来源：Heterologous expression of Trametes versicolor laccase in Saccharomyces cerevisiae（Protein Expression and Purification）| 编译：DNA Lab Space
导读
漆酶作为一种多铜氧化酶，在环境修复、纺织印染及生物燃料电池等领域具有广阔应用前景。变色栓菌（Trametes versicolor）漆酶因具有较高的氧化还原电位而备受关注，但其异源表达水平长期受限。本研究以酿酒酵母为宿主，通过系统优化培养条件——包括半乳糖浓度、铜离子浓度、细胞密度及通气条件——实现了漆酶的功能性分泌表达，产量达45 U/L。研究进一步揭示了重组漆酶高度超甘露糖型糖基化的结构特征，并系统评估了糖基化对酶学性质的影响，为漆酶的分子进化研究提供了高效表达平台。
研究背景
漆酶（苯二醇：氧气氧化还原酶，EC 1.10.3.2）是多铜氧化酶家族的重要成员，也是变色栓菌木质素降解系统的关键胞外组分。漆酶不仅能降解木质素，还能分解多种持久性有机污染物，如氯酚类化合物和纺织染料，其在环境净化领域的应用潜力已获广泛认可。变色栓菌可产生多种漆酶同工酶，其中漆酶III分泌量最高。前期研究已通过自克隆技术实现了漆酶III基因的过表达，并将其应用于植物修复和降低水稻木质素含量。目前漆酶已在纺织和食品工业中投入实际应用，并可作为酶生物燃料电池的生物阴极材料。分子进化工程的发展为漆酶功能改造提供了有力工具，而高效的异源表达系统是实现进化策略的关键前提。此前已在多种微生物中尝试漆酶的异源表达，包括酿酒酵母、毕赤酵母和黑曲霉等。
研究方法
菌株与试剂
Escherichia coli JM109（Takara Bio）作为DNA操作宿主细胞。酿酒酵母BY2777（MATa, prb1-1122, prc1-407, pep4-3, ura3-52, leu2, trp1）作为异源表达宿主。DNA和蛋白质操作所用酶类购自New England Biolabs、Takara Bio、Promega及Nippon Gene（除非另有说明）。细胞培养基成分购自Sigma-Aldrich、Wako和Difco。
质粒构建
从变色栓菌（IFO1030）克隆的漆酶III cDNA（cvl3；GenBank登录号D13372）用于构建pTFL3。以pTFL3为模板，使用正向引物（5′-tattaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatgtcgaggtttcactctcttctc-3′）和反向引物（5′-agaattcgagctcttactggtcgctcgggtcgagcgcatc-3′）PCR扩增漆酶III cDNA与信号肽（N端21个氨基酸）的融合片段。扩增产物经HindIII和EcoRI双酶切后，克隆至pYES2（Thermo Fisher Scientific K.K.）的相应酶切位点，获得表达质粒pTA946（图1）。漆酶III cDNA及其天然信号序列受GAL1启动子和CYC1终止子调控。
酵母转化与培养条件
采用醋酸锂法进行转化，在含2%葡萄糖的SC培养基（0.67%酵母氮碱（不含氨基酸）、0.197%尿嘧啶缺失混合物）上筛选尿嘧啶营养缺陷型互补的转化子。经clv3 cDNA特异性引物PCR确认的转化子，在含2%棉子糖的SC培养基中、30°C条件下培养至OD₆₆₀达1.8。随后离心收集细胞，加入含半乳糖和CuSO₄·5H₂O的SC培养基诱导漆酶表达，于20°C继续培养。使用300 mL挡板摇瓶，50 mL培养体积，转速160 rpm。考察不同接种密度对漆酶活性的影响，同时研究培养基中半乳糖和铜离子浓度对漆酶表达的作用。
漆酶活性测定
定时收集培养液并离心，取上清液测定漆酶活性。反应体系含0.5 mM ABTS（2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）和10 mM醋酸钠缓冲液（pH 3.1），于25°C条件下用分光光度计（V-550DS；Jasco）监测420 nm处吸光度变化（ε₄₂₀ₙₘ：36,000 M⁻¹ cm⁻¹）。酶活性按线性初始速率计算，以单位每毫升表示，1个单位定义为每分钟氧化1 μmol底物。吸光度随时间变化在线性范围内进行测量。
天然与重组漆酶的纯化
