来源：The heterologous expression, characterization, and application of a novel laccase from Bacillus velezensis（Science of The Total Environment）| 编译：DNA Lab Space
导读
漆酶因能氧化多种底物而在环境治理和工业生产中具有巨大应用潜力。本研究从中国海南岛森林土壤中筛选到一株产漆酶的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）TCCC 111904，将其漆酶基因在大肠杆菌中异源表达，系统表征了重组漆酶（rLac）的酶学性质，并考察了其在多种染料脱色中的应用效果。该酶在80°C和宽pH范围内表现出优异的催化活性和稳定性，对高浓度NaCl具有良好耐受性，为印染废水处理提供了新的酶制剂候选。
研究背景
纺织工业大量使用蒽醌类、偶氮类、杂环类和三苯甲烷类合成染料，这些染料相比天然色素具有耐光、耐化学品和耐水洗等优势。纺织行业每天产生大量含有残余染料及有毒、致突变/致癌化学物质的废水。在一些欠发达地区，由于染料去除困难且成本高昂，数百万升未经处理的染料废水被直接排入水体，造成严重的水生生态破坏——水体着色降低光穿透效率和溶解氧水平。数十年来，混凝、吸附、臭氧化、Fenton反应等物理化学方法被用于染料降解和去除，但这些传统方法存在处理成本高、添加危险化学助剂、操作复杂以及可能造成二次污染等缺陷。漆酶作为一种绿色生物催化剂，为染料废水处理提供了替代方案。
研究方法
2.1 菌株、载体与试剂
大肠杆菌 JM109、大肠杆菌 BL21 (DE3) 和载体 pET-22b (+) 保存于实验室。ABTS、2,6-DMP、偶氮焰红、刚果红、阿迪佐黑 B、活性蓝 5、活性蓝 19、结晶紫、靛蓝胭脂红和孔雀石绿购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。限制性内切酶、Pyrobest DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、pMD18-T 载体克隆试剂盒、DNA 提取试剂盒、质粒小提试剂盒和凝胶回收纯化试剂盒购自 TaKaRa Bio Inc.（中国大连）。其他化学试剂购自当地供应商，均为分析纯。
【数据】菌株：E. coli JM109、E. coli BL21 (DE3)；载体：pET-22b (+)；试剂来源：Sigma-Aldrich、TaKaRa Bio Inc.；试剂纯度：分析纯
2.2 菌株筛选与培养条件
产漆酶菌株分离自中国海南岛森林土壤。筛选程序参照本课题组此前分离产新型 pH 稳定漆酶的肺炎克雷伯菌所用方法（Liu et al., 2017）。简要流程如下：将土壤样品（10 g）分散于无菌生理盐水（100 mL，0.9% NaCl）中。然后，将土壤悬液（1 mL）与 5 mL LB 液体培养基（酵母提取物 5 g/L、胰蛋白胨 10 g/L、NaCl 10 g/L）充分混合。富集细胞用无菌生理盐水连续稀释，涂布于含 0.2 mM Cu²⁺（硫酸铜）的 LB 琼脂平板上，37°C 培养 24 小时。向菌落上滴加数滴 0.1%（w/v）丁香醛连氮（SGZ）/无水乙醇溶液，通过观察粉红色出现来挑取漆酶活性阳性菌落（Wang et al., 2010）。阳性菌落进一步用 LB-Cu²⁺ 琼脂平板纯化，挑取呈现最深纯粉红色的菌落，通过测定漆酶活性进行确认。
【数据】土壤样品：10 g；无菌生理盐水：100 mL（0.9% NaCl）；LB 培养基：酵母提取物 5 g/L、胰蛋白胨 10 g/L、NaCl 10 g/L；Cu²⁺浓度：0.2 mM；SGZ 浓度：0.1%（w/v）；培养温度：37°C；培养时间：24 h
2.3 产漆酶菌株的鉴定与系统发育分析
提取具漆酶活性菌株的总 DNA，使用两株细菌通用引物通过聚合酶链式反应（PCR）扩增 16S rDNA：正向引物 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物 R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′（Suzuki and Giovannoni, 1996）。所得 PCR 片段插入 pMD18-T 载体，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞。随后，阳性转化子的 16S rDNA 由北京博奥生物公司（BGI Company，中国北京）测序。分离菌株首先通过将 16S rDNA 序列与 NCBI 数据库中的数据进行比对来初步鉴定，并使用 MEGA 6.0 软件以邻接法构建自举共识树进行系统发育分析（Tamura et al., 2013）。进一步依据《伯杰氏细菌鉴定手册》中的指导进行分类学分析以确认菌株鉴定结果（Holt et al., 1994）。
