来源：Multilayer engineering of Saccharomyces cerevisiae for ovalicin secretion enables selective fungal removal in a skin microbiome mimic（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space
导读
工程活细胞可作为功能性生物平台，通过局部生化活性与复杂微环境互动。本研究通过基因组挖掘从金龟子绿僵菌中鉴定出卵假散囊菌素（ovalicin）生物合成候选基因，并在酿酒酵母中逐步重建完整合成途径。通过前体通量重分配、内质网扩张、细胞色素P450还原酶优化及膜转运工程等多层改造，总产量达到5.8 mg/L，胞外分泌量从0.2 mg/L提升至3.5 mg/L。将工程酵母培养物直接应用于皮肤微生物组模拟群落，可选择性清除马拉色菌属真菌，同时保留代表性有益细菌的活性。
研究背景
工程活细胞作为功能性生物平台，其核心能力在于持续代谢产生活性分子而非被动材料属性。与常规药物储库或聚合物递送系统不同，这类活体平台能响应局部环境持续合成并释放生物活性分子，实现时空相关的功能调控。酿酒酵母因在食品与发酵领域的长期应用历史、欧盟QPS安全认证、以及对干燥、渗透压和皮肤酸性条件的耐受性，成为局部外用、非定植、自限性生物活性代谢物递送平台的理想底盘。皮肤微生物组在维持表皮屏障功能、免疫稳态和定植抵抗中发挥关键作用，但目前利用工程微生物平台选择性调控皮肤微生物组的研究仍鲜有报道。卵假散囊菌素是一种含环氧基团的真菌代谢物，具有选择性抗真菌活性，其生物合成途径的异源重建与分泌工程改造具有重要的应用价值。
研究方法
2.1 酵母菌株与基因操作
所有工程酵母菌株均源自酿酒酵母CEN.PK2-1C（MATa; his3Δ1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; MAL2-8c; SUC2）作为亲本菌株。菌株基因型和本研究使用的质粒列于补充表S2。DNA扩增使用Q5高保真DNA聚合酶（New England Biolabs，美国），长距离PCR使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara Bio，日本）。PCR产物使用DNA凝胶提取和PCR纯化试剂盒（Macherey-Nagel，德国）进行纯化。质粒DNA使用Omega质粒小提试剂盒提取，并通过Sanger测序验证（Bionics，首尔，韩国）。引物使用SnapGene设计。基因合成和酵母表达密码子优化由Bioneer完成。质粒构建采用限制性酶切、Gibson Assembly或酵母同源重组方法。所有质粒在大肠杆菌DH5α中扩增，培养基为添加100 μg/mL羧苄青霉素的LB培养基。酵母转化采用醋酸锂/单链载体DNA/聚乙二醇（LiAc/SS-DNA/PEG）方法。CRISPR–Cas9介导的基因组编辑用于染色体整合和启动子替换。靶向目标基因组位点的sgRNA使用SnapGene设计。含有表达盒或MET3启动子的供体修复模板构建时包含靶位点两侧的同源臂，与Cas9/sgRNA质粒共转化。正确的基因组整合和启动子替换通过菌落PCR和Sanger测序验证。
【数据】亲本菌株：S. cerevisiae CEN.PK2-1C；抗生素浓度：100 μg/mL 羧苄青霉素；转化方法：LiAc/SS-DNA/PEG；编辑工具：CRISPR–Cas9
2.2 基因组挖掘与卵假散囊菌素生物合成途径构建
为从金龟子绿僵菌中鉴定推定卵假散囊菌素生物合成基因簇（BGC），从NCBI GenBank获取基因组序列（组装ID：GCA_013305495.1），并使用antiSMASH 8.0和MIBiG 2.0数据库进行分析。以烟曲霉的 fumagillin 生物合成基因簇为参照，使用BLASTP、Pfam和InterPro注释进行比较分析。选择编码萜烯环化酶、甲基转移酶、细胞色素P450单加氧酶和双加氧酶的四个卵假散囊菌素生物合成基因，经酵母密码子优化后化学合成。这些基因克隆至pRS系列载体中，置于组成型启动子控制之下——GPD1p或CYC1p驱动萜烯环化酶，TDH3p驱动甲基转移酶，TEF1p驱动双加氧酶，ADH1p驱动细胞色素P450表达。
