来源：Optimized Laccase production from the white rot fungi Pleurotus ostreatus and Trametes versicolor（Protein Expression and Purification）| 编译：DNA Lab Space
导读
漆酶作为一种多功能氧化酶，在制药、食品、造纸等行业具有广泛应用前景。本研究尝试在毕赤酵母中异源表达Trametes versicolor的三种漆酶异构体，但表达量不理想。转而开发了基于糖蜜和玉米浆的液体发酵工艺，利用两种白腐真菌——平菇（Pleurotus ostreatus, PO）和云芝（Trametes versicolor, TV）进行漆酶生产。通过响应面优化和诱导剂组合策略，漆酶活性最高达374,000 U/L，并成功应用于稻草木质纤维素的解聚和工业染料脱色。
研究背景
漆酶广泛存在于白腐真菌中，130年前首次从漆树汁液中被发现。这类酶属于氧化酶家族（EC 1.10.3.2），催化氧气还原为水的同时氧化底物生成自由基，可参与聚合与解聚反应。白腐真菌利用漆酶降解木质素，植物中漆酶与过氧化物酶协同参与细胞壁形成，芽孢杆菌中漆酶则与UV抗性孢子的发育相关。漆酶活性中心含有四个铜原子，其中T1铜位点负责底物氧化，赋予酶蛋白蓝色；T2和两个T3铜构成三核铜中心，负责将分子氧还原为水。漆酶在工业中应用广泛，如何在液体发酵条件下经济高效地生产漆酶具有重要的商业价值。
研究方法
2.1 通用试剂
ABTS及染料（Remazol brilliant blue、indigocamine、reactive black 5、aniline blue、crystal violet）购自Merck公司。酵母提取物、蛋白胨和糖类购自Himedia公司。EasySelect™ Pichia表达试剂盒购自Life Technologies公司。白腐真菌Pleurotus ostreatus（PO）和Trametes versicolor（TV）分别购自美国Aloha Medicinals公司和美国典型培养物保藏中心（ATCC）。
【数据】试剂来源：Merck、Himedia、Life Technologies；菌株来源：Aloha Medicinals（PO）、ATCC（TV）
2.2 真菌漆酶的分子克隆
从NCBI上Trametes versicolor 20789基因组序列中选取Lac 1、Lac 2、Lac 3三个基因。密码子优化后的序列克隆至pPICZalpha表达载体，按照制造商说明书（Life Technologies的EasySelect™ Pichia表达试剂盒）转化至毕赤酵母GS115宿主菌。转化细胞在含有不同浓度zeocin（100、500和2000 mg/L）的YPDS平板上，于30°C培养箱中培养2–10天直至菌落出现。从最高抗生素浓度平板上挑选重组子，通过菌落PCR确认，并通过发酵试验分析蛋白质产量。
【数据】基因来源：Trametes versicolor 20789；载体：pPICZalpha；宿主：Pichia pastoris GS115；zeocin浓度：100、500、2000 mg/L；温度：30°C；时间：2–10天
2.3 毕赤酵母中重组漆酶的表达
挑取单菌落接种于50 ml离心管中的5.0 ml BMGY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1.34%酵母氮碱、0.00004%生物素、1%甘油），30°C培养至OD 600 nm达到2.0–6.0。将5.0 ml培养物接种至1000 ml挡板瓶中的400 ml BMGY培养基，再次于30°C过夜培养至OD 600 nm达到2.0–6.0。室温下1500–3000×g离心5分钟收集细胞。弃去上清，将细胞沉淀重悬于2000 ml瓶中的500 ml BMMY培养基（BMGY中甘油替换为0.5%甲醇），使初始OD 600 nm为1.0。细胞在20°C摇床中培养。每24小时添加1.0%甲醇诱导表达，每次取1.0 ml培养样品分析，细胞游离上清和细胞沉淀通过离心分离，保存于−80°C备用。细胞游离上清中的蛋白质表达通过SDS-PAGE和ABTS底物功能分析检测。
