来源：A novel synergistic degradation of polyethylene microplastics by recombinant Pichia pastoris and purified laccase（Journal of Cleaner Production）| 编译：DNA Lab Space
导读
聚乙烯微塑料（PE-MPs）在农业土壤中持续累积，因其高疏水性和顽固的碳-碳骨架而难以自然降解。本研究从疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）基因组中挖掘出三个锰过氧化物酶基因（MvMnP3、MvMnP5、MvMnP13），在毕赤酵母中异源表达并优化诱导条件，获得酶活高达143.83 U/L的重组菌株GS115-MvMnP13。进一步将该工程菌与纯化漆酶联用，构建了新型多酶级联降解体系，30天内对PE-MPs的降解率达17.45%，较单一工程菌和单一漆酶分别提升2.47%和13.97%。多种表征手段证实了协同降解机制，为微塑料生物修复提供了新方案。
研究背景
微塑料（直径小于5 mm的合成聚合物颗粒）已成为水体和陆地生态系统中普遍存在的污染物。农业土壤因塑料地膜使用和有机肥施用而面临微塑料污染的严重威胁，可能通过影响作物产量和食物链传递风险危及全球粮食安全。聚乙烯（PE）作为地膜的主要成分，在集约化农业土壤中占累积农业微塑料总量的64%。PE因其高分子量和疏水特性表现出极强的环境持久性，且对有机污染物、重金属和病原微生物具有强亲和力，可作为这些共污染物的载体。微生物降解作为一种环境友好且可持续的微塑料修复策略受到广泛关注。本研究旨在通过理性生物工程策略，开发高效降解PE-MPs的微生物酶系统。
研究方法
2.1 材料与化学试剂
本研究所用PE-MPs颗粒呈白色无定形形态，密度范围为0.940–0.976 g/cm³（25°C），平均分子量约120,000 Da，购自无锡瑞格尔生物技术有限公司（中国）。M. verrucaria获自中国教育部秸秆综合利用与黑土保护重点实验室。P. pastoris GS115、pPICZαB和SacI购自Invitrogen公司。DH5α细胞、pMD19T、EcoRI和KpnI、2 × ExTaq及凝胶回收试剂盒购自Takara Bio Group。2 × Super Pfx Master mix购自江苏康为世纪生物科技有限公司。ClonExpress® II一步克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。SurePAGE™ Gel 12%购自金斯瑞生物科技公司。快速酵母基因组DNA分离试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。其他分析纯试剂购自北京化学试剂有限公司。本实验所用引物列于表1。发酵培养基含2.4 g/L葡萄糖、5 g/L酵母提取物、1.5 g/L KH₂PO₄、1.5 g/L MgSO₄、0.1 g/L CaCl₂、1 g/L吐温80，并加入200 g土豆浸出液。
【数据】PE-MPs密度：0.940–0.976 g/cm³（25°C）；平均分子量：约120,000 Da；葡萄糖：2.4 g/L；酵母提取物：5 g/L；KH₂PO₄：1.5 g/L；MgSO₄：1.5 g/L；CaCl₂：0.1 g/L；吐温80：1 g/L
2.2 *M. verrucaria*中MnPs的生物信息学分析及MPs降解相关基因筛选
根据两个保守结构域（PF00141、PF11893）从Pfam数据库下载MnPs家族的隐马尔可夫模型（HMM），并从M. verrucaria基因组数据库中鉴定出MnPs家族全部成员。利用在线生物信息学网站预测所获基因的理化性质及其他特性，网站链接见表S1。采用RT-qPCR研究MnPs对PE-MPs的响应。将M. verrucaria在含0.2 g PE-MPs的发酵培养基中培养。通过反转录试剂盒去除总RNA中的混合基因组DNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，使用荧光定量试剂盒对MnPs表达进行实时荧光定量检测，反应体系见表2。反应结束后，采用2^−ΔΔCt法计算不同靶基因的相对表达量。以18s rRNA作为基因表达水平的内参。
【数据】PE-MPs添加量：0.2 g；内参基因：18s rRNA；计算方法：2^−ΔΔCt法
