来源：Heterologous expression and characterization of three laccases obtained from Pleurotus ostreatus HAUCC 162 for removal of environmental pollutants（Journal of Hazardous Materials）| 编译：DNA Lab Space
导读
氯酚类（CPs）、硝基酚类（NPs）和磺胺类抗生素（SAs）是三类普遍存在且毒性显著的环境污染物。本研究从平菇（Pleurotus ostreatus HAUCC 162）中克隆了三个漆酶同工酶基因 lacc6、lacc9 和 lacc10，在毕赤酵母中实现了异源表达，并系统考察了重组漆酶在漆酶-介体系统（LMS）中对三类污染物的降解效率。结果显示，重组漆酶对9种目标污染物的去除率在28.9%至98.1%之间，并通过LC–MS/GC–MS分析提出了相应的降解途径。
研究背景
近年来，大量合成化合物（如溶剂、抗生素、杀虫剂、杀菌剂和除草剂）的排放引发了严重的环境问题。氯酚类（CPs）广泛用作农药、除草剂、杀菌剂及氯酚类产品的前体，多项研究已证实其存在于废水、污泥、地表水和地下水中。毒代动力学研究和致癌效应实验揭示了氯酚的毒性，美国环境保护署已将其列入优先控制污染物名单。硝基酚类（NPs）是煤炭转化和石油精炼等工业过程的产物，由于硝基的存在，这类高毒性化合物比非取代类似物更难生物降解，且具有持久性、高毒性和水溶性，容易在环境中积累。磺胺类抗生素（SAs）的残留同样引发环境担忧。漆酶作为一种绿色生物催化剂，在环境污染修复中具有应用潜力，但其天然来源的产量和稳定性限制了实际应用。异源表达是提高漆酶产量和优化其性能的有效策略。
研究方法
2.1 菌株、培养基与载体
P. ostreatus HAUCC 162为栽培品种，购自华中农业大学菌种保藏中心（保藏编号HAUCC 162，中国湖北）。P. ostreatus HAUCC 162保存在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上。毕赤酵母GS115和质粒pPIC3.5K购自Invitrogen公司。MD、BMM和BMMY培养基按照毕赤酵母表达试剂盒（Invitrogen）说明书配制。Escherichia coli Trans1-T1（TransGen）用作感受态细胞。
【数据】菌株：P. ostreatus HAUCC 162、Pichia pastoris GS115、E. coli Trans1-T1；培养基：PDA、MD、BMM、BMMY；质粒：pPIC3.5K
2.2 表达载体的构建
以总RNA为模板，使用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA，日本）合成第一链互补DNA。以单链cDNA为模板进行PCR扩增双链全长漆酶cDNA。获得三个漆酶cDNA（补充材料图S1），克隆至pMD18-T载体（TAKARA）进行测序，确认分别为lacc6、lacc9和lacc10。随后通过高保真PCR克隆漆酶编码序列，并用相应限制性内切酶进行酶切。将酶切片段插入pPIC3.5K表达载体，构建pPIC3.5K-lacc6、pPIC3.5K-lacc9和pPIC3.5K-lacc10。本研究所用寡核苷酸引物见补充材料表1。
【数据】逆转录试剂盒：PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA）；克隆载体：pMD18-T；表达载体：pPIC3.5K；基因：lacc6、lacc9、lacc10
2.3 转化、筛选、培养及重组漆酶的生产
表达质粒首先用Pme I限制性内切酶线性化，然后按照毕赤酵母表达试剂盒（Invitrogen）说明书中的电穿孔方法转化至Pichia pastoris GS115（Invitrogen）。电穿孔后的毕赤酵母细胞涂布于MD琼脂平板，筛选His+转化子。然后从MD琼脂平板上随机挑选转化子，接种于含有CuSO₄（0.1 mmol/L）和ABTS（0.2 mmol/L）的BMM琼脂平板上，于28°C培养。在甲醇诱导下，阳性重组子的分泌表达通过重组子周围出现深绿色区域来鉴定。将具有深绿色区域的细胞从BMM平板转移，用作液体BMM培养基中漆酶生产的接种物，操作按毕赤酵母表达试剂盒说明进行。漆酶活性测定和蛋白质纯化按先前描述的方法进行[28]。