重组细胞培养液经0.45 μm滤膜过滤后，用超滤法（截留分子量50 kDa）浓缩。浓缩液上样至Sephadex-G75柱（1.5 × 8 cm），以10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）为洗脱液。收集具有ABTS氧化活性的组分，经超滤（截留分子量10 kDa）浓缩。随后上样至TOYOPEARL DEAE-650M柱（1.5 × 8 cm，TOSOH），以10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中0–200 mM NaCl线性梯度洗脱。合并含漆酶活性的组分，浓缩并同时置换为10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。蛋白浓度采用micro BCA蛋白测定法，以标准BSA溶液制备校准曲线。
变色栓菌IFO1030在液体培养基（3%葡萄糖、1%蛋白胨、0.15% KH₂PO₄、0.05% MgSO₄·7H₂O、2 mg/L盐酸硫胺素、16 mg/L CuSO₄·5H₂O）中、28°C、轨道摇瓶培养1周进行预培养。将预培养物转移至4倍体积的相同培养基中，于28°C轨道摇瓶培养20天。采用上述相同方法从变色栓菌培养滤液中纯化漆酶III（天然漆酶：nLac）。
重组漆酶的表征
使用Endo H、PNGase F和O-糖苷酶对纯化的天然和重组漆酶进行去糖基化处理，操作步骤按制造商说明书执行。去糖基化在变性条件和非变性条件下、37°C、24小时进行。变性漆酶（1 μg）经去糖基化后用于SDS-PAGE分析糖链结构，凝胶用考马斯亮蓝（CBB）染色。非变性漆酶（24 ng）经Endo H去糖基化后，通过native-PAGE进行酶谱分析。活性染色时，native-PAGE凝胶用10 mM醋酸钠缓冲液（pH 3.1）洗涤，置于浸有含0.5 mM ABTS的相同缓冲液的滤纸上。使用Multi Protein Ladder（10–315 kDa，Nippon Gene）作为蛋白标记物。凝胶浓度为13%，其余条件参照Laemmli方法。
漆酶氧化2,6-二甲氧基苯酚（2,6-DMP，0.5 mM）和愈创木酚（0.5 mM）的能力采用上述相同程序测定，分别监测470 nm（ε₄₇₀ₙₘ：35,645 M⁻¹ cm⁻¹）和436 nm（ε₄₃₆ₙₘ：6400 M⁻¹ cm⁻¹）处的吸光度变化。天然漆酶（nLac）和重组漆酶（rLac）的pH依赖性在Britton–Robinson广谱缓冲液中、多个pH条件下测定。以2,6-DMP为底物，通过Lineweaver–Burk作图确定Kₘ和Vₘₐₓ。热稳定性测定中，nLac或rLac置于磷酸盐缓冲液（10 mM，pH 7）中，于30°C–80°C孵育20分钟后冰浴冷却，在25°C、10 mM醋酸钠缓冲液（pH 3.1）中测定ABTS活性。
【数据】宿主菌：酿酒酵母BY2777；克隆宿主：E. coli JM109；培养基：SC培养基（0.67% YNB、0.197% ura dropout混合物）；碳源：2%葡萄糖/2%棉子糖/半乳糖（2%–4%）；诱导剂：CuSO₄·5H₂O（0.5 mM）；温度：30°C（培养）、20°C（诱导）、28°C（天然菌培养）；时间：6天（诱导）、1周（预培养）、20天（天然菌培养）；转速：160 rpm；缓冲液：10 mM醋酸钠（pH 3.1）/10 mM磷酸盐（pH 7.0）；检测波长：420 nm（ABTS）、470 nm（2,6-DMP）、436 nm（愈创木酚）；去糖基化条件：37°C、24 h
研究结果
酿酒酵母中*cvl3*的表达
本研究阐明了在酿酒酵母中高效表达变色栓菌漆酶的基本要求，并鉴定出多个影响表达的关键因素。初步实验发现，30°C的培养温度对漆酶表达而言过高。参照Cassland和Jönsson的报告，将培养物在20°C下孵育6天，但仅导入pYES2的转化子培养液中检测不到漆酶活性（数据未显示）。如图2所示，当半乳糖浓度从2%增至4%时，漆酶活性相应提高。作为诱导底物的半乳糖浓度增加后，漆酶表达量很高，存在漆酶可能在细胞内积累的担忧；然而，如Kurose等人所述，表达水平显著提升。较高浓度的铜离子导致漆酶活性增加，CuSO₄·5H₂O的最适浓度为0.5 mM。由于漆酶是铜蛋白，随着蛋白产量增加，似乎有必要增加铜离子的供给。最适细胞密度为2 OD₆₆₀。使用挡板摇瓶培养时，分泌表达的漆酶最高可达45 U/L。当诱导时培养细胞密度设为20 OD₆₆₀时，表达时间提前，但漆酶最终表达水平与2–5 OD₆₆₀相同（数据未显示）。具体而言，与香菇胞内漆酶不同，生产变色栓菌漆酶不需要高细胞密度培养。当使用能够充分增加通气量的培养装置（MAXIMIZER，Taitec）时，表达水平最高可达约80 U/L；因此，通气也是影响表达的重要因素。通过六代重复分子进化，P. cinnabarinus高氧化还原电位漆酶在酿酒酵母中的表达水平提高了8000倍，但ABTS氧化活性为300 U/L。在我们的表达系统中，变色栓菌漆酶的表达水平有望通过分子进化进一步提高。