【数据】基因组组装ID：GCA_013305495.1；分析工具：antiSMASH 8.0、MIBiG 2.0；候选基因数：4个；启动子：GPD1p/CYC1p/TDH3p/TEF1p/ADH1p
2.3 金龟子绿僵菌细胞色素P450还原酶的鉴定
为鉴定支持卵假散囊菌素P450酶的细胞色素P450还原酶（CPR），重新分析了金龟子绿僵菌基因组。使用BLASTP搜索和HMMER分析，以烟曲霉参考CPR为查询序列，寻找典型的FAD、FMN和NADPH结合结构域。在contig 6上鉴定到一个包含所有保守CPR基序的开放阅读框（1857 bp；618个氨基酸），命名为MaCPR。其他物种的CPR序列来自NCBI已报道和注释的序列。
【数据】MaCPR基因长度：1857 bp；氨基酸数：618 aa；定位：contig 6
2.4 AI引导的P450还原酶结构建模
使用AlphaFold3生成CPR–P450复合物的初始结构模型。由于CPR–P450配对产生的界面pLDDT值低于85，随后使用AlphaRED进行全局刚体对接，以AlphaFold3结构为起点应用Rosetta Replica Exchange Docking。根据Rosetta界面评分，从约5800–6200个精化decoy中鉴定最佳收敛对接姿态。使用PRODIGY计算结合自由能（ΔG）和分子间接触数。为估算电子转移几何结构，以PDB 1BVY（P450 BM3）为参考进行辅因子结构移植；将1BVY的血红素和FMN结合结构域通过CE-align分别叠合到P450和CPR链上，从移植的辅因子坐标测量FMN(N5)到血红素铁的距离。
【数据】界面pLDDT阈值：<85；decoy数量：5800–6200；参考结构：PDB 1BVY；计算工具：AlphaFold3、AlphaRED、PRODIGY、CE-align
2.5 卵假散囊菌素生产的酵母培养条件
种子培养在3 mL合成完全（SC）培养基中，30°C、250 rpm振荡培养24小时。生产培养接种至250 mL带挡板摇瓶中的50 mL SC培养基，初始OD600为0.1，30°C、250 rpm振荡培养120小时。SC培养基组成：0.67%酵母氮碱（不含氨基酸，BD Difco，美国）、2%葡萄糖、CSM dropout混合物（BD Biosciences，美国），按需补充相应氨基酸（Sigma-Aldrich，美国）。为便于回收疏水代谢物并防止蒸发，在含有卵假散囊菌素外排泵的菌株培养物中添加十二烷覆盖层（每50 mL培养物加5 mL）。对于MET3介导的ERG9下调，在接种时添加L-甲硫氨酸至终浓度0.5 mM。
【数据】种子培养：3 mL SC、30°C、250 rpm、24 h；生产培养：50 mL SC、250 mL摇瓶、OD600=0.1、30°C、250 rpm、120 h；培养基：0.67% YNB、2%葡萄糖；十二烷覆盖层：5 mL/50 mL；L-甲硫氨酸：0.5 mM
2.6 样品制备与卵假散囊菌素定量
对于不含卵假散囊菌素外排泵的实验，培养物以4000 ×g离心10分钟，细胞沉淀用乙酸乙酯提取，收集乙酸乙酯层，冻干后用200 μL甲醇复溶。含有外排泵的菌株，分别定量胞内、胞外和总卵假散囊菌素水平。胞内定量：离心所得细胞沉淀用乙酸乙酯提取。胞外定量：收集十二烷覆盖层，与乙酸乙酯混合，回收乙酸乙酯层。总定量：整个培养物（含细胞、培养基和十二烷覆盖层）用乙酸乙酯提取。所有情况下，收集乙酸乙酯层，冻干后用200 μL甲醇复溶，再进行仪器分析。样品采用LC–MS/MS分析（Agilent 1290 Infinity II联用6470三重四极杆质谱仪），配备C18色谱柱（2.1 × 100 mm，1.8 μm）。流动相为水（A）和乙腈（B），均含0.1%甲酸。梯度为15分钟内10–90%溶剂B。检测采用正电喷雾电离（ESI）模式，多反应监测（MRM）转换m/z 327.2 → 267.1和327.2 → 249.1。化学合成的卵假散囊菌素（BOC sciences，美国）作为外标校准品。
【数据】离心：4000 ×g、10 min；复溶体积：200 μL甲醇；色谱柱：C18 2.1×100 mm、1.8 μm；梯度：10–90% B、15 min；MRM：327.2→267.1、327.2→249.1
