来源：A highly stable one-domain laccase from Geobacillus stearothermophilus RM for industrial applications: Halotolerance, alkali-stability, and dye decolorization（Biocatalysis and Agricultural Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space
导读
工业极端条件下的生物催化需求推动了嗜热酶研究。本研究从马来西亚热泉分离的 Geobacillus stearothermophilus RM 中克隆了一个新型细菌漆酶基因 lacsagzm，并在 E. coli BL21(DE3) 中实现了异源表达。该酶 LacSAGZM 分子量仅 34.45 kDa，属于新兴的小分子单结构域漆酶。酶学表征显示其最适 pH 8.0、最适温度 55°C，在 1 M NaCl 条件下酶活提升超过 5 倍，兼具嗜盐、耐碱和热稳定性。对多种合成染料（包括三苯甲烷类、蒽醌类和偶氮类）表现出高效脱色能力，其中对萘酚蓝黑（NBB）的脱色率高达 96.2%。该酶为工业染料废水生物处理提供了有前景的候选元件。
研究背景
快速城市化和工业化使环境污染成为严峻问题，每年约一百万吨各类合成染料被生产，其高度稳定的化学结构使其难以被热、光或水降解。现有化学和物理降解法虽有效，但会产生有毒中间产物，且成本高、产生污泥。传统生物处理方法对含 5–10% 原始染料的纺织废水脱色效果常不理想。漆酶（EC 1.10.3.2）属于多铜氧化酶家族，仅以氧分子为电子受体催化底物氧化，是合成染料脱色的候选酶之一。来自嗜热菌的漆酶因其在高温、高盐、宽 pH 范围内的稳定性而备受关注。
研究方法
2.1 化学品与细菌培养
革兰氏阳性嗜热菌 Geobacillus stearothermophilus RM 此前采集自马来西亚兰卡威岛 Telaga Air Hangat 热泉，其 16S rRNA 序列已提交至 NCBI GenBank（登录号 GU045559）。保存于 −80°C 的菌株用于基因扩增，在 55°C、营养肉汤（pH 6.5）中培养。研究使用 pET-51b(+) 载体和 E. coli BL21(DE3) 表达宿主。重组细菌在含氨苄青霉素（0.1 mg mL⁻¹）的 Luria-Bertani 肉汤（LBB，pH 7.0）中、37°C 条件下培养。分子克隆所用化学品和试剂购自 New England Biolabs（NEB，英国）和 Thermo Fisher Scientific（美国）。漆酶合成染料和底物——2,6-二甲氧基苯酚（2,6-DMP）和 2,2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）——购自 Sigma-Aldrich（Merck，美国）。其余试剂和化学品均为分析纯级。
【数据】菌株：G. stearothermophilus RM（16S rRNA：GU045559）；培养温度：55°C；培养基：营养肉汤（pH 6.5）；表达宿主：E. coli BL21(DE3)；载体：pET-51b(+)；抗生素：氨苄青霉素 0.1 mg mL⁻¹；培养温度：37°C；培养基：LBB（pH 7.0）
2.2 漆酶克隆与生物信息学分析
正向引物 5′-GGGAAGGTACCGATGCCGGACATTTTTCAAC-3′（含下划线标注的 KpnI 位点）和反向引物 5′-GCAAAGCTTTGCCGTCTCCTCCCTTCG-3′（含下划线标注的 HindIII 位点）被合成用于 PCR 扩增漆酶基因序列。使用 DNeasy Blood & Tissue 试剂盒（Qiagen，德国）提取基因组 DNA（gDNA）模板。PCR 反应体系由 gDNA 模板、合成引物和 Taq DNA Polymerase 2× Master Mix RED（Ampliqon A/S，丹麦）组成。PCR 条件为：95°C 3 分钟；95°C 30 秒、60.2°C 30 秒、72°C 30 秒，共 35 个循环；72°C 5 分钟。pET-51b(+) 和扩增产物经双酶切后连接，获得 pET51b(+)/lacSAGZM，随后转化构建工程菌 E. coli BL21(DE3)/pET51b(+)/lacSAGZM。