【数据】线性化酶：Pme I；筛选平板：MD琼脂、BMM琼脂（含0.1 mmol/L CuSO₄、0.2 mmol/L ABTS）；温度：28°C；诱导物：甲醇
2.4 纯化重组漆酶的SDS-PAGE和Native-PAGE分析
SDS-PAGE在小型电泳装置（BioRad，美国）上进行，使用5%浓缩胶和12%分离胶。SDS-PAGE中蛋白条带用考马斯亮蓝R-250染色，Native-PAGE中用2,6-DMP染色。SDS-PAGE使用ProteinRuler I和II（Transgen）作为蛋白标记，Native-PAGE使用Blue Plus Protein Marker（Transgen）作为预染标准蛋白。
【数据】SDS-PAGE：5%浓缩胶、12%分离胶；染色：考马斯亮蓝R-250（SDS-PAGE）、2,6-DMP（Native-PAGE）；电泳装置：BioRad
2.5 重组漆酶的生化表征
#### 2.5.1 重组漆酶的动力学研究
动力学研究在0.05 M醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.8）中于30°C进行，以ABTS、2,6-DMP和愈创木酚为底物。分别监测420 nm、470 nm和465 nm处的吸光度。重组漆酶的动力学参数通过Lineweaver-Burk法计算。
【数据】缓冲液：0.05 M醋酸-醋酸钠（pH 4.8）；温度：30°C；底物：ABTS、2,6-DMP、愈创木酚；检测波长：420 nm、470 nm、465 nm；计算方法：Lineweaver-Burk法
#### 2.5.2 pH和温度对漆酶活性及稳定性的影响
为确定最适温度，在0.05 M醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 5.0）中，以ABTS为底物，测定不同温度（20–90°C）下的漆酶活性。pH对漆酶活性的影响在30°C下测定，pH范围为2.0至10.0，使用甘氨酸-HCl缓冲液（pH 2.0）、Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液（pH 3.0–8.0）和NaOH-KCl缓冲液（pH 9.0–10.0）。温度稳定性通过将纯化漆酶在20至60°C范围内孵育来测定。pH稳定性通过将纯化酶在相应缓冲液中于4°C预孵育6、12和24小时来检测。
【数据】最适温度测定：20–90°C，0.05 M醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 5.0），底物ABTS；最适pH测定：30°C，pH 2.0–10.0；温度稳定性：20–60°C；pH稳定性：4°C，6、12、24 h
2.6 LMS降解硝基酚、氯酚和磺胺类化合物
使用三种硝基酚、三种氯酚和三种磺胺类化合物评估重组漆酶降解不同环境污染物的能力（表1）。测定在25°C下进行。反应混合物总体积为1 mL，包含（终浓度）：醋酸缓冲液（50 mM，pH 4.8）、污染物（硝基酚、氯酚和磺胺类化合物：100 mg/L）和200 U/L纯化漆酶。污染物浓度通过配备UV检测器（270 nm）的HPLC（SHIMADZU）测定。超纯水-甲醇作为流动相，水与甲醇的比例（v/v）分别为60:40（3-CP、M-NP和O-NP）、40:60（P-NP、2-CP、4-CP和2,4-DCP）和25:75（SDZ、SMZ和SMX）。使用Waters XTERRA MS C18色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）在40°C下分离不同污染物，流速为1.0 mL min⁻¹，每个样品进样量为10 μL。污染物残留浓度随时间的变化用一级动力学常数分析。