2.7 抗菌活性测定
真菌菌株：糠秕马拉色菌（KCTC 7746）、限制性马拉色菌（KCTC 27527）、厚皮马拉色菌（KCTC 27528）；细菌菌株：表皮葡萄球菌（KCTC 1917）、藤黄微球菌（KCTC 1056）、植物乳植杆菌（KCTC 3108）、副干酪乳酪杆菌（KCTC 3260），均购自韩国典型培养物保藏中心。所有菌株在添加1% Tween 80的改良脑心浸液（BHI）琼脂上培养。 comparative抗真菌药敏试验中，化学合成卵假散囊菌素、fumagillol和fumagillin购自BOC Sciences。平板抗菌测定中，含卵假散囊菌素的组分从工程酵母培养物的十二烷覆盖层中获得，取100 μL特定浓度的溶剂均匀涂布于琼脂平板表面后再接种。每种皮肤微生物约10⁵菌落形成单位（CFU）涂布接种，30°C培养72小时。抗菌活性通过CFU与仅含十二烷的对照平板比较来评估。为实现混合培养物中特定结构域的CFU计数，使用选择性平板条件。细菌CFU计数时，平板添加两性霉素B（5 μg/mL）抑制真菌生长；真菌CFU计数时——
【数据】接种量：约10⁵ CFU；培养：30°C、72 h；两性霉素B：5 μg/mL；培养基：BHI + 1% Tween 80
研究结果
3.1 金龟子绿僵菌卵假散囊菌素生物合成候选基因的鉴定
真菌萜类生物合成途径通常具有进化模块化特征，遵循保守的组织逻辑——萜烯环化酶生成烃骨架，随后由细胞色素P450酶和辅助酶进行顺序氧化和修饰反应。基于这一生物合成逻辑，研究首先在金龟子绿僵菌E6中鉴定相应生物合成基因，以在酿酒酵母中重建卵假散囊菌素生物合成。使用antiSMASH（真菌版8.0.4）对金龟子绿僵菌E6基因组进行挖掘，发现65个候选次级代谢物基因簇。其中，一个位点被注释为NRPS–T1PKS–萜烯杂合基因簇，包含一个嵌入更大模块化组装中的萜烯相关区域（图1A）。由于烟曲霉fumagillin生物合成基因簇已被功能表征，以其经实验验证的途径酶为参考，指导金龟子绿僵菌中相应开放阅读框的注释。比较分析显示，所选金龟子绿僵菌区域与烟曲霉fumagillin基因簇之间存在局部基因组织保守性，从而在金龟子绿僵菌位点中分配了预测编码萜烯环化酶、细胞色素P450单加氧酶、双加氧酶和O-甲基转移酶的候选基因（图1B）。基于这些同源引导的分配，重建了推定卵假散囊菌素生物合成路线，彩色编码的候选基因对应其在骨架环化和下游氧化及修饰步骤中预测的催化角色（图1C）。详细比对统计见补充表S3。
金龟子绿僵菌E6的四个卵假散囊菌素生物合成候选基因经密码子优化后，在携带2μ复制起点的质粒上以不同组成型启动子（TDH3、TEF1、ADH1和GPD1）表达。SDS-PAGE在预期分子量处确认了重组蛋白表达。然而，LC-MS分析在测试条件下未检测到卵假散囊菌素产生，表明仅蛋白表达不足以在酿酒酵母中实现功能性途径重建。这一结果说明，成功的途径重建不仅需要候选基因的异源表达，还需要对酵母宿主的前体供应和途径平衡进行工程改造。
【数据】候选基因簇数：65个；检测方法：LC-MS；结果：未检测到卵假散囊菌素
3.2 酿酒酵母中卵假散囊菌素生物合成的途径重建与前体通量工程
为在酿酒酵母中重建卵假散囊菌素生物合成途径，研究实施了针对法尼基焦磷酸（FPP）分支点前体可用性、途径起始和上游甲羟戊酸通量强化的分步工程策略（图2A）。首先过表达编码法尼基焦磷酸合酶的ERG20以增强胞内前体供应。ERG20过表达（OVSE002）实现了卵假散囊菌素的首次可检测生产，产量为0.02 mg/L。为评估工程酵母平台所产物的身份，对培养物提取物进行LC–MS/MS分析。酵母来源化合物与化学合成卵假散囊菌素标准品具有匹配的保留时间，并表现出可比较的MRM转换和碎裂模式，支持其鉴定为卵假散囊菌素。