【数据】PCR 引物：F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′；测序公司：BGI Company（北京）；系统发育分析软件：MEGA 6.0；建树方法：邻接法
2.4 漆酶基因的克隆与同源表达
以基因组 DNA 为模板，使用引物 5′-CGCGGATCCGATGGCACTGGAAAAATTTG-3′（正向引物）和 5′-ACGCGTCGACCTGCTTATCCGTGACGTCC-3′（反向引物）（含 BamHI 和 SalI 酶切位点，下划线标注）通过 PCR 技术扩增完整漆酶基因。经 BamHI 和 SalI 双酶切后，插入经 BamHI-SalI 线性化的 pET-22b (+) 中，构建质粒 pET-lac。将 pET-lac 转化至大肠杆菌 BL21 (DE3) 后，带有 6 × His 标签的重组漆酶（rLac）在大肠杆菌 BL21 中异源表达。简要流程：阳性单菌落先在 5 mL 含氨苄青霉素（100 μg/mL）的 LB 培养基中、37°C、220 rpm 恒温摇床培养 12 小时。然后取起始培养物（1 mL）接入 50 mL LB 培养基，在上述条件下培养至 OD₆₀₀ 为 0.6 至 0.8。随后，向培养物中加入 1 mM 异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG），在 16°C 下诱导 rLac 表达 20 小时。同时，含空质粒 pET-22b (+) 的大肠杆菌 BL21 细胞作为对照。
【数据】扩增引物：正向 5′-CGCGGATCCGATGGCACTGGAAAAATTTG-3′、反向 5′-ACGCGTCGACCTGCTTATCCGTGACGTCC-3′；酶切位点：BamHI、SalI；氨苄青霉素浓度：100 μg/mL；培养温度：37°C；摇床转速：220 rpm；起始培养时间：12 h；接种量：1 mL/50 mL；诱导时 OD₆₀₀：0.6–0.8；IPTG 浓度：1 mM；诱导温度：16°C；诱导时间：20 h
2.5 rLac 的结构建模
使用 Swiss-Model 服务器（http://swissmodel.expasy.org/）以 B. subtilis 漆酶的晶体结构（PDB ID: 2WSD）为模板，结合 PyMOL 分子图形系统构建 rLac 的 3D 同源模型。
【数据】建模服务器：Swiss-Model；模板：B. subtilis 漆酶晶体结构（PDB ID: 2WSD）；分子图形系统：PyMOL
2.6 rLac 的纯化
离心收集的细胞（8000 ×g，4°C，15 min）重悬于含 20 mM 咪唑和 500 mM NaCl 的 20 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.0）中，随后在冰浴中于 320 W 条件下超声破碎（4 s 脉冲，3 s 间隔）。含 rLac 的上清液经离心（12,000 ×g，30 min，4°C）收集后，上样至预先用 50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.0）平衡的镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）琼脂糖凝胶柱（生工，中国上海）。使用洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl、500 mM 咪唑和 500 mM NaCl，pH 7.0）洗脱 rLac。最后，纯化的 rLac 经透析和过滤除菌。采用 SDS-PAGE 评估 rLac 的分子量和纯度。
【数据】离心条件：8000 ×g、4°C、15 min（收集菌体）；裂解缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 7.0）+ 20 mM 咪唑 + 500 mM NaCl；超声条件：320 W、冰浴、4 s 脉冲/3 s 间隔；离心条件：12,000 ×g、30 min、4°C（收集上清）；Ni-NTA 柱平衡缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 7.0）；洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl + 500 mM 咪唑 + 500 mM NaCl（pH 7.0）
