF的UPLC-MS/MS平台对四个突变菌株和WT菌株进行了定性代谢组学分析。共注释到2982种代谢物，其中负离子模式检测到1295种，正离子模式检测到1687种。与WT菌株相比，PoNoxA过表达菌株（PoNoxAOE，以下简称N1O）和PoNoxA敲低菌株（PoNoxARNAi，以下简称N1i）表现出不同的DEM图谱（表S1）。具体而言，PoNoxAOE和PoNoxARNAi在负离子模式下分别显示756和397个DEMs，在正离子模式下分别显示347和382个DEMs。WT与各突变体在两种离子模式间的DEMs分布如图1A所示。在PoNoxAOE中，两种离子模式下共鉴定到155个共同表达的DEMs（图1A）。在PoNoxAOE的DEMs中，398个（负离子模式）和347个（正离子模式）上调，分别占各模式总注释DEMs的约52.6%和87.4%（表S1）。这些上调的DEMs包括77种在PoNoxAOE中特异性检测到的代谢物（表S1）。
KEGG富集分析显示，这些上调的DEMs主要富集在与化学结构转化相关的通路（如植物激素、萜类和类固醇的生物合成）、ABC转运蛋白、次级代谢物生物合成（包括多种抗生素和吲哚生物碱）、氨基酸代谢（如苯丙氨酸、色氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢）、萜类和聚酮代谢（包括二氢香苇酮和（1R, 4R）-二氢香苇酮生物合成）以及萘降解（涵盖水杨酸代谢）等通路，凸显了非靶向代谢组学在揭示此类动态代谢转变中的价值（Lang等，2025）（图S1，表S2）。从代谢功能角度看，化学结构转化途径中植物激素生物合成的富集尤为值得注意——即使在平菇这样的非维管生物中，激素样代谢物（如茉莉酸、水杨酸）也已显示可调控菌丝生长和胁迫耐受性（Hu等，2022；Li, Kim, & Lee, 2022）。这与我们先前观察到的PoNoxA介导的ROS信号调控生长相关代谢网络一致，表明Nox依赖性氧化还原调控与激素样代谢物生物合成之间存在直接防御响应中的交叉对话（Li等，2024）。ABC转运蛋白通路和抗生素生物合成的富集进一步支持PoNoxA的防御角色。此外，萜类被充分证明是核心防御代谢物：例如，赤霉素在蘑菇菌丝生长和菌柄发育调控中发挥重要作用（Diskit等，2024；Li等，2023）；（1R, 4R）-二氢香苇酮对土壤害虫具有杀虫活性（Zhang, Wang等，2022）。
对于PoNoxARNAi，两种离子模式下共鉴定到506个下调的DEMs，包括155个特异性下调的代谢物（表S1和S2）。KEGG富集分析表明，这些下调的DEMs主要归为两个功能组：其他次级代谢物的生物合成（占约23.3%，包括新霉素、卡那霉素、庆大霉素、多种抗生素和吲哚二萜生物碱生物合成）以及萜类和聚酮的代谢（占约18.0%，包括单环β-内酰胺和二萜生物合成）（图S1，表S2）。
对于PoNoxB过表达菌株（PoNoxBOE，以下简称N2O）和PoNoxB敲低菌株（PoNoxBRNAi，以下简称N2i），负离子模式下分别检测到202和175个DEMs，正离子模式下分别检测到283和152个DEMs（图1B）。PoNoxBOE和PoNoxBRNAi在两种离子模式下分别仅鉴定到3个和5个共同表达的DEMs。对于PoNoxBOE，290个DEMs上调，包括289个特异性表达的DEMs，主要富集在甘油酯代谢、淀粉和蔗糖代谢、新霉素代谢以及青霉素和头孢菌素生物合成等KEGG通路中（图S1C）。对于PoNoxBRNAi，174个DEMs下调，其中92个为特异性表达（表S1）。这些下调的DEMs主要富集在包括癌症中的胆碱代谢、甘油酯代谢、磷壁酸生物合成和催产素信号通路等KEGG通路中（图S1D，表S2）。
为进一步阐明PoNoxA和PoNoxB在平菇代谢物生物合成与代谢中的调控作用，我们分析了PoNoxAOE和PoNoxBOE共有的差异积累代谢物（DAMs）。具体而言，PoNoxAOE在其他次级代谢物生物合成、化学结构转化和萜类代谢的KEGG通路中分别表现出16、14和12个特异性上调的DAMs（图1C）。这些上调的DAMs覆盖三个主要类别：有机氧化合物（如红景天苷、卡那霉素A、3-辛酮）、脂肪酰基（如9R, 10S-EpOME、月桂酸、1-辛烯-3-醇）和异戊烯醇脂质（如断氧化马钱子苷酸、（1R, 4R）-二氢香苇酮、（−）-二氢香苇醇）（图1E）。值得注意的是，其中几种DAMs此前已被报道具有生物活性。例如，卡那霉素A是常用的杀菌抗生素（Yang等，2025）；3-辛酮和1-辛烯-3-醇是平菇中的主要挥发性风味化合物，对线虫具有毒性（Lee等，2023；Veronico等，2023）；（−）-二氢香苇醇具有类似芳樟醇的香气和胡椒香，是薄荷精油的主要成分，作为天然驱避剂和杀虫剂发挥作用（El-Sakhawy等，2025）。在PoNoxBOE中，五个不同的DAMs分类如下：一种氨基糖苷衍生物[O-(1->4)-α-L-二氢链霉糖基-链霉胍6-磷酸]、两种脂质和脂类化合物（castasterone、PE (P-18:0/17:2 (9Z, 12Z))）、一种脂肪酰基（22-氧代二十二烷酸酯）和一种有机氮化合物（鞘氨醇）（图1D–表S2）。