2.3 *MvMnP3*、*MvMnP5*和*MvMnP13*的克隆与异源表达
使用引物（表S2）和2 × ExTaq通过聚合酶链式反应（PCR）扩增MvMnP3、MvMnP5和MvMnP13，与pMD19T载体连接后转化至DH5α细胞。使用M13F/M13R引物通过PCR鉴定阳性转化子。重组质粒pMD19T-MvMnP3、MvMnP5、MvMnP13与pPICZαB载体分别用EcoRI和KpnI双酶切并胶回收。纯化的胶回收产物与pPICZαB连接，然后转化至DH5α细胞。使用引物通过PCR鉴定阳性转化子。从阳性转化子中提取重组质粒pPICZαB-MvMnP3、MvMnP5、MvMnP13并测序。用SacI线性化pPICZαB-MvMnP3、MvMnP5、MvMnP13 DNA，使用电穿孔仪在200 Ω和1500 V条件下转化至P. pastoris GS115感受态细胞。使用快速酵母基因组DNA分离试剂盒提取基因组DNA，并用引物通过PCR鉴定阳性转化子。培养含pPICZαB-MvMnP3、MvMnP5、MvMnP13的P. pastoris GS115，用甲醇诱导重组蛋白表达，并优化MnPs表达的诱导条件，包括甲醇添加量、初始接种量、pH和温度。
【数据】电转化条件：200 Ω，1500 V；限制性内切酶：EcoRI、KpnI、SacI
2.4 酶的生产、分离、纯化及动力学参数
将M. verrucaria在发酵培养基中培养至对数生长期。通过4°C、8500 rpm离心5 min从M. verrucaria发酵液中获得初始粗漆酶提取物。通过离心从P. pastoris GS115-MvMnP13发酵液中获得初始粗MnP提取物。取100 mL粗酶液，分批次用10–90%（w/v）(NH₄)₂SO₄沉淀4 h。离心重溶后，用透析膜透析12 h除盐，每4 h更换缓冲液。随后通过50 kDa超滤浓缩脱盐，4°C保存。使用SurePAGE™ Gel 12%通过SDS-PAGE表征漆酶纯度，光谱性质按照已建立的方法测定。漆酶的比活力和动力学参数（K_m、V_max）以ABTS为底物在420 nm（ε = 36,000 M⁻¹cm⁻¹）下计算；MnP的比活力和动力学参数（K_m）以酒石酸钠-MnSO₄为底物在238 nm（ε = 6500 M⁻¹cm⁻¹）下计算。
【数据】离心：8500 rpm，5 min，4°C；(NH₄)₂SO₄沉淀：10–90%（w/v），4 h；透析：12 h，每4 h换液；超滤膜：50 kDa；ABTS检测波长：420 nm（ε = 36,000 M⁻¹cm⁻¹）；MnP底物检测波长：238 nm（ε = 6500 M⁻¹cm⁻¹）
2.5 重组毕赤酵母与纯化漆酶对PE-MPs的协同降解
PE-MPs降解实验按照已建立的方法进行。在100 mL锥形瓶中加入30 mL无菌发酵培养基建立分批培养体系，无菌条件下培养30天。共设11个实验组，分别为LM组（漆酶+PE-MPs）、BM-3组（GS115-MvMnP3发酵液+PE-MPs）、BLM-3组（GS115-MvMnP3发酵液+漆酶+PE-MPs）、BM-5组（GS115-MvMnP5发酵液+PE-MPs）、BLM-5组（GS115-MvMnP5发酵液+漆酶+PE-MPs）、BM-13组（GS115-MvMnP13发酵液+PE-MPs）、BLM-13组（GS115-MvMnP13发酵液+漆酶+PE-MPs）、灭活组（以灭活的GS115-MvMnP13发酵液和/或灭活漆酶为代表），以及仅含培养基和PE-MPs的对照组。降解体系中PE-MPs添加量为2 g，真菌发酵液为3.0 mL，漆酶为7300 U/L。未处理的PE-MPs设为CK组。所有体系在接种发酵液和漆酶前于115°C蒸汽灭菌30 min。随后将锥形瓶置于培养箱中，160 rpm、30°C条件下培养。在指定时间点，无菌采集三份平行体系进行相分离。将每个样品倒入90 mm直径的纤维素平头滤纸（Prat Dumas，法国，2–3 μm孔径，A009210）中，预先折叠成锥形并置于连接锥形瓶的玻璃漏斗（10 mm直径）中，依靠重力过滤。收集可能附着在生物质上的PE-MPs，用蒸馏水冲洗、冷冻干燥并保存至进一步分析。
【数据】培养体系：30 mL；降解周期：30天；PE-MPs添加量：2 g；发酵液：3.0 mL；漆酶：7300 U/L；灭菌：115°C，30 min；培养条件：160 rpm，30°C；滤纸孔径：2–3 μm
2.6 PE-MPs降解率的测定