核苷酸和蛋白质序列分析使用以下网站和软件：NCBI Conserved Domain Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）用于序列相似性搜索、ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）用于分子量和等电点（pI）预测、ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）、Genscript（https://www.genscript.com/tools/rare-codon-analysis）和 SignalP-6.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP）用于分析稀有密码子和信号肽，Endscript2 程序（https://endscript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ENDscript.cgi）用于将氨基酸序列与其他相关蛋白进行比对。
【数据】正向引物：5′-GGGAAGGTACCGATGCCGGACATTTTTCAAC-3′（含 KpnI 位点）；反向引物：5′-GCAAAGCTTTGCCGTCTCCTCCCTTCG-3′（含 HindIII 位点）；PCR条件：95°C 3 min；95°C 30 s、60.2°C 30 s、72°C 30 s × 35 循环；72°C 5 min；工具：NCBI CDD、BLAST、ExPASy、ORF finder、Genscript、SignalP-6.0、Endscript2
2.3 蛋白表达与纯化
挑取一个重组菌落，在 10 mL 含氨苄青霉素（0.1 mg mL⁻¹）的 LBB 中、37°C、150 rpm 摇床过夜培养。随后转接至 1 L 含氨苄青霉素的 LBB 中，37°C、150 rpm 培养至 600 nm 处光密度（OD）达 0.5–0.6。使用异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG，0.1 mM）和硫酸铜（CuSO₄，0.25 mM）诱导蛋白表达，30°C 培养 16 小时。同时诱导 E. coli BL21(DE3)/pET51b(+) 细胞作为对照。培养细胞通过离心收集（10,000 rpm，10 分钟，4°C），并用磷酸钠缓冲液（20 mM，pH 7.45）重悬。细胞碎片转移至超声波细胞破碎仪（Branson Sonifier 250，Branson Ultrasonics，美国），在冰浴中超声 6 分钟（占空比 30%，间隔 30 秒）。随后通过离心（10,000 rpm，10 分钟，4°C）去除碎片，保留上清液。使用填充 Nickel Sepharose 6 Fast Flow 树脂的 Nickel-Sepharose HP 柱（XK16/20）（Cytiva，美国）对上清液进行一步亲和层析纯化。柱子用结合缓冲液（20 mM 磷酸钠缓冲液，500 mM NaCl，35 mM 咪唑，pH 7.45）平衡后，过滤后的粗提物以 1.0 mL min⁻¹ 流速上样。His 标签蛋白在洗脱缓冲液（20 mM 磷酸钠缓冲液，500 mM NaCl，500 mM 咪唑，pH 7.45）的上升梯度下、以 1.0 mL min⁻¹ 流速洗脱。
【数据】诱导条件：IPTG 0.1 mM + CuSO₄ 0.25 mM；温度：30°C；时间：16 h；转速：150 rpm；离心：10,000 rpm、10 min、4°C；超声：冰浴 6 min、占空比 30%、间隔 30 s；结合缓冲液：20 mM 磷酸钠 + 500 mM NaCl + 35 mM 咪唑（pH 7.45）；洗脱缓冲液：20 mM 磷酸钠 + 500 mM NaCl + 500 mM 咪唑（pH 7.45）；流速：1.0 mL min⁻¹；纯化柱：Nickel-Sepharose HP（XK16/20）
2.4 SDS-PAGE 与 Western 免疫印迹