2.7 rLac 活性测定
rLac 活性测定参照本课题组此前研究的方法（Liu et al., 2017）。简要流程：以 ABTS 和 2,6-DMP 作为 rLac 介导酶促反应的底物。ABTS 氧化反应在 420 nm 处监测吸光度，摩尔消光系数 ε₄₂₀ = 36,000 M⁻¹ cm⁻¹，ABTS 终浓度 6 mM，溶于 0.1 M 柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 5.5）。类似地，2,6-DMP（1.0 mM）氧化反应在 470 nm 处记录吸光度（ε₄₇₀ = 49,600 M⁻¹ cm⁻¹），底物溶于 0.1 M 柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。1 个漆酶活性单位（U）定义为在测定条件下每分钟氧化 1 μmol 底物所需的漆酶量。
【数据】ABTS 检测波长：420 nm；ε₄₂₀ = 36,000 M⁻¹ cm⁻¹；ABTS 终浓度：6 mM；缓冲液：0.1 M 柠檬酸-磷酸盐（pH 5.5）；2,6-DMP 检测波长：470 nm；ε₄₇₀ = 49,600 M⁻¹ cm⁻¹；2,6-DMP 浓度：1.0 mM；缓冲液：0.1 M 柠檬酸-磷酸盐（pH 7.0）；酶活单位定义：1 min 氧化 1 μmol 底物
2.8 rLac 的酶学表征
通过在不同温度（30°C 至 90°C）下进行标准反应，测定 rLac 氧化 ABTS 和 2,6-DMP 的最适温度。为评估 rLac 以 2,6-DMP 和 ABTS 为底物的最适 pH，酶促反应在不同 pH 缓冲液中进行，即 0.1 M 柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 3.0 至 8.0）和 0.1 M 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH 9.0）。以最大活性为 100% 计算相对酶活性。rLac 的热稳定性通过在不同温度（60°C、70°C 和 80°C）下处理 0 至 2 小时后，以 ABTS 和 2,6-DMP 为底物测定残余活性来确定。类似地，pH 稳定性通过在不同 pH 缓冲液（pH 3.0、7.0、9.0）中、4°C 下孵育不同时间（0–10 天）后计算残余活性来测定。未经处理的 rLac 活性记为 100%。金属离子（Cu²⁺、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺ 和 Mg²⁺）和抑制剂（EDTA、SDS、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇和 β-巯基乙醇）对 rLac 活性的影响，通过以 ABTS 为底物、在含各效应物的反应体系中测定相对酶活性来评估。不添加任何效应物时测得的漆酶活性记为 100%。
【数据】最适温度测定范围：30–90°C；pH 测定范围：pH 3.0–8.0（柠檬酸-磷酸盐缓冲液）、pH 9.0（甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）；热稳定性处理温度：60、70、80°C；处理时间：0–2 h；pH 稳定性孵育条件：4°C、pH 3.0/7.0/9.0、0–10 天；金属离子种类：Cu²⁺、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺；抑制剂种类：EDTA、SDS、L-半胱氨酸、DTT、β-巯基乙醇
2.9 染料脱色测定
rLac 的脱色能力通过将酶与不同类型染料在含 ABTS、乙酰丁香酮和丁香醛作为介体的反应体系中孵育来测定。染料终浓度：偶氮焰红（λmax = 530 nm）、阿迪佐黑 B（λmax = 607 nm）、活性蓝 19（λmax = 590 nm）、结晶紫（λmax = 587 nm）、靛蓝胭脂红（λmax = 612 nm）为 50 mg/L；活性蓝 5（λmax = 602 nm）、孔雀石绿（λmax = 618 nm）为 100 mg/L；刚果红（λmax = 501 nm）为 200 mg/L。脱色反应体系（5 mL）包含不同 pH 的缓冲液（0.1 M 柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH 5.5 和 7.0；0.1 M 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH 9.0）、染料和纯化后的 rLac。
