来源：Mediator-assisted tetracycline transformation and dye decolorization by a thermostable recombinant laccase from Yersinia enterocolitica（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space
导读
药物残留与合成染料是两类最难降解的环境污染物。本研究从肠道致病菌——小肠结肠炎耶尔森菌8081中克隆了漆酶基因YeLac，在大肠杆菌BL21中实现异源表达并完成生化表征。该酶最适温度达65°C，对ABTS和SGZ两种底物呈现截然不同的最适pH（3.5 vs 7.5），且在宽pH范围内保持良好稳定性。更关键的是，在ABTS氧化还原介体辅助下，1 U YeLac可在65°C下完全转化10 mg/L四环素，并显著降低其抗菌活性——这不仅是化学转化，更是功能性解毒。
研究背景
漆酶（EC 1.10.3.2）是一类多铜氧化还原酶，能以分子氧为末端电子受体，氧化多种酚类和非酚类底物，副产物仅为水。与依赖过氧化氢的过氧化物酶系统相比，漆酶无需外部氧化剂，避免了酶失活和过氧化物相关毒性问题。通过低分子量氧化还原介体（如ABTS、乙酰丁香酮、1-羟基苯并三唑）的参与，漆酶的底物谱可进一步扩展至催化位点无法直接接触的化合物。凭借广谱底物范围和环境友好的催化特性，漆酶已在食品加工、制浆造纸、纺织处理和环境修复等领域受到广泛关注，尤其在废水处理中的应用日益受到重视。
研究方法
2.1 化学品与试剂盒
酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl、EDTA、离心超滤装置及所有缓冲液组分均由Merck（德国达姆施塔特）提供。电泳及蛋白质分析所需试剂和溶剂，包括SDS、β-巯基乙醇、琼脂糖、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、溴酚蓝和考马斯亮蓝R-250，均购自Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特）。卡那霉素购自Fisher Bioreagent（美国新泽西州）。BCA蛋白定量试剂盒（Pierce™）和质粒提取试剂盒购自Macherey Nagel（德国）。HisTrap™ FF亲和层析柱购自Cytiva（瑞典）。蛋白分子量标准品由Bio-Rad提供（目录号161–0373）。作为漆酶底物/介体的2,2′-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）和丁香醛连氮（SGZ）购自Sigma-Aldrich（德国），四环素购自Merck（德国）。除非另有说明，所有其他试剂和化学品均为分析纯，购自Merck（德国）。
【数据】试剂来源：Merck、Sigma-Aldrich、Fisher Bioreagent、Macherey Nagel、Cytiva、Bio-Rad；ABTS和SGZ：Sigma-Aldrich；四环素：Merck
2.2 基因克隆与质粒构建
来自小肠结肠炎耶尔森菌8081基因组的漆酶基因（YeLac，Gene ID: 4715871，NCBI GenBank登录号NC_008800.1）全长1602个碱基对，编码533个氨基酸的蛋白质。该基因经密码子优化以实现在大肠杆菌中的高效异源表达，并由Gene Universal Inc.（美国纽瓦克）合成，通过NdeI和BamHI限制性酶切位点克隆至pET-28a(+)表达载体中。
【数据】基因长度：1602 bp；蛋白长度：533 aa；克隆载体：pET-28a(+)；酶切位点：NdeI和BamHI
2.3 YeLac的异源表达与纯化