由于FPP主要通过ERG9编码的角鲨烯合酶分支流向甾醇生物合成，研究使用CRISPR–Cas9介导的基因组编辑将天然ERG9启动子替换为甲硫氨酸可抑制的MET3启动子，以减弱甾醇方向通量。单独进行ERG9启动子替换（OVSE002–1）未产生可检测的卵假散囊菌素，而ERG20过表达与ERG9启动子替换同时实施（OVSE003）使卵假散囊菌素产量相对于OVSE002提高至0.08 mg/L。OVSE003中观察到的增加表明，前体扩增与竞争分支抑制的组合有效改善了碳通量向重建卵假散囊菌素途径的流向（图2B）。在fumagillin生物合成途径中，β-反式-bergamotene由途径特异性萜烯环化酶生成，是关键的中间体。由于萜烯途径中间体的积累可能造成代谢负担并破坏微生物宿主的途径平衡，研究接下来考察了环化酶来源和表达强度是否影响途径性能。为此，来自金龟子绿僵菌和烟曲霉的倍半萜环化酶在不同强度启动子下表达。在四种构建体中，金龟子绿僵菌来源环化酶由弱CYC1启动子驱动的组合在测试配置中产生最高的卵假散囊菌素产量。相比之下，烟曲霉环化酶在强PGK1启动子下表达（OVSE003–3）未产生可检测的卵假散囊菌素。这些结果表明，平衡的环化酶表达而非最大转录强度是维持重建途径有效通量的关键（图2C）。HMG-CoA还原酶（HMGR）被广泛认为是酵母异戊二烯生物合成的关键调控步骤。为增强酿酒酵母萜类生产，过表达缺乏N端膜结合区域的截短HMGR变体（tHMGR）常被用于缓解内源调控约束。此外，来源于粪肠球菌的细菌HMGR属于进化上不同的II类HMGR，具有与真核酶不同的调控特性，被测试用于调控工程甲羟戊酸途径的通量。在OVSE004系列菌株中，粪肠球菌HMGR的表达产生最高的卵假散囊菌素产量，而酿酒酵母天然HMGR的过表达在该系列中产生最低滴度。据研究所知，粪肠球菌HMGR此前未见报道用于倍半萜生产，本结果证明了其与酵母萜类途径工程的兼容性（图2D）。综合而言，在FPP分支点、环化酶模块和甲羟戊酸途径的分步工程将酿酒酵母中卵假散囊菌素生物合成从0逐步提升至0.15 mg/L（图2E）。在各工程阶段，产量提升伴随生物量的适度降低，与强化前体通量造成代谢负担一致。重要的是，按细胞密度归一化后确认观察到的改善反映的是真正的途径增强而非生长相关效应。
【数据】ERG20过表达（OVSE002）：0.02 mg/L；ERG20过表达+ERG9启动子替换（OVSE003）：0.08 mg/L；最佳环化酶配置：CYC1p-Ma-cyclase；E. faecalis HMGR最高产量；最终产量：0.15 mg/L
3.3 内质网重塑、基因组稳定化和CPR配对用于氧化途径优化
真菌萜类生物合成中的氧化修饰反应由内质网（ER）定位的细胞色素P450单加氧酶催化。在工程酵母系统中，异戊二烯前体供应的强化已被报道可支持倍半萜生产，而脂质调控——
（原文节选在此处截断，后续内容包含ER重塑、基因组整合、CPR优化及膜转运工程等结果，以及皮肤微生物组模拟实验的详细数据）
讨论与解读
本研究通过多层工程策略在酿酒酵母中成功实现了卵假散囊菌素的生物合成与胞外分泌。研究团队从金龟子绿僵菌中鉴定出推定生物合成基因簇，结合烟曲霉fumagillin途径的参考注释，系统性地重建了完整合成途径。通过前体通量重分配、内质网扩张、P450还原酶配对优化及ABC转运蛋白介导的膜转运工程，总产量达到5.8 mg/L，胞外分泌量从0.2 mg/L提升至3.5 mg/L。在皮肤微生物组模拟群落中，工程酵母培养物的直接应用可选择性清除三种与皮肤菌群失调相关的马拉色菌属真菌，同时保留代表性有益细菌的活性，展示了分泌工程酵母作为活体生物平台在局部微生物组调控中的应用潜力。
编译者解读：该研究的技术亮点在于将"合成生物学途径重建"与"分泌工程"有机结合——多数酵母萜类研究止步于总产量提升，而本研究通过ABC转运蛋白共表达将代谢产物定向输出至胞外，直接服务于"活菌制剂外用"这一应用场景。PDR5与OSH3的协同表达实现产物分配重塑，这一策略对其它疏水活性代谢物的分泌生产具有借鉴意义。值得注意的是，研究采用皮肤微生物组模拟群落而非单一指示菌进行功能验证，更贴近实际应用条件。局限在于5.8 mg/L的绝对产量仍偏低，距商业化生产尚有距离；此外，工程酵母在真实皮肤环境中的存活与代谢活性仍需体内验证。
参考来源
Kim M. Multilayer engineering of Saccharomyces cerevisiae for ovalicin secretion enables selective fungal removal in a skin microbiome mimic. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2026.180338
DOI: 10.1016/j.cej.2026.180338