PE-MPs的生物降解率以失重百分比（%）评估。质量损失百分比按以下基本公式计算：失重率 = (W₀ − W)/W₀ × 100%，其中W₀为PE-MPs的初始重量（g），W为PE-MPs的残余重量（g）。
【数据】计算公式：失重率 = (W₀ − W)/W₀ × 100%
2.7 降解监测
#### 2.7.1 PE-MPs的表观结构和孔隙率
使用扫描电子显微镜（SEM）（ZEISS Sigma 300，德国）观察PE-MPs在不同条件下培养30天后的表面形态变化。
【数据】SEM型号：ZEISS Sigma 300；观察时间点：30天
研究结果
3.1 MnPs的生物信息学分析及其在PE-MPs降解中的响应
根据Pfam登录号从M. verrucaria基因组数据库中鉴定出16个MnP基因，命名为MvMnP1-16（文件1）。利用生物信息学方法预测并分析了其编码蛋白的理化性质、外显子-内含子结构和保守基序。结果见表S3、图S1和图S2。MvMnP1-16具有不同的结构，位于系统发育树的不同分支，表明它们具有不同的进化起源和遗传背景。使用RT-qPCR定量了MnP1-16响应PE-MPs暴露的转录水平，结果如图1所示。
MvMnP3、MvMnP5和MvMnP13对PE-MPs表现出正向响应，与对照相比分别增加了2.03、1.31和2.18倍，表明这些基因对PE-MPs的降解过程表现出强烈的响应。先前的生物信息学分析显示，MvMnP3、MvMnP5和MvMnP13具有不同的遗传结构并聚集在不同的进化分支，表明PE-MPs的降解源于同一基因家族中结构多样成员的协同作用。基于这些发现，在P. pastoris GS115中对MvMnP3、MvMnP5和MvMnP13进行了分子克隆和异源表达，以验证这些基因编码的蛋白质类型，并评估其产生活性酶的能力。同时，有望获得能够分泌MnP的重组毕赤酵母工程菌株。
【数据】MvMnP3表达上调：2.03倍；MvMnP5表达上调：1.31倍；MvMnP13表达上调：2.18倍
3.2 *MvMnP3*、*MvMnP5*和*MvMnP13*的克隆与异源表达
#### 3.2.1 MvMnP3、MvMnP5和MvMnP13的克隆
从实验样品中分离总RNA并反转录为互补DNA（cDNA）。根据已知序列为MvMnP3、MvMnP5和MvMnP13设计特异性正向和反向引物。以合成的cDNA为模板，在优化的反应条件下进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳分析显示，出现了与靶片段预测大小相对应的清晰扩增产物（图2A）。
观察到的清晰且轮廓分明的条带证明了三个片段的成功扩增，证实了引物设计和PCR优化参数的有效性。将MvMnP3、MvMnP5和MvMnP13片段分别连接到pMD-19T载体后，产物转化至Escherichia coli DH5α，并使用载体特异性M13F（−47）/M13R（−48）引物通过菌落PCR验证，确认了插入片段的存在（图2B）。随后使用靶向成熟肽编码序列（CDS）的基因特异性引物进行质粒PCR扩增，显示了完整的开放阅读框（图2C）。用限制性内切酶EcoRI、KpnI和EcoRV酶切质粒，所有阳性转化子均出现预期的两条带，证实了MvMnP3、MvMnP5和MvMnP13-pPICZαB表达载体的成功构建（图2D）。所有产物的长度与预测一致，表明MvMnP3、MvMnP5和MvMnP13已成功整合到DH5α细胞基因组中。
【数据】靶片段大小：MvMnP3为897 bp，MvMnP5为1000 bp，MvMnP13为832 bp；限制性内切酶：EcoRI、KpnI、EcoRV
#### 3.2.2 携带MvMnP3、MvMnP5和MvMnP13的P. pastoris阳性转化子的构建
为功能表征MnP同工酶，采用成熟的P. pastoris GS115表达系统对靶基因进行异源表达。将MvMnP3/5/13的编码序列定向克隆到pPICZαB的α-因子分泌信号下游。通过质粒PCR验证阳性转化子，在预期大小处观察到清晰条带，初步确认为阳性转化子（图3A）。
双酶切释放出与理论大小一致的插入片段（图3B），证明MvMnP3、MvMnP5、MvMnP13-pPICZαB表达载体构建成功。随后用SacⅠ线性化重组pPICZαB-MvMnP质粒，并使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒纯化。通过电穿孔将回收产物成功转入P. pastoris GS115感受态细胞，基因组PCR验证结果如图3C所示。其中，泳道1、2和3中出现了与靶片段大小一致的单一条带，清晰一致，证明GS115-MvMnP3、GS115-MvMnP5和GS115-MvMnP13构建成功。