【数据】BMGY成分：1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1.34%酵母氮碱、0.00004%生物素、1%甘油；BMMY甲醇浓度：0.5%；诱导甲醇浓度：1.0%；温度：30°C（生长）、20°C（诱导）；离心：1500–3000×g、5 min；OD 600 nm：2.0–6.0（生长）、1.0（诱导起始）
2.4 真菌培养生长条件
本研究中，真菌培养平板上的菌丝体经捣碎后接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板，25°C培养7天。真菌菌丝体储备液用马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）制备，以4%蛋白胨为终浓度保存于−80°C备用。种子接种时，PO菌丝体储备液接种于150 ml PDB培养基，25°C培养4天。随后转入250 ml PDB进行二级种子扩培，25°C培养7天。TV菌丝体储备液接种于250 ml PDB，25°C培养7天。
【数据】培养基：PDA、PDB；温度：25°C；时间：7天（平板）、4天（PO一级种子）、7天（PO二级种子/TV种子）；蛋白胨浓度：4%（储备液）
2.5 工业培养基的中心复合设计（CCD）
采用中心复合设计（CCD）确定真菌培养基中碳源和氮源的最佳比例。通过添加不同浓度的糖蜜和玉米浆（CSL）来改变糖和氮的浓度，具体见表1。含3.5%糖和27 g/L CSL的培养基作为中心点。
【数据】中心点：3.5%糖、27 g/L CSL
2.6 真菌发酵培养基的开发
开发了多种发酵培养基，典型组成包括：糖蜜99.47 g/L（5.6%糖）、玉米浆27 g/L、酵母提取物粉末1.0 g/L、硫酸亚铁0.2 mM、木质素磺酸钠10 g/L。制备了不同培养基，如蔗糖酵母提取物麦芽糖培养基（SYM）、全因子设计培养基（FFD）、木质素磺酸钠培养基（SLS）、添加2,5-二甲苯胺的SLS培养基（SLX），具体见表2。根据需要使用了硫酸铜、PMSF和2,5-二甲苯胺等多种诱导剂（表2）。每周添加1.2 mM硫酸铜和0.5 mM苯甲基磺酰氟（PMSF），持续至28天。
【数据】糖蜜：99.47 g/L（5.6%糖）；CSL：27 g/L；酵母提取物：1.0 g/L；硫酸亚铁：0.2 mM；木质素磺酸钠：10 g/L；硫酸铜：1.2 mM（每周）；PMSF：0.5 mM（每周）；时间：28天
2.7 漆酶活性测定
漆酶活性测定以2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）为底物。反应混合物含100 mM磷酸-柠檬酸盐缓冲液（pH 4.5）配制的6.0 mM ABTS。加入100 μL酶溶液启动反应，酶溶液为大肠杆菌细胞裂解液或毕赤酵母和真菌培养物的无细胞上清液。反应混合物在25°C下孵育，通过测量420 nm处吸光度增加值监测氧化反应（ABTS的Ɛ420nm = 36000 M⁻¹ cm⁻¹）。一个漆酶单位定义为在pH 4.5、25°C条件下每分钟氧化1.0 μmol ABTS所需的酶量[32]。
【数据】ABTS浓度：6.0 mM；缓冲液：100 mM磷酸-柠檬酸盐缓冲液 pH 4.5；酶量：100 μL；温度：25°C；波长：420 nm；Ɛ420nm = 36000 M⁻¹ cm⁻¹；定义：1 U = 每分钟氧化1.0 μmol ABTS