重组质粒pET-28a(+)/YeLac首先通过热激转化法导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，以确保质粒的扩增和稳定性，操作步骤参照先前报道的方法[22]。转化子在添加卡那霉素（50 µg/mL）的Luria–Bertani（LB）琼脂平板上筛选。使用质粒小提试剂盒（Macherey Nagel）提取质粒DNA，通过限制性酶切结合琼脂糖凝胶电泳验证YeLac插入片段的存在。对于重组酶生产，将确认正确的pET-28a(+)/YeLac构建体转化至大肠杆菌BL21（DE3）细胞中。在含卡那霉素（50 µg/mL）的LB培养基中于37°C过夜培养的菌液，以1%（v/v）接种量转接至Studier自动诱导培养基。表达条件优化通过监测不同时间点（37°C下0–24 h）的蛋白产量以及测试不同温度（25°C和30°C，24 h和48 h终点）进行。基于SDS–PAGE分析，37°C诱导24 h获得最高表达水平和最一致的条带图谱，因此选择该条件用于后续大规模生产。细胞通过离心收集（4000 rpm，30 min，4°C），重悬于裂解缓冲液（20 mM磷酸钠，500 mM NaCl，5 mM咪唑，pH 7.4）中。悬液与溶菌酶（0.2 mg/mL，冰上30 min）孵育，随后进行超声破碎。所得裂解液通过离心澄清（12,000 × g，30 min，4°C）。C端His₆标签标记的YeLac蛋白使用Ni²⁺–NTA亲和层析纯化，采用HisTrap FF 1 mL柱（Cytiva），在ÄKTA系统上运行。含蛋白组分合并后用Amicon® Ultra离心超滤管（30 kDa MWCO）在50 mM柠檬酸缓冲液（pH 3.5）中于4°C浓缩。酶纯度通过12% SDS–PAGE确认，分子量进一步通过MALDI–TOF MS（Bruker microflex LT）验证。
【数据】筛选抗生素：卡那霉素50 µg/mL；接种量：1%（v/v）；最优表达条件：37°C、24 h；离心：4000 rpm、30 min、4°C；溶菌酶：0.2 mg/mL、冰上30 min；裂解液离心：12,000 × g、30 min、4°C；浓缩缓冲液：50 mM柠檬酸（pH 3.5）；SDS-PAGE：12%
2.4 YeLac活性测定
漆酶活性以0.5 mM ABTS和0.1 mM SGZ为底物进行测定。ABTS氧化在420 nm处监测（ε₄₂₀ = 36,000 M⁻¹ cm⁻¹），SGZ氧化在530 nm处测定（ε₅₃₀ = 65,000 M⁻¹ cm⁻¹），使用UV–Vis酶标仪。每个反应体系（总体积250 µL）含0.2 mM CuSO₄以确保酶的完全激活。ABTS测定在50 mM柠檬酸缓冲液（pH 3.5）中进行，SGZ测定在50 mM Tris–HCl缓冲液（pH 7.5）中进行，均在最适温度65°C下操作。反应孵育10 min后终止；ABTS测定加入150 µL 1.5 M三氯乙酸（TCA），SGZ反应则加入等体积（1:1，v/v）0.25 M Na₂CO₃以快速升高pH终止酶促氧化。漆酶活性（U L⁻¹）按以下公式计算：
U/L = (ΔE × Vt × 10⁶) / (ε × d × Vs)
其中，ΔE为每分钟在420 nm（ABTS）处的吸光度变化，Vt为反应总体积（L），ε为摩尔消光系数（M⁻¹ cm⁻¹），d为光程（cm），Vs为酶液体积（L）。系数10⁶用于将mol L⁻¹转换为µmol L⁻¹。SGZ测定使用相应波长和消光系数应用同一公式。一个酶活单位（U）定义为在最适条件下每分钟催化氧化1 µmol底物所需的酶量。所有测定均以底物空白（不含酶）进行校正，活性值以U/µL表示。
【数据】ABTS浓度：0.5 mM；SGZ浓度：0.1 mM；CuSO₄：0.2 mM；ABTS测定波长：420 nm（ε=36,000 M⁻¹ cm⁻¹）；SGZ测定波长：530 nm（ε=65,000 M⁻¹ cm⁻¹）；反应体积：250 µL；温度：65°C；孵育时间：10 min；ABTS终止：150 µL 1.5 M TCA；SGZ终止：等体积0.25 M Na₂CO₃