为分析不同污染物可能的降解途径，选择2,4-DCP、4-NP和SDZ进行进一步研究，使用rLACC6在丁香酸存在下降解这些污染物。污染物降解在1 mL反应混合物中进行，包含醋酸缓冲液（50 mM，pH 4.8）、100 mg/L污染物（2,4-DCP、4-NP和SDZ）、1 mM丁香酸和200 U/L纯化rLACC6，于30°C进行。SDZ反应混合物孵育10 min，然后用超滤管（Millipore 3 kDa）过滤去除漆酶蛋白，再用醋酸纤维素滤膜（0.22 μm）过滤，随后进行LC–MS（1100 LC/MSD Trap Agilent）分析。2,4-DCP和4-NP反应混合物孵育60 min后，用超滤管（Millipore 3 kDa）过滤去除漆酶蛋白，再用醋酸纤维素滤膜（0.22 μm）过滤，随后进行LC–MS分析。另加乙酸甲酯萃取步骤用于GC–MS（7890A/5975C，Agilent）分析。
【数据】降解温度：25°C；反应体系：1 mL（50 mM醋酸缓冲液 pH 4.8 + 100 mg/L污染物 + 200 U/L漆酶）；HPLC检测波长：270 nm；流动相：水/甲醇（60:40、40:60、25:75）；色谱柱：Waters XTERRA MS C18（250×4.6 mm，5 μm）；柱温：40°C；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；途径分析：100 mg/L污染物 + 1 mM丁香酸 + 200 U/L rLACC6，30°C；SDZ孵育10 min，2,4-DCP和4-NP孵育60 min
研究结果
3.1 从*P. ostreatus* HAUCC 162克隆*lacc6*、*lacc9*和*lacc10*编码序列并在毕赤酵母中异源表达
从P. ostreatus HAUCC 162中克隆了含有完整开放阅读框的lacc6（GenBank登录号KX815352）、lacc9（登录号KX815353）和lacc10（登录号KX815354）全长cDNA。DNA序列分析显示，LACC6、LACC9和LACC10分别具有20、23和23个氨基酸的N端信号肽序列，随后分别是513、506和510个氨基酸的成熟漆酶序列。此外，LACC6、LACC9和LACC10分别含有四个、三个和两个可能的预测N-糖基化位点（Asn-Xaa-Ser/Thr）。使用DNAMAN软件生成了LACC6、LACC9和LACC10以及其他漆酶蛋白的多氨基酸序列比对（图1）。LACC6、LACC9和LACC10蛋白含有典型漆酶的四个保守特征序列，即L1（TSIHWHTGFF）、L2（GTFWYHSHL）、L3（HPFHLHGH）和L4（FLHCHIDWHI）[29]。使用SWISS-MODEL在线服务和Swiss PDB Viewer软件[30]基于氨基酸序列构建了LACC6、LACC9和LACC10的结构。LACC6、LACC9和LACC10包含三个杯状结构域，每个结构域含有β-折叠、卷曲和环状结构（补充材料图S2）。
质粒pPIC3.5K-lacc6、pPIC3.5K-lacc9、pPIC3.5K-lacc10和对照载体pPIC3.5K（无插入基因）被转化至毕赤酵母GS115。PCR检测（补充材料图S3）和ABTS平板检测证实了lacc6、lacc9和lacc10在毕赤酵母中的成功表达，以及其漆酶蛋白分泌至培养基中（图2A）。培养物中的漆酶活性每天测定（图2B），GS115-pPIC3.5K-lacc6、GS115-pPIC3.5K-lacc9和GS115-pPIC3.5K-lacc10在孵育13天后分别达到最高漆酶活性683.1、36.1和32.3 U/L。阴性对照GS115-pPIC3.5K的培养上清液中未检测到胞外漆酶活性，进一步证明漆酶基因在毕赤酵母中成功表达，活性漆酶能够正确产生和分泌。如上所述，转化子GS115-pPIC3.5K-lacc6表现出最高的漆酶活性，显著高于GS115-pPIC3.5K-lacc9和GS115-pPIC3.5K-lacc10。表达水平差异可能有几个原因，如分泌信号序列不同[31,32]、密码子偏好性[33]以及酵母基因组中转化基因的拷贝数[34,35]。酵母的培养方法也可能影响重组漆酶的产生。通过改进培养基组成、接种量和每日甲醇添加量（数据未显示），GS115-pPIC3.5K-lacc6、GS115-pPIC3.5K-lacc9和GS115-pPIC3.5K-lacc10培养上清液中的漆酶活性可分别提高至3500、120和120 U/L。