2.8 漆酶活性功能测定
琼脂平板分析中，在最小葡萄糖培养基琼脂平板中补充1.2 mM ABTS，将5 μl酶样品点样后于30°C培养箱中孵育，直至出现可见的绿色活性区域。微量滴定板用于高通量比色分析。每孔200 μl反应混合物含140 μl 100 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0）和20 μl上清液（酶溶液）。加入40 μl 6 mM ABTS溶液启动反应，终浓度为1.2 mM。观察到绿色着色即为阳性反应。
【数据】琼脂平板：1.2 mM ABTS、5 μl酶液、30°C；微量滴定板：140 μl缓冲液 + 20 μl酶液 + 40 μl 6 mM ABTS（终浓度1.2 mM）
2.9 天然PAGE分析
漆酶样品通过天然PAGE分析各同工酶。取TV和PO漆酶的第10天样品及商业漆酶，在10%天然聚丙烯酰胺凝胶上分析蛋白条带的凝胶内漆酶活性。天然凝胶用柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.5）洗涤三次，每次20分钟，然后用0.1% ABTS溶液染色直至活性条带出现。
【数据】凝胶浓度：10%；洗涤：柠檬酸-磷酸盐缓冲液 pH 4.5、3次×20 min；染色：0.1% ABTS
2.10 稻草木质纤维素的预处理
漆酶发酵液经Mira布（Sigma）过滤除去真菌菌丝体后获得。将稻谷秸秆加入100 ml无细胞发酵液中（7% w/v）。对照实验中，等量生物质在水（未处理对照）中孵育。处理24小时后，在扫描电镜下观察稻谷秸秆，并在2500×和5000×放大倍数下记录图像。
【数据】稻谷秸秆浓度：7% w/v；处理时间：24 h；放大倍数：2500×、5000×
2.11 染料脱色
使用PO（34,166 U/L）和TV（50,833 U/L）漆酶样品测试漆酶介导的染料脱色。各种染料的储备液（10,000 ppm）用水配制。10 ml反应混合物含漆酶样品（50 U/L）、染料（1000 ppm）和50 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.5）。反应样品在25°C下孵育，在0、3、6、24、30和48小时时间点记录吸收光谱。染料的脱色通过孵育时间内吸光度的降低来指示。
【数据】PO漆酶：34,166 U/L；TV漆酶：50,833 U/L；染料储备液：10,000 ppm；反应体系：50 U/L酶 + 1000 ppm染料 + 50 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液 pH 4.5；温度：25°C；时间点：0、3、6、24、30、48 h
2.12 酶稳定性测试
为评估所表达漆酶的温度稳定性，将PO和TV培养液上清中收集的样品在25°C和45°C下孵育，用ABTS作为底物在0、16和24小时记录活性。以0小时初始活性为参照（100%），将各时间点的残余活性对时间作图。
【数据】孵育温度：25°C、45°C；时间点：0、16、24 h；参照：0 h活性为100%
研究结果
3.1 云芝漆酶在毕赤酵母中的重组表达
按照方法部分所述，在毕赤酵母中进行了Lac1、Lac2和Lac3的异源表达。含ABTS的琼脂平板功能筛选证实了漆酶的存在（图1A）。然而，活性非常低。在毕赤酵母中表达的三种漆酶中，Lac3活性最低（2–3 U/g总分泌蛋白），其次是Lac2（5–7 U/g）和Lac1（7–10 U/g），表达时间为5–7天（图1B）。也尝试了大肠杆菌表达，但大部分表达的漆酶存在于不溶性组分中（数据未显示）。由于漆酶在细菌和酵母中的异源表达未达到预期滴度且可能需要进一步优化，因此使用天然真菌菌株（TV和PO）进行漆酶生产。
【数据】Lac3：2–3 U/g总分泌蛋白；Lac2：5–7 U/g；Lac1：7–10 U/g；表达时间：5–7天