【数据】注释代谢物总数：2982（负离子模式1295，正离子模式1687）；PoNoxAOE DEMs：负离子756、正离子347；PoNoxARNAi DEMs：负离子397、正离子382；PoNoxAOE共同DEMs：155；上调比例：负离子52.6%、正离子87.4%；特异性上调代谢物：77；PoNoxARNAi下调DEMs：506（特异性155）；PoNoxBOE DEMs：负离子202、正离子283；PoNoxBRNAi DEMs：负离子175、正离子152；PoNoxBOE共同DEMs：3；PoNoxBRNAi共同DEMs：5；PoNoxBOE上调DEMs：290（特异性289）；PoNoxBRNAi下调DEMs：174（特异性92）；PoNoxAOE特异性上调DAMs：16（其他次级代谢物）、14（化学结构转化）、12（萜类代谢）
3.2 PoNoxA和PoNoxB介导平菇菌丝对褐斑病的差异防御响应
在对峙培养实验中，四个突变菌株的菌丝生长与WT菌株相比对BBD表现出不同的抑制效果（图2A）。在所有测试菌株中，PoNoxAOE（N1O）在初筛参数中表现出最突出的拮抗性能。其在BBD胁迫下表现出最小的菌丝生长抑制率（4.49 ± 0.21%），并在BBD病原菌落上表现出强大的定殖能力（图2A和B）。相比之下，PoNoxBOE（N2O）在暴露于BBD时表现出显著更高的菌丝生长抑制率（18.13 ± 0.65%），表明其拮抗活性较弱（图2A和B）。此外，RNA干扰菌株（N1i和N2i）的抑制活性与其相应的过表达菌株相反。这种对比趋势验证了PoNoxA和PoNoxB基因在介导对BBD病原拮抗响应中的一致调控功能。
【数据】N1O菌丝生长抑制率：4.49 ± 0.21%；N2O菌丝生长抑制率：18.13 ± 0.65%
3.3 抗菌物质的生物活性
为系统验证PoNoxA相关代谢物的抗菌潜力，我们聚焦于通过代谢组学分析鉴定的三种潜在抗菌活性化合物：3-辛酮（≥99.5% v/v，上海源叶生物科技有限公司，中国上海）、1-辛烯-3-醇（≥95.0% v/v，上海源叶生物科技有限公司，中国上海）和（−）-二氢香苇醇（≥95.0% v/v，SIGMA-ALDRICH，威斯康星州，美国）。这些...
【数据】3-辛酮纯度：≥99.5% v/v；1-辛烯-3-醇纯度：≥95.0% v/v；（−）-二氢香苇醇纯度：≥95.0% v/v
讨论与解读
本研究证实NADPH氧化酶亚型PoNoxA和PoNoxB在平菇抵御P. tolaasii的抗菌防御中发挥不同且关键的作用。通过整合转录组和代谢组分析，确立了PoNoxA是次级代谢的关键正调控因子，协调3-辛酮、1-辛烯-3-醇和（−）-二氢香苇醇等抗菌代谢物的生物合成与积累。相比之下，PoNoxB主要影响初级代谢通路，包括甘油酯、淀粉和蔗糖代谢，且未在同等程度上明显促进BBD抗性。功能验证证实，这些PoNoxA来源的代谢物对P. tolaasii和E. coli均表现出强效的剂量依赖性抗菌活性。该应用有效延长了香蕉和辣椒的货架期，减少了微生物腐烂并保持了感官品质。其功效达到甚至超过传统化学防腐剂。研究结果支持一个模型：PoNoxA介导保守的真菌防御策略，将免疫激活直接连接到特定抗菌化合物的生物合成。这种"免疫-代谢"交叉对话不仅增进了对真菌化学防御的理解，也确定了PoNoxA调控的代谢物作为管理采后疾病的有前景的生态友好候选物。
编译者解读
该研究的核心价值在于打通了"免疫信号—代谢重编程—抗菌物质合成—食品保鲜应用"的完整链条，为食用真菌病害防御与采后保鲜提供了全新的化学生态学视角。方法上，多组学整合与功能验证互为印证，逻辑严密。三种抗菌代谢物均为天然挥发性物质，具备低毒、可降解、不残留的天然优势，作为合成防腐剂的替代方案具有明确的产业化前景。值得关注的是，PoNoxA作为单一调控节点即可驱动多种抗菌代谢物的协同积累，这为后续通过基因编辑育种创制高抗病性食用菌品种提供了精准靶点。局限在于：抗菌活性数据主要来自体外实验，活体保鲜验证的病原压力条件与自然侵染场景仍有距离；代谢物的实际作用浓度、挥发动力学及其在复杂食品基质中的稳定性也需进一步评估。
参考来源
Sun, J. (2026). PoNoxA mediates the crosstalk between fungal immune signaling and antimicrobial metabolite biosynthesis to enhance pathogen defense and food preservation. LWT, 2026. DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119137
DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119137