【数据】染料种类与浓度：偶氮焰红/阿迪佐黑 B/活性蓝 19/结晶紫/靛蓝胭脂红 50 mg/L；活性蓝 5/孔雀石绿 100 mg/L；刚果红 200 mg/L；检测波长：530/607/590/587/612/602/618/501 nm；反应体系：5 mL；缓冲液：0.1 M 柠檬酸-磷酸盐（pH 5.5、7.0）、0.1 M 甘氨酸-氢氧化钠（pH 9.0）
研究结果
3.1 产漆酶菌株的分离与鉴定
鉴于细菌漆酶在工业应用中相比真菌和植物漆酶具有更宽的 pH 适应范围、更高的 pH 稳定性和热稳定性等优势，近年来大量从细菌中分离的新型漆酶被研究，尤其是芽孢杆菌属来源的漆酶。本研究成功从中国海南岛采集的土壤样品中分离到一株具有漆酶活性的菌株。该菌株的形态特征为：革兰氏阳性、杆状、产芽孢、菌落表面粗糙（数据未显示）。该菌株的 16S rDNA 经扩增、测序，并在 NCBI 数据库中通过 BLAST 比对。BLAST 结果显示，该菌株与芽孢杆菌属具有高度遗传同一性（>99%）。此外，系统发育分析表明，与该菌株亲缘关系最近的种为 B. velezensis（图1）。因此，结合 16S rDNA 序列比对、传统形态学特征和生化试验结果（数据未显示），将该菌株初步鉴定为 B. velezensis TCCC 111904。
【数据】16S rDNA 同源性：>99%（与芽孢杆菌属）；菌株形态：革兰氏阳性、杆状、产芽孢、菌落表面粗糙；鉴定结果：B. velezensis TCCC 111904
3.2 漆酶基因在大肠杆菌中的异源表达
从阳性转化子提取质粒进行核苷酸测序，确认克隆成功。lac 基因序列已提交 GenBank，登录号为 MK396097；其开放阅读框包含 1536 bp，理论上编码 512 个氨基酸，分子量约 58 kDa。比对分析确定，该蛋白序列与其他芽孢杆菌属漆酶具有高度同一性，包括：B. vallismortis fmb 103 漆酶，同一性 77.3%（Sun et al., 2017）；B. subtilis X1 漆酶，75.4%（Chen et al., 2015）；B. pumilus ATCC 7061 漆酶，65.9%（Ihssen et al., 2017）；以及 B. licheniformis ATCC 14580 漆酶，64.9%（Koschorreck et al., 2008）（图2）。根据文献检索与分析，这是首篇关于 B. velezensis 来源漆酶的报道。
以 B. subtilis 漆酶结构（PDB ID: 2WSD）为模板，通过同源建模构建了 rLac 的预测 3D 结构（图3）。芽孢杆菌属漆酶的活性中心高度保守，含有四个铜原子，其中一个结合在 T1 或 T2 铜中心，另外两个铜原子位于 T3 铜中心（Solomon et al., 1996）。类似地，rLac 活性位点也存在三个 Cu-氧化酶结构域：T1 铜中心（H419、C492、H497 和 M502）、T2 铜中心（H105 和 H422）和 T3 铜中心（H107、H153 和 H493/H155、H422 和 H491）。
含有质粒 pET-lac 的细胞裂解液在 16°C 下用 0.5 mM IPTG 诱导 20 小时后显示出显著的漆酶活性，而 E. coli BL21/pET-22b (+) 的裂解液中未观察到这种现象。对含有 B. velezensis TCCC 111904 漆酶基因的重组大肠杆菌培养物提取的粗蛋白进行分析，观察到约 58 kDa 的清晰蛋白条带。对照菌株 E. coli BL21/pET-22b (+) 的裂解液中未检测到类似蛋白条带（图4a）。随后，通过 Ni 亲和层析纯化粗 rLac，SDS-PAGE 凝胶上检测到约 58 kDa 的单一条带（图4b）。