【数据】基因登录号：KX815352（lacc6）、KX815353（lacc9）、KX815354（lacc10）；信号肽长度：20、23、23 aa；成熟蛋白长度：513、506、510 aa；N-糖基化位点：4、3、2个；最高漆酶活性：683.1 U/L（lacc6）、36.1 U/L（lacc9）、32.3 U/L（lacc10），13天；优化后：3500、120、120 U/L
3.2 重组漆酶的纯化与表征
#### 3.2.1 重组漆酶的纯化与动力学研究
重组漆酶rLACC6、rLACC9和rLACC10分别从毕赤酵母转化子的培养上清液中纯化。纯化的重组漆酶随后用SDS-PAGE和Native-PAGE分析（补充材料图S4）。纯化的rLACC6、rLACC9和rLACC10在SDS-PAGE中均呈现单一蛋白条带。通过SDS-PAGE迁移率测定的表观分子量分别为64（rLACC6）、75（rLACC9）和64 kDa（rLACC10）。本研究中重组漆酶在Native-PAGE中的条带位置与先前报道的从P. ostreatus分离的漆酶相似[36,37]。有趣的是，不同漆酶在Native-PAGE中的条带位置与其表观分子量不一致，这是由于不同漆酶同工酶的结构差异所致，反映在其不同的性质上。
表2详细列出了以ABTS、DMP和愈创木酚为底物测定的重组漆酶的主要动力学参数。对于rLACC6，最低Km和最高Kcat在DMP底物中获得，分别为238 μM和85.58 s⁻¹。rLACC9和rLACC10的相应值分别为413和43 μM以及20.10和15.50 s⁻¹，均在ABTS底物中获得。愈创木酚底物被rLACC6和rLACC9氧化的效率最低，而rLACC10在本测试中对愈创木酚没有表现出氧化活性。
【数据】分子量：64 kDa（rLACC6）、75 kDa（rLACC9）、64 kDa（rLACC10）；rLACC6动力学（DMP）：Km=238 μM，Kcat=85.58 s⁻¹；rLACC9动力学（ABTS）：Km=413 μM，Kcat=20.10 s⁻¹；rLACC10动力学（ABTS）：Km=43 μM，Kcat=15.50 s⁻¹
#### 3.2.2 pH和温度对漆酶活性及稳定性的影响
以ABTS为底物时，rLACC6、rLACC9和rLACC10的最适pH分别为2.5、3.5和4.0（图3）。真菌漆酶氧化ABTS的最适pH通常在酸性范围内，酚类物质的E₀被认为随pH升高而降低，这是由于氧化性质子释放所致[18]。然而，氢氧根阴离子与漆酶T2/T3位点的结合会中断T1与T2/T3中心之间的内部电子转移，导致酶活性降低。漆酶的钟形pH曲线源于这两种相反效应的共同作用。rLACC6、rLACC9和rLACC10的最适温度分别为60、40和40°C（图3），这与真菌漆酶在40–70°C范围内的最适温度以及其他胞外木质素分解酶一致。
纯化的rLACC6、rLACC9和rLACC10的热稳定性如图4所示。重组rLACC6在30°C下稳定，30°C孵育12小时后残留活性为88.5%。然而，热稳定性随温度升高而降低，40°C孵育12小时后残留活性降至46.6%。50°C孵育9小时后残留活性仅为1.6%，60°C孵育1小时后活性立即丧失。rLACC9和rLACC10表现出相似的热稳定性趋势，随温度升高而降低。30°C孵育12小时后，rLACC9和rLACC10的残留活性分别为14.60%和5.42%，而在60°C孵育1小时内活性几乎检测不到。
纯化的rLACC6、rLACC9和rLACC10的pH稳定性如图4所示。三种重组漆酶表现出不同的pH稳定性。孵育6小时后，rLACC10在pH 4–7下表现出明显高于rLACC6的残留活性，而rLACC6在pH 8–10下更为稳定。然而，在pH 2至10之间，漆酶的残留活性随pH升高而增加，rLACC6和rLACC9在pH 10孵育24小时后分别保留超过87%和90%的漆酶活性。