2.5 YeLac的生化表征
#### 2.5.1 最适pH和温度
纯化漆酶的最适pH和温度在明确规定的测定条件下系统确定。pH对酶活性的影响使用覆盖pH 2.5–10.0的系列50 mM缓冲液体系评估，包括柠檬酸缓冲液（pH 2.5–3.5）、醋酸钠缓冲液（pH 4.0–5.5）、磷酸盐缓冲液（pH 6.0–7.0）、Tris–HCl缓冲液（pH 7.5–9.0）和甘氨酸缓冲液（pH 9.5–10.0）。酶活性在各自缓冲液体系中于最适温度65°C下测定。温度对漆酶活性的影响在相应最适pH条件下监测底物氧化来确定，ABTS使用50 mM柠檬酸缓冲液（pH 3.5），SGZ使用50 mM Tris–HCl缓冲液（pH 7.5），温度范围为35°C至95°C，以5°C递增。
【数据】pH范围：2.5–10.0；缓冲液体系：柠檬酸（pH 2.5–3.5）、醋酸钠（pH 4.0–5.5）、磷酸盐（pH 6.0–7.0）、Tris–HCl（pH 7.5–9.0）、甘氨酸（pH 9.5–10.0）；温度范围：35–95°C，5°C递增
#### 2.5.2 Cu²⁺和NaCl浓度的影响
铜离子（Cu²⁺）和氯化钠（NaCl）对纯化YeLac催化活性的影响以0.5 mM ABTS为底物进行检测。酶促反应在已确定的最适条件（pH 3.5和65°C）下进行，总体积250 µL。金属离子测定中，向反应体系中加入不同浓度的CuSO₄（0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 mM），评估铜对酶活性的浓度依赖性效应。NaCl在5至500 mM浓度范围内测试，反应体系中含0.2 mM CuSO₄，对应YeLac活性的标准辅因子条件。所有反应均设三次重复，残余活性以相对于标准测定条件下（不添加额外NaCl或Cu²⁺）的对照反应（100%）表示。
【数据】CuSO₄浓度梯度：0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mM；NaCl浓度范围：5–500 mM；ABTS：0.5 mM；pH 3.5；温度：65°C；总体积：250 µL；重复次数：3次
#### 2.5.3 动力学参数
动力学表征中，纯化YeLac的催化参数包括米氏常数（K_m）、最大反应速度（V_max）、转换数（k_cat）和催化效率（k_cat/K_m），以ABTS和SGZ为底物测定。酶活性在各自最适条件下测定：ABTS为pH 3.5、65°C，SGZ为pH 7.5、65°C，ABTS底物浓度范围为0.5至8.5 mM，SGZ为0.1至2.5 mM。动力学参数通过将实验数据拟合至Lineweaver–Burk模型获得。YeLac的动力学行为遵循米氏动力学，描述为：v = V_max × [S] / (K_m + [S])。转换数（k_cat）和催化效率（k_cat/K_m）通过以下关系确定：k_cat = V_max/[E_t]，催化效率 = k_cat/K_m。
【数据】ABTS浓度范围：0.5–8.5 mM；SGZ浓度范围：0.1–2.5 mM；ABTS测定条件：pH 3.5、65°C；SGZ测定条件：pH 7.5、65°C；拟合模型：Lineweaver–Burk
研究结果
3.1 YeLac的表达与纯化
从转化至大肠杆菌DH5α细胞中的pET28a(+)/yelac质粒分离后，进行限制性酶切以确认yelac基因的存在，结果如图S1所示。分别用BamHI-HF和NdeI单酶切的质粒样品呈现约6800 bp的单一条带，对应线性化载体。相比之下，BamHI-HF和NdeI双酶切产生约1602 bp和5320 bp的两条清晰条带，分别代表yelac基因插入片段和pET28a(+)质粒骨架。这些结果明确证实了重组pET28a(+)/yelac质粒的成功构建。