尽管从不同芽孢杆菌种分离的漆酶显示出相近的酶学特征，但其分子量各不相同。来自新型嗜热菌 Bacillus sp. PC-3 的漆酶分子量为 36 kDa（Sharma et al., 2019），来自 B. amyloliquefaciens LC02 的非蓝色漆酶分子量约为 65 kDa（Chen et al., 2015），来自 B. subtilis 168 的 CotA 漆酶分子量约为 66 kDa（Zeng et al., 2016），来自 B. tequilensis SN4 的漆酶分子量为 32 kDa（Sondhi et al., 2014），来自 B. halodurans C-125 的碱性漆酶分子量约为 56 kDa（Ruijssenaars and Hartmans, 2004）。因此，从 B. velezensis TCCC 111904 分离的 rLac 将是漆酶家族的新补充。纯化后的 rLac 以 ABTS 和 2,6-DMP 为底物的比活力分别为 180 U/mg 和 380 U/mg。而其他芽孢杆菌菌株的漆酶活性较低。据报道，B. amyloliquefaciens LC02 的漆酶对 ABTS 的活性为 20.7 ± 1.2 U/mg（Chen et al., 2015），B. tequilensis SN4 的漆酶对 2,6-DMP 的活性为 299.4 U/mg（Sondhi et al., 2014）。不过，B. pumilus MK001 的漆酶对 ABTS 表现出相当的活性，为 182 U/mg（Kumar et al., 2016）。
【数据】lac 基因 GenBank 登录号：MK396097；ORF 长度：1536 bp；编码氨基酸数：512 个；理论分子量：约 58 kDa；序列同一性：B. vallismortis fmb 103 77.3%、B. subtilis X1 75.4%、B. pumilus ATCC 7061 65.9%、B. licheniformis ATCC 14580 64.9%；诱导条件：0.5 mM IPTG、16°C、20 h；rLac 比活力：ABTS 180 U/mg、2,6-DMP 380 U/mg；对照漆酶活性：B. amyloliquefaciens LC02 20.7 ± 1.2 U/mg（ABTS）、B. tequilensis SN4 299.4 U/mg（2,6-DMP）、B. pumilus MK001 182 U/mg（ABTS）
3.3 rLac 的酶学表征
rLac 在 80°C 时对 ABTS 和 2,6-DMP 的氧化表现出最大活性（图5a）。此外，rLac 在高温下和 60 至 90°C 的宽温度范围内能保持良好的催化能力。在 90°C 下氧化 2,6-DMP 时，rLac 的活性约为最大值的 80%。这一显著特征不同于真菌漆酶——真菌漆酶的最适温度在 30 至 60°C 之间，例如：担子菌 Cerrena sp. 的漆酶为 55°C（Yang et al., 2015），白腐真菌 Cerrena unicolor 菌株 GSM-01 的漆酶为 45°C（Wang et al., 2017），白腐真菌 Trametes sp. F1635 的漆酶为 50°C（Wang et al., 2018），Aureobasidium melanogenum 菌株 11–1 的漆酶为 40°C（Aung et al., 2019）。一些分离自嗜热真菌的真菌漆酶的最适温度与细菌漆酶相比仍明显偏低，例如来自 Coprinopsis cinerea 的真菌漆酶 Lcc9 最适温度为 60°C（Xu et al., 2019）。相比之下，细菌漆酶通常在更高的温度下表现出最佳催化能力，尤其是芽孢杆菌属来源的漆酶，例如：B. pumilus 菌株 W3 的 CotA-漆酶为 80°C（Guan et al., 2014a）；B. vallismortis 新菌株和 B. tequilensis SN4 的漆酶为 85°C（Sondhi et al., 2014；Zhang et al., 2012）；B. licheniformis LS04 的孢子漆酶为 60°C（Lu et al., 2012b）；B. licheniformis ATCC 9945a 的漆酶为 90°C（Lončar et al., 2016）。当然也存在例外，某些芽孢杆菌种漆酶的最适温度甚至低于真菌漆酶，例如 B. subtilis subsp. subtilis str. 168 的漆酶为 25°C（Yang et al., 2012）。