【数据】半乳糖浓度：2%–4%；铜离子浓度：0.5 mM（CuSO₄·5H₂O）；最适细胞密度：2 OD₆₆₀；产量：45 U/L（挡板摇瓶）、80 U/L（MAXIMIZER装置）；对照表达水平：300 U/L（P. cinnabarinus漆酶，分子进化六代后）；培养温度：20°C；培养时间：6天
重组漆酶的表征
通过层析法从重组细胞培养滤液中纯化重组漆酶。以ABTS为底物时，漆酶的比活性为170 U/mg，纯化倍数为5.4倍。纯化漆酶的得率为210 mg/L。纯化的漆酶经native-PAGE分离（图3），凝胶以ABTS进行活性染色。酶谱分析显示，重组漆酶（rLac；图3，泳道2）明显大于天然漆酶（nLac；图3，泳道1）。当漆酶经Endo H处理后，rLac条带迁移至较低分子量位置并汇聚（图3，泳道4）。经酶谱分析和SDS-PAGE确定，nLac的分子量约为66 kDa，而rLac的分子量在70至120 kDa之间变化。由于rLac在酿酒酵母中表达，其由非常复杂的超甘露糖型糖型混合物组成。另一方面，nLac条带迁移至较低分子量位置并分离为三条带。在先前的研究中，已揭示nLac至少含有四条N-连接糖链，其中两条为高甘露糖型或杂合型，两条为复杂型结构。nLac去糖基化后分子量降至54 kDa（图4，泳道3），而rLac经同样处理后出现相同大小的蛋白条带，表明rLac上添加了约60 kDa的糖链。SDS-PAGE后虽出现额外条带（图4，泳道4），但这些条带是未完全去糖基化的产物。我们多次尝试不同酶量和反应时间，但始终无法完全切割。酶谱分析显示，少量糖基化漆酶可被Endo H切割，但CBB染色未检测到清晰条带。此外，1 μg糖基化漆酶也未被Endo H完全切割（数据未显示）。PNGase F可切割大多数类型的N-连接糖链，但当N-糖链靠近蛋白的N端或C端时其活性降低。根据天然漆酶的氨基酸序列，N端和C端附近均存在N-糖基化位点；因此，PNGase F的活性因N-糖链的添加而降低。此外，O-糖苷酶未使nLac或rLac的分子量降低（图4，泳道5和6）。
以2,6-DMP为底物测定rLac的动力学参数，并与nLac的相应值进行比较。两者的Vₘₐₓ值相近，但rLac的Kₘ值（32.7 ± 2 μM）高于nLac（23.8 ± 1 μM）。这一结果表明超糖基化降低了底物亲和力。为确定最适pH，在多个pH范围内以ABTS、2,6-DMP和愈创木酚为底物进行测定，两种酶呈现相同的趋势（图5）。虽然预期热稳定性会随糖链含量增加而提高，但rLac热处理后的残留活性与nLac相似（图6）。
综上所述，我们优化了变色栓菌漆酶在酿酒酵母中的表达。由于表达的漆酶高度糖基化，其底物亲和力较低。其他性质，包括热稳定性和最适pH，与天然漆酶无差异。本文描述的功能性表达系统将有助于通过分子进化研究创制漆酶新变体。
【数据】比活性：170 U/mg（ABTS底物）；纯化倍数：5.4倍；得率：210 mg/L；nLac分子量：约66 kDa；rLac分子量范围：70–120 kDa；去糖基化后分子量：54 kDa；糖链分子量：约60 kDa；Kₘ（rLac）：32.7 ± 2 μM；Kₘ（nLac）：23.8 ± 1 μM；底物：2,6-DMP（0.5 mM）、愈创木酚（0.5 mM）；热稳定性测定范围：30°C–80°C、20 min
讨论与解读
本研究系统优化了变色栓菌漆酶在酿酒酵母中的异源表达条件，明确了半乳糖浓度、铜离子浓度、细胞密度和通气量对表达水平的关键影响。优化后的表达系统可实现45 U/L（常规摇瓶）至80 U/L（强化通气）的漆酶分泌表达。重组漆酶呈现高度超甘露糖型糖基化特征，糖链分子量约60 kDa，导致底物亲和力降低（Kₘ从23.8 μM升至32.7 μM），但最适pH和热稳定性未受明显影响。
编译者解读
该研究的技术路线具有典型的合成生物学思维——通过系统优化宿主培养条件而非基因工程改造来提升异源蛋白产量，策略务实且可操作性强。值得注意的是，研究者将高糖基化视为降低底物亲和力的因素，却未尝试通过敲除酵母高甘露糖型糖基化相关基因（如OCH1）来改善蛋白质量，这一潜在优化方向值得后续探索。从应用角度而言，该表达系统结合分子进化策略，为提升漆酶氧化还原电位和工业适用性提供了实用平台。然而，45–80 U/L的产量距离工业化应用仍有差距，如何平衡糖基化程度与酶学性能，是后续工程化改造的核心问题。
参考来源
Iimura Y. Heterologous expression of Trametes versicolor laccase in Saccharomyces cerevisiae. Protein Expression and Purification, 2018. DOI: 10.1016/j.pep.2017.09.004
DOI: 10.1016/j.pep.2017.09.004