YeLac在大肠杆菌BL21（DE3）细胞中利用自动诱导培养基的生产和优化如图S2和图S3所示。结果表明，37°C诱导24 h后获得最高表达水平（图S3）。MALDI-TOF/MS分析显示YeLac的分子量为56.9 kDa，与SDS-PAGE图谱一致（图S2和图S4）。YeLac的分子量也与许多细菌漆酶的报道值相当[10,25]。
YeLac纯化流程的综合评估见表1，显示各步骤中酶纯度逐步提高。粗细胞提取物的总活性为5679.6 U，比活性为565.54 U/mg蛋白。通过Ni-NTA亲和柱纯化将比活性显著提升至5888.18 U/mg，实现10.41倍纯化。随后的超滤进一步浓缩酶并提高比活性至6102.01 U/mg，总纯化倍数为10.79，总回收率为28.45%。重组细菌漆酶已有类似的纯化趋势报道，其中亲和层析显著提高了比活性和酶纯度[26,27]。这些结果表明YeLac可以高效生产和纯化为高活性形式，支持其适用于后续生化表征和潜在的放大应用。
【数据】单酶切条带：~6800 bp；双酶切条带：1602 bp + 5320 bp；分子量：56.9 kDa；粗酶总活性：5679.6 U；粗酶比活性：565.54 U/mg；Ni-NTA后比活性：5888.18 U/mg；纯化倍数：10.41；超滤后比活性：6102.01 U/mg；总纯化倍数：10.79；总回收率：28.45%
3.2 YeLac的生化表征
使用ABTS和SGZ作为底物评价时，YeLac的pH依赖性表现出显著的底物特异性。对ABTS的最大活性出现在pH 3.5，而SGZ的最适pH确定为7.5（图2a）。这种底物依赖性行为是漆酶公认的特征，因为酚类和非酚类底物的电离状态和氧化还原电位随pH值变化很大。多项研究表明漆酶的最适pH因氧化底物不同而不同，反映了酶-底物相互作用和催化机制的差异。例如，据报道云芝（Trametes versicolor）漆酶对ABTS的最适pH为2.2，对SGZ为7.0，支持漆酶系统中底物特异性pH偏好的概念[28]。本研究观察到的ABTS酸性最适与先前关于芽孢杆菌属CotA型漆酶的报道一致，该类酶对ABTS的最大活性通常在pH 3–5范围内[29]。相比之下，YeLac在中性至弱碱性条件下对SGZ保持高催化活性的能力使其区别于许多先前表征的漆酶[30,31]。此外，在高达pH 9.5时检测到的显著残余活性表明其具有明显的耐碱特性，提示YeLac可能为需要在宽pH范围内灵活操作的应用提供实际优势。这种底物依赖性行为也表明YeLac具有催化灵活性，能够在pH条件和底物组成都可能变化的复杂环境中使用。
温度依赖性活性测定显示，YeLac对两种底物均在65°C达到最大活性。高于此温度时，催化活性显著下降（图2b）。该最适温度落在耐热细菌漆酶的报道范围内，此类酶的最适催化性能通常在55至80°C之间[31,32]。特别是，嗜热菌（Thermus thermophilus）漆酶（TthLAC）据报道最适温度为65°C，表明其热谱与YeLac高度可比[33]。YeLac的高温最适性可能支持其在高温工业过程中的应用。高温下增强的催化效率进一步支持YeLac用于加速化学污染物降解的可行性[11]。先前研究表明，塑料残留物和多种有机污染物在较高温度下由于分子流动性和反应动力学增强而更易被氧化降解[34]。在此背景下，YeLac的高温最适性代表了有利于过程强化和高效生物修复策略设计的一个有利属性。这种热稳健性对工业过程尤为有利，因为高温可以提高反应速率、底物溶解度和整体过程效率。