rLac 的热稳定性通过在 50、60、70 和 80°C 下孵育不同时间后评估其残余活性来研究。结果发现，在 60°C 孵育 120 分钟后，rLac 的残余活性约为初始值的 80%，在 50°C 下残余活性保持在 85% 以上。在 70°C 和 80°C 孵育后，rLac 的稳定性明显下降，但孵育 120 分钟后其活性仍分别保持原始值的 39.8% 和 26.4%（图6a）。这些结果表明，rLac 的热稳定性优于某些其他芽孢杆菌种来源的漆酶，如 Bacillus sp. ADR（Telke et al., 2011）、B. amyloliquefaciens 12B（Lončar et al., 2013）和 B. licheniformis ATCC 9945a（Lončar et al., 2016），并与 B. tequilensis SN4（Sondhi et al., 2014）、B. subtilis 168（Zeng et al., 2016）和 B. pumilus MK001（Kumar et al., 2016）的漆酶相当。因此，从新菌株 B. velezensis TCCC 111904 分离的 rLac 卓越的热稳定性可能使其能够直接应用于染色过程后排放的高温纺织废水的处理——染色过程通常在高温下进行（Dawkar et al., 2008；Lončar et al., 2013；Yang et al., 2015）。
【数据】最适温度：80°C（ABTS 和 2,6-DMP）；90°C 时活性：约为最大值 80%（2,6-DMP）；热稳定性：60°C/120 min 残余活性约 80%、50°C 残余活性 >85%、70°C/120 min 残余活性 39.8%、80°C/120 min 残余活性 26.4%
3.4 rLac 的 pH 特性
（原文结果部分后续内容未在节选中完整呈现，以下基于可获得的原文信息整理）
rLac 在 ABTS 和 2,6-DMP 为底物时的最适 pH 分别为 5.5 和 7.0（图5b）。rLac 在宽 pH 范围（pH 3.0、7.0 和 9.0）内表现出高 pH 稳定性。
【数据】最适 pH：ABTS 为底物 pH 5.5；2,6-DMP 为底物 pH 7.0；pH 稳定性范围：pH 3.0、7.0、9.0
3.5 rLac 的染料脱色性能
rLac 在高温（60°C）和宽 pH 范围（pH 5.5、7.0 和 9.0）下，对偶氮类、蒽醌类和三苯甲烷类等多种染料表现出高效的脱色能力。以 ABTS、乙酰丁香酮和丁香醛为介体，在不同 pH 条件下对 8 种染料进行脱色实验（图7）。rLac 对 NaCl 具有良好耐受性，在含 500 mM NaCl 的反应体系中，与对照相比仍保持 50.8% 的初始活性。
【数据】脱色温度：60°C；脱色 pH：5.5、7.0、9.0；介体：ABTS、乙酰丁香酮、丁香醛；NaCl 耐受性：500 mM NaCl 条件下残余活性 50.8%
讨论与解读
本研究从 Bacillus velezensis TCCC 111904 中克隆并异源表达了新型漆酶基因，系统表征了重组漆酶 rLac 的酶学性质。rLac 在 80°C 下对 ABTS 和 2,6-DMP 表现出最佳氧化活性，远高于多数真菌漆酶的最适温度（30–60°C）。在热稳定性方面，rLac 在 60°C 孵育 120 分钟后仍保持约 80% 活性，优于多种芽孢杆菌来源漆酶。rLac 在宽 pH 范围（pH 3.0–9.0）内具有高稳定性，且大多数金属离子对其活性无明显抑制。值得关注的是，rLac 在含 500 mM NaCl 的体系中仍保留 50.8% 的活性，表明其具有突出的耐盐性。在应用层面，rLac 在 60°C 和 pH 5.5–9.0 范围内对偶氮类、蒽醌类和三苯甲烷类染料均表现出高效脱色能力。这些特性表明 rLac 可作为印染废水处理及其他工业过程中的潜在候选酶制剂。
编译者解读
该研究的价值在于发现了一个兼具高热稳定性、宽 pH 适应性和耐盐性的细菌漆酶，且在大肠杆菌中实现了可溶性异源表达。相比真菌漆酶，rLac 在高温和高盐环境下的活性优势使其更贴近实际印染废水的处理工况——染色废水往往温度高、盐度高、pH 波动大。比活力数据（ABTS 180 U/mg、2,6-DMP 380 U/mg）在芽孢杆菌漆酶中处于较高水平。不过，异源表达仍依赖 IPTG 诱导，工业化生产的经济性有待评估；染料脱色实验虽覆盖了多种染料类型，但实际废水成分更为复杂，后续研究可探索固定化酶技术或与其他氧化酶的协同策略，以进一步提升其应用潜力。
参考来源
Li T. The heterologous expression, characterization, and application of a novel laccase from Bacillus velezensis[J]. Science of The Total Environment, 2020.
DOI: 10.1016/j.scitotenv.2020.136713
DOI: 10.1016/j.scitotenv.2020.136713