【数据】线性化酶：SacⅠ；转化方法：电穿孔
3.3 GS115-MvMnP3、GS115-MvMnP5和GS115-MvMnP13的诱导表达
测定了设计用于表达MnPs的GS115-MvMnP3、GS115-MvMnP5和GS115-MvMnP13的时间活性曲线，结果如图4A所示。诱导60 h后，这些真菌的MnP活性分别达到峰值62.66 U/L、43.35 U/L和47.26 U/L。这一结果证明这三个基因编码MnP。
随后通过调整关键参数优化GS115-MvMnP3、GS115-MvMnP5和GS115-MvMnP13的诱导条件，包括甲醇添加量、培养基初始pH、初始接种量和诱导温度。这三个基因的优化趋势一致，如图4B–E所示。具体而言，当甲醇添加量为250 μL、初始pH为4.5、初始接种量为3.5、诱导温度为30°C时，酶活性达到最大值。在这些优化条件下，GS115-MvMnP13表现出最高的酶活性，达143.83 U/L。相比之下，已有研究报道了使用不同表达系统获得的MnP活性水平各异。Liu等（2020）使用P. pastoris系统表达了来自Aspergillus sp.的MnP，活性达133.12 U/L。Chen等（2023）在食品级酵母Schizosaccharomyces pombe中异源表达了来自Irpex lacteus的MnP，重组酵母分泌的胞外MnP活性水平为17.46 U/L。这表明GS115-MvMnP3、GS115-MvMnP5和GS115-MvMnP13的优化条件能有效提高酶产量，同时也凸显了MnPs的应用潜力。
【数据】峰值酶活（60 h）：MvMnP3为62.66 U/L，MvMnP5为43.35 U/L，MvMnP13为47.26 U/L；最优甲醇添加量：250 μL；最优初始pH：4.5；最优初始接种量：3.5；最优诱导温度：30°C；优化后最高酶活：143.83 U/L（GS115-MvMnP13）
3.4 酶的生产、分离、纯化及动力学参数
从M. verrucaria发酵液中提取纯化的漆酶，使用SDS-PAGE分析纯度，结果如图S3（A）所示。纯化组分的SDS-PAGE分析中观察到的蛋白条带证明了漆酶的存在和纯度，分子量约为65 kDa，接近Pycnoporus sanguineus真菌漆酶的66–68 kDa。纯化漆酶的200–800 nm UV-vis光谱如图S3（B）所示。该酶在600 nm处表现出特征吸收峰，这是漆酶的典型特征，归因于T1铜中心。在约330 nm波长处观察到羟基肩峰，对应于与T3铜对的桥接。该光谱特征与Palmieri等（1997）报道的Pleurotus ostreatus POXA2漆酶相似，表明所分离的酶为纯化漆酶。比活力是酶的关键参数，而K_m和V_max代表酶-底物反应系统中酶的固有特性。测定了GS115-MvMnP13产生的MnP和漆酶的这些参数，结果如表3所示。MnP和漆酶的比活力分别为1.42 U/mg和44.75 U/mg。MnP和漆酶的V_max分别为6.27和95.70 μmol min⁻¹ mg⁻¹，MnP对酒石酸钠-MnSO₄底物的K_m值原文未详述。
【数据】漆酶分子量：约65 kDa；MnP比活力：1.42 U/mg；漆酶比活力：44.75 U/mg；MnP V_max：6.27 μmol min⁻¹ mg⁻¹；漆酶 V_max：95.70 μmol min⁻¹ mg⁻¹；漆酶特征吸收峰：600 nm（T1铜中心），330 nm（T3铜对桥接）
3.5 重组毕赤酵母与纯化漆酶对PE-MPs的协同降解
图5显示了工程真菌GS115-MvMnP3、GS115-MvMnP5和GS115-MvMnP13以及漆酶单独或联合处理30天后PE-MPs的降解率。
（原文此段后续具体数值在节选中未完整呈现，但摘要中明确：BLM-13组30天降解率达17.45%，较单独工程菌和单独漆酶分别提升2.47%和13.97%。）
【数据】BLM-13组30天降解率：17.45%；较工程菌提升：2.47%；较漆酶提升：13.97%
3.6 PE-MPs降解后的表征分析
#### 3.6.1 表观结构和孔隙率变化
使用SEM观察了PE-MPs在不同处理条件下的表面形态变化。图6显示了未经处理的PE-MPs（A1-2）、LM组（B1-2）、BM-13组（C1-2）和BLM-13组（D1-D2）的表面形貌。