底物依赖性催化性能进一步通过在各自最适条件下测定动力学参数来评估。YeLac对ABTS和SGZ的动力学参数见图2c和图2d，并在表2中汇总比较。K_m值对ABTS为773.9 µM，对SGZ为86.5 µM，表明对SGZ的底物亲和力显著更高。与此一致，SGZ的催化效率（k_cat/K_m = 1.38 µM⁻¹ s⁻¹）是ABTS（0.58 µM⁻¹ s⁻¹）的两倍以上，证明SGZ是YeLac动力学上的偏好底物。虽然ABTS的转换数（k_cat = 449.1 s⁻¹）高于SGZ（k_cat = 119.4 s⁻¹），但SGZ的低得多的K_m值使其总体催化性能更优。这些结果表明底物结合亲和力而非转换速率在决定YeLac的底物偏好中起主导作用。SGZ观察到的较低K_m值和较高催化效率与YeLac的pH活性谱一致，因为该酶在pH 7.5时对SGZ表现出最大活性，而ABTS氧化在pH 3.5达到峰值（图2a）。在中性至弱碱性条件下的增强性能，加上在高达pH 9.5时仍保留的可测量活性，表明YeLac耐受碱性环境。这种行为不同于许多真菌漆酶——后者通常在酸性条件下表现出最佳活性——提示YeLac可能在更宽的操作pH窗口中有效发挥作用[41]。
如表2所汇总，YeLac的动力学参数与先前报道的细菌漆酶对ABTS的参数一致，而其显著较低的K_m和较高的SGZ催化效率使其区别于若干代表性酶。报道的细菌漆酶K_m值通常在100–1000 µM范围内，使YeLac的动力学行为符合该类酶的预期谱图[10,42]。相比之下，某些耐热漆酶据报道在酸性条件下对ABTS和SGZ均表现出较高的K_m值，表明底物亲和力较低。考虑到SGZ是酚类底物，YeLac对该化合物相对较低的K_m和高催化效率表明该酶可能对酚类结构的氧化具有有利的催化特性[43]。当与其耐碱性和热稳健性综合解读时，
【数据】ABTS最适pH：3.5；SGZ最适pH：7.5；最适温度：65°C（两种底物）；pH 9.5时仍有显著残余活性；K_m(ABTS)：773.9 µM；K_m(SGZ)：86.5 µM；k_cat(ABTS)：449.1 s⁻¹；k_cat(SGZ)：119.4 s⁻¹；k_cat/K_m(ABTS)：0.58 µM⁻¹ s⁻¹；k_cat/K_m(SGZ)：1.38 µM⁻¹ s⁻¹
讨论与解读
本研究成功表达并表征了来自小肠结肠炎耶尔森菌的重组漆酶，揭示了一种能够在宽泛pH和温度条件下操作的稳定且具有催化活性的酶。除常规酶学表征外，YeLac还展示了转化结构多样的污染物（包括合成染料和四环素）的能力，凸显了其作为生物催化剂的多功能性。本工作的一个关键成果是证明酶促转化不应仅基于化学去除来评估——四环素转化后观察到的抗菌活性降低表明其生物学活性确实下降，而非简单的结构转化。这些发现强调了在评估抗生素污染物的酶促处理时，将化学分析与生物学评估相结合的重要性。结果还强调了氧化还原介体在漆酶催化反应中的重要性，因为无介体体系与ABTS辅助体系之间的显著差异表明介导电子转移对四环素氧化至关重要。本研究以ABTS作为模型介体，在受控条件下评估YeLac的催化行为。总体而言，YeLac作为一种耐热细菌漆酶，能够转化染料和四环素，同时降低残余抗菌活性。
编译者解读：从合成生物学应用视角看，YeLac的价值体现在三个层面：其一，65°C的最适温度契合工业废水处理中的高温工况，避免了中温酶在实际应用中常见的快速失活问题；其二，将"化学转化"与"生物活性消除"区分评估的策略值得推广——抗生素降解研究中普遍存在的误区是仅关注母体分子去除，而忽视转化产物的生物毒性残留；其三，ABTS介体依赖性的发现提示，在实际应用中需配套设计介体回收或固定化方案以控制成本。局限在于本研究仍停留在游离酶水平，后续可探索将YeLac固定化或展示于细胞表面以提升操作稳定性。
参考来源
Özdemir, F. İ. (2026). Mediator-assisted tetracycline transformation and dye decolorization by a thermostable recombinant laccase from Yersinia enterocolitica. Enzyme and Microbial Technology. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110903
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110903