3.2 真菌培养漆酶生产培养基的开发
使用TV和PO两种白腐真菌宿主进行发酵培养基适应和优化。最初测试蔗糖作为碳源（SYM培养基）进行漆酶生产。PO培养20天后获得最高活性2041 U/L（表2）。基于这些结果，决定使用甘蔗糖蜜（富含蔗糖）作为底物开发发酵培养基。采用"全因子设计"（FFD）筛选和"中心复合设计"（CCD）优化进行漆酶生产培养基开发。TV培养物用于这些优化。在FFD中测试甘蔗糖蜜、玉米浆和吐温80作为变量时，发现吐温80对提高漆酶活性不显著。因此，对前两个变量赋予新水平后使用CCD。FFD培养基在10天内产量为17,000 ± 3000 U/L（TV培养物）和23,889 ± 5358 U/L（PO培养物）。漆酶活性的增加与甘蔗糖蜜总糖含量的增加成正比（表2和图2）。不同培养基条件下真菌生物量无显著差异。铜、铁和木质素磺酸盐的组合使TV培养物的漆酶活性在15天内进一步增加至35,000 U/L（图3左）。据报道，这些因素均可增加漆酶产量，因为它们起辅因子或诱导剂的作用。在相似工艺条件下使用平菇时，漆酶产量提高了四倍，在25天内达到最大漆酶活性145,000 U/L（表2和图3）。观察到菌球大小与漆酶活性之间存在显著相关性。漆酶活性高的培养基条件下，真菌菌球尺寸较小（图3右）。确定了2,5-二甲苯胺的最佳浓度为0.8 mM并用于发酵过程。发酵21天后，TV获得161,811 U/L的活性（约4.6倍提高），PO获得374,262 U/L的活性（约2.5倍提高）。当培养物用1.2 mM CuSO₄诱导时，以7天为间隔补充。培养基开发各阶段和最高漆酶活性值汇总于表2。为增强从生物质中提取漆酶，测试了非离子型去污剂Triton X-100进行酶提取。发现经Triton X-100处理后，12–14%的细胞结合漆酶被释放到发酵液中（表3）。
【数据】SYM培养基PO最高活性：2041 U/L（20天）；FFD培养基TV：17,000 ± 3000 U/L（10天）；FFD培养基PO：23,889 ± 5358 U/L（10天）；铜+铁+木质素磺酸盐组合TV：35,000 U/L（15天）；PO最高：145,000 U/L（25天）；2,5-二甲苯胺最佳浓度：0.8 mM；TV终活性：161,811 U/L（21天，约4.6倍）；PO终活性：374,262 U/L（21天，约2.5倍）；CuSO₄：1.2 mM、7天间隔；Triton X-100释放细胞结合漆酶：12–14%
3.3 分泌漆酶的天然PAGE分析
定量酶分析显示TV和PO显著向培养基中分泌漆酶。将Novozymes的漆酶（1,600,000 U/L）与PO和TV漆酶一起分析比较（图4）。PO、Novozymes对照和TV之间的漆酶同工酶谱大小差异显著。PO和Novozymes样品具有单一明显条带，而TV样品至少有两个大小不同的显著同工酶条带。
【数据】Novozymes漆酶：1,600,000 U/L；PO：单一明显条带；TV：至少两个同工酶条带
3.4 木质素修饰酶稳定性测试
从PO和TV培养液上清中收集的木质素修饰酶样品在25°C和45°C下孵育，按方法部分所述在各时间点记录活性。TV和PO漆酶在45°C下的稳定性存在显著差异。PO漆酶在16小时内似乎失去活性，而TV样品在测试条件下24小时内保留了90%以上的活性（图5）。
【数据】45°C下PO漆酶：16 h内失活；45°C下TV漆酶：24 h保留>90%活性
3.5 稻谷秸秆的预处理
使用扫描电子显微镜分析TV漆酶处理和未处理的稻谷秸秆的形态特征。未处理的稻谷秸秆呈现刚性和致密的结构，孔隙直径较小（约3 μm）。经漆酶预处理后，观察到孔隙扩大至7 μm（图6）。这种稻谷秸秆表面积和孔隙率的增加可能增强了糖化过程，此前的文献[33]已有报道。PO漆酶预处理的稻谷秸秆在糖化后比TV漆酶产生更好的糖产量，因为PO漆酶选择性作用于底物木质素，而不影响其纤维素和半纤维素含量。