未经处理的PE-MPs表面相对光滑平整。LM组表面出现一定程度的粗糙化。BM-13组表面可见明显的侵蚀痕迹和孔洞。BLM-13组表面表现出最显著的破坏，孔隙率明显增加，表面结构严重受损，表明工程菌与漆酶的协同作用对PE-MPs的表观结构产生了更强的破坏效果。
【数据】SEM观察：孔隙率增加（BLM-13组最显著）；原文未给出具体孔隙率数值
#### 3.6.2 FTIR和XRD分析
图7显示了不同降解条件下PE-MPs的FTIR（A）和XRD（B）谱图。
FTIR分析证实了PE-MPs长链的有效解聚。XRD分析显示，协同处理组（BLM-13）的结晶度降低了16.33%，表明工程菌与漆酶的协同作用破坏了PE-MPs的晶体结构，使其结晶度显著下降。
【数据】结晶度降低：16.33%
#### 3.6.3 热重分析
图8显示了不同组合条件下PE-MPs生物降解前后的热重分析结果。
TGA（A）和DTG（B）曲线显示，与CK组（未处理PE-MPs）相比，LM组、BM-13组和BLM-13组的热稳定性均出现显著下降。其中BLM-13组的热稳定性下降最为明显，表明协同处理对PE-MPs的分子链结构造成了更严重的破坏，使其更易受热分解。
【数据】热稳定性：BLM-13组下降最显著；原文未给出具体分解温度数值
#### 3.6.4 接触角分析
图9显示了不同组合条件下PE-MPs生物降解前后的接触角分析结果。
接触角数据显示，未处理的PE-MPs（CK组）表现出较高的接触角，表明其表面疏水性较强。经过处理后，特别是BLM-13组，接触角显著降低，表明PE-MPs表面的亲水性增强。这一变化与表面氧化和极性基团的引入有关，进一步证实了协同降解对PE-MPs表面化学性质的改变。
【数据】接触角：BLM-13组显著降低（具体数值原文未详述）
#### 3.6.5 平均分子量变化
GPC分析结果显示，协同处理组PE-MPs的平均分子量下降了54.87%，证实了PE-MPs长链的有效断裂和降解。
【数据】平均分子量下降：54.87%
3.7 协同降解机理
基于上述实验结果，提出了工程真菌与漆酶协同降解PE-MPs的假设性降解途径，如图10所示。
该机制结合了酯键的水解裂解和烃骨架的氧化断裂双重酶促作用。工程真菌分泌的MnP和漆酶协同作用，首先攻击PE-MPs表面的化学键，引发链断裂，随后进一步将长链PE-MPs分解为小分子片段。FTIR和GC-MS结果证实了PE-MPs长链的有效解聚，并支持了所提出的协同降解机制。
【数据】GC-MS证实：长链解聚；机制类型：酯键水解裂解+烃骨架氧化断裂
讨论与解读
本研究成功鉴定并表达了三个与PE-MPs降解相关的新基因MvMnP3、MvMnP5和MvMnP13，并通过将重组菌株GS115-MvMnP13与漆酶系统功能整合，揭示了独特的多酶协同效应。该组合在30天修复周期内实现了PE-MPs质量减少17.4%。SEM、FTIR、TGA、接触角、GPC和GC-MS分析证明，重组GS115-MvMnP13与漆酶协同作用，裂解PE-MPs主链，改变其化学组成和表面形态，促进碎片化为小分子，并增强亲水性。研究观察到酯键水解裂解与烃骨架氧化断裂相结合的双重酶促机制。该工作开创了用于合成聚合物生物修复的真菌-酶级联平台，为低能耗、环境友好的微塑料减排技术建立了原型。未来研究应聚焦于开发可规模化的生物降解技术，如酵母表面展示技术可提高酶对底物的可及性，促进更有效的酶促作用。
编译者解读：本研究的关键价值在于将理性筛选（系统发育+结构生物信息学）与多酶级联策略相结合，突破了单一酶降解效率低的瓶颈。GS115-MvMnP13与漆酶的协同使降解率提升至17.45%，虽绝对值仍有限，但30天周期内的分子量下降54.87%表明链断裂效率可观。从合成生物学应用看，该策略的启示在于：微生物分泌的多种氧化还原酶在自然界中本就协同工作，人工重构这一组合是提升塑料降解效率的可行路径。局限在于降解周期仍较长、酶生产成本较高，未来若能将表面展示技术与发酵工艺优化结合，有望进一步推动实际环境修复应用。
参考来源
Zheng Y. A novel synergistic degradation of polyethylene microplastics by recombinant Pichia pastoris and purified laccase. Journal of Cleaner Production, 2025. DOI: 10.1016/j.jclepro.2025.147073
DOI: 10.1016/j.jclepro.2025.147073