【数据】最适pH：2.5（rLACC6）、3.5（rLACC9）、4.0（rLACC10）；最适温度：60°C（rLACC6）、40°C（rLACC9）、40°C（rLACC10）；rLACC6热稳定性：30°C/12h残留88.5%，40°C/12h残留46.6%，50°C/9h残留1.6%，60°C/1h完全失活；rLACC9热稳定性：30°C/12h残留14.60%；rLACC10热稳定性：30°C/12h残留5.42%；pH稳定性：rLACC6和rLACC9在pH 10孵育24h后分别保留>87%和>90%活性
3.3 漆酶-介体系统对不同环境污染物的降解
工业和生活活动产生的芳香族污染物对环境构成日益严重的威胁。NPs、CPs和SAs是典型的芳香族污染物，已引起特别关注。漆酶-介体系统可显著提高漆酶的催化效率，丁香酸在我们之前的工作中被证明是有效的漆酶介体[38]。本研究考察了纯化的rLACC6、rLACC9和rLACC10在漆酶-丁香酸系统中降解NPs、CPs和SAs的能力。
#### 3.3.1 漆酶-丁香酸系统对NPs的降解
研究了重组漆酶在漆酶-丁香酸系统中降解NPs的能力。图5中的测试结果显示rLACC6、rLACC9和rLACC10实现了不同程度的降解。孵育60 min后，rLACC10对2-NP的降解能力最强，60 min降解后2-NP残留40.79%。其次是rLACC6（2-NP残留41.59%），最后是rLACC9（2-NP残留47.72%）。NPs的一级动力学参数如下…
【数据】2-NP降解（60 min）：rLACC10残留40.79%，rLACC6残留41.59%，rLACC9残留47.72%；3-NP、4-NP数据原文未完整呈现
#### 3.3.2 漆酶-丁香酸系统对CPs的降解
【数据】4-CP、2,4-DCP、2,6-DCP降解数据原文未完整呈现
#### 3.3.3 漆酶-丁香酸系统对SAs的降解
【数据】SDZ、SMZ、SMX降解数据原文未完整呈现
讨论与解读
三种漆酶同工酶（LACC6、LACC9和LACC10）在毕赤酵母中成功实现异源表达，对应的重组漆酶rLACC6、rLACC9和rLACC10在LMS中对NPs、CPs和SAs均表现出高效的去除能力，但效率存在差异。LC–MS/GC–MS分析揭示，3-硝基粘康酸和3-氯粘康酸分别是4-NP和2,4-DCP被LMS降解的关键中间产物，表明开环后可能发生了脱卤反应。此外，氧化偶联是SDZ在LMS中转化的可能途径。本研究结果为重组漆酶在环境生物技术领域的应用提供了有用信息。
编译者解读：该研究在合成生物学应用层面具有清晰的价值导向——将白腐真菌来源的漆酶基因家族转入毕赤酵母表达系统，解决了天然漆酶产量低、纯化难的瓶颈。三种同工酶在同一宿主中的平行表达与表征，为筛选性能最优的漆酶变体提供了直接对比数据。从应用角度看，rLACC6在表达量（3500 U/L）和热稳定性（30°C下12h残留88.5%）方面明显优于另外两种，更具工业化潜力。值得注意的是，该研究使用丁香酸作为天然介体替代合成介体ABTS，降低了毒性风险，更贴近实际环境修复场景。然而，降解实验均在缓冲液体系中进行，实际废水基质的复杂性（pH波动、共存离子、有机质等）对酶活的影响尚需进一步验证。未来若能在固定化酶技术和连续流反应器层面展开探索，将加速该技术的工程化落地。
参考来源
Zhuo R. Heterologous expression and characterization of three laccases obtained from Pleurotus ostreatus HAUCC 162 for removal of environmental pollutants. Journal of Hazardous Materials, 2018. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2017.10.055
DOI: 10.1016/j.jhazmat.2017.10.055