【数据】未处理稻谷秸秆孔隙：约3 μm；漆酶处理后孔隙：约7 μm
3.6 工业染料的脱色
在测试的染料中，reactive black 5和crystal violet均未被任何漆酶脱色。TV漆酶在靛蓝胭脂红（indigo carmine）和Remazol brilliant blue的脱色方面比PO漆酶更有效。对于靛蓝胭脂红，需要更高浓度的PO漆酶才能脱色。虽然1:10和1:100稀释的TV漆酶显示出脱色效果，但未稀释的TV漆酶呈深色。这可能是由于TV漆酶分泌培养基的颜色所致，而非缺乏活性。脱色也通过使用分光光度计测量可见光范围的吸光度来评估。在24小时内对TV漆酶处理样品记录了400 nm至800 nm的波长扫描（图7）。数据支持平板测定结果，Remazol brilliant blue和靛蓝胭脂红的脱色率最高，在24小时时吸光度完全消失，尽管脱色速率在后期较慢。苯胺蓝和crystal violet的吸收在24小时内适度降低，而reactive black的吸光度降低最小。
【数据】测试染料：reactive black 5、crystal violet（未脱色）、indigo carmine、Remazol brilliant blue（24 h完全脱色）、aniline blue（适度降低）；扫描波长：400–800 nm；时间：24 h
讨论与解读
漆酶因其多种应用在工业上被大量生产。工业发酵中，工艺的经济性很大程度上取决于菌株和发酵培养基的产量、滴度和生产率。重组DNA技术的发展使生物分子生产增强成为可能。此外，对于天然菌株的改良生产，培养基优化有助于最大化目标产物产量[34]。多个研究小组尝试在毕赤酵母中表达重组漆酶。Lin-Feng You等人克隆并表达了灵芝中的新型漆酶，展示了686 U/L的活性[35]。本研究中漆酶在毕赤酵母和大肠杆菌中的诱导表达虽然成功，但滴度不足以支持工业应用。大肠杆菌中表达的漆酶大部分不溶，毕赤酵母系统产生的重组漆酶仅为100–200 U/L。毕赤酵母中低表达滴度可能归因于各种翻译后修饰（包括分泌过程中的糖基化）以及发酵工艺条件（如pH、温度和培养基组成要求）的影响[36]。细菌系统在漆酶表达方面优于毕赤酵母，但酶存在于不溶性组分中且无功能。
本研究通过开发基于天然白腐真菌的液体发酵工艺，实现了漆酶产量的显著提升——从初始SYM培养基的2,041 U/L到优化后PO菌株的374,262 U/L，提高幅度超过180倍。这一成果表明，在某些情况下，对天然生产菌株进行系统的培养基工程优化，比异源表达策略更具实用价值。
编译者解读
本研究最具启发性的地方在于：当现代重组DNA技术（毕赤酵母/大肠杆菌异源表达）未能达到工业应用阈值时，作者果断转向了经典的白腐真菌液体发酵路线，通过响应面优化和多重诱导剂组合（铜离子、木质素磺酸钠、2,5-二甲苯胺），将漆酶产量推高至374 kU/L的行业领先水平。这一"以终为始"的策略选择值得合成生物学从业者反思——异源表达并非总是最优解，底盘菌株的内源调控网络与产物耐受性往往被低估。此外，研究同时验证了漆酶在生物质预处理和染料脱色两个实际场景中的有效性，形成了"菌株-工艺-应用"的完整证据链。局限性在于，发酵周期长达20余天，且最佳诱导剂2,5-二甲苯胺的毒性可能限制其规模化应用。
参考来源
Deshmukh A. Optimized Laccase production from the white rot fungi Pleurotus ostreatus and Trametes versicolor. Protein Expression and Purification, 2026. DOI: 10.1016/j.pep.2025.106813
DOI: 10.1016/j.pep.2025.106813