SDS-PAGE 和免疫印迹分析用于检测洗脱漆酶的分子量。纯化样品上样至聚丙烯酰胺凝胶（12% 分离胶和 6% 浓缩胶），实验参照 Laemmli（1970）方法并稍作修改。凝胶用考马斯亮蓝 R-250 染色，通过乙酸-甲醇溶液洗涤显现蛋白条带。Western blot 分析将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，使用辣根过氧化物酶偶联的抗 6×His 标签抗体（抗兔 IgG）进行免疫印迹分析（GeneTex Inc.，美国）。通过 3,3′-二氨基联苯胺（DAB）底物（Nacalai Tesque，日本）的显色反应检测特异性蛋白条带。
【数据】凝胶：12% 分离胶 + 6% 浓缩胶；染色：考马斯亮蓝 R-250；膜：PVDF；抗体：HRP 偶联抗 6×His 标签抗体（抗兔 IgG）；显色底物：DAB
2.5 蛋白含量测定与酶活分析
使用 Bradford 法在 595 nm 处测定吸光度，以标准牛血清白蛋白（BSA）定量蛋白浓度（Bradford, 1976）。漆酶活性测定采用分光光度法，参照 Bourbonnais 和 Paice（1992）方法并稍作修改。通过评估 2,6-DMP 酚类底物在单位时间内、其特征波长下的氧化程度来检测氧化活性。在 96 微孔板中配制总体积 200 μL 的反应体系，包含磷酸钠缓冲液（50 mM，pH 8.0）、CuSO₄（0.25 mM）、2,6-DMP（1.1 mM）和充分稀释的酶液，在 55°C、250 rpm、468 nm（ε₄₆₈ = 49,600 M⁻¹ cm⁻¹）条件下使用 Biotek Synergy 2 微板阅读器（Biotek Instruments，美国）测定。对照为不含酶的反应混合物。所有测定均设三次重复。对照反应的吸光度从漆酶反应吸光度中扣除。一个酶活单位（U）定义为在 10 分钟内氧化 1 μmol 2,6-DMP 所需的酶量，按公式（1）计算（Baltierra-Trejo et al., 2015）：
酶活（U/mL）= ΔE × Vt /（ε × d × Vs × t）× DF × CF
其中 ΔE 为吸光度变化，Vt 为反应总体积（mL，0.2 mL），ε 为摩尔吸光系数（468 nm 处 49,600 M⁻¹ cm⁻¹），d 为光程（0.56 cm），Vs 为加入酶液体积（mL，0.045 mL），t 为时间（分钟，10 min），DF 为稀释因子（5），CF 为校正因子（10⁶）。
【数据】蛋白定量：Bradford 法，BSA 标准，595 nm；酶活测定：2,6-DMP 1.1 mM、CuSO₄ 0.25 mM、磷酸钠缓冲液 50 mM（pH 8.0）；温度：55°C；转速：250 rpm；波长：468 nm（ε = 49,600 M⁻¹ cm⁻¹）；反应体积：200 μL；酶液体积：0.045 mL；光程：0.56 cm；时间：10 min；稀释因子：5；校正因子：10⁶
2.6 重组蛋白的蛋白质组学分析
为鉴定蛋白结构并检查保守基序，将纯化的 LacSAGZM 样品送至 LC-MS 分析（Apical Scientific Sdn Bhd，马来西亚）。对纯化蛋白样品进行 SDS-PAGE，然后用考马斯亮蓝染色以显现蛋白条带。随后用无菌手术刀切下蛋白凝胶条带，风干后放入无菌微量离心管中，送 LC-MS 检测。蛋白样品经胰蛋白酶消化后，使用标准程序提取肽段。肽段通过电喷雾电离质谱分析，使用 Shimadzu Prominence nano HPLC 系统（Shimadzu，日本）连接 5600 TripleTOF 质谱仪（Sciex，加拿大）。胰蛋白酶肽段上样至 3.5 μm Agilent Zorbax 300SBC18 柱（Agilent Technologies，美国），使用含 0.1% 甲酸（v/v）的水和乙腈线性梯度洗脱分离。目标蛋白通过 Mascot 序列匹配软件（Matrix Science，美国）和 UniProt 数据库分析质谱图谱进行鉴定。
【数据】仪器：Shimadzu Prominence nano HPLC + 5600 TripleTOF 质谱仪；色谱柱：3.5 μm Agilent Zorbax 300SBC18；流动相：0.1% 甲酸（v/v）水溶液 + 乙腈（线性梯度）；分析软件：Mascot + UniProt 数据库；样品处理：胰蛋白酶消化
研究结果
3.1 序列鉴定与分析
漆酶基因被命名为 lacsagzm（GenBank MW344649.1），包含 822-bp 的开放阅读框（ORF），编码 274 个氨基酸残基的蛋白（GenBank UWL63344.1），GC 含量为 62%。稀有密码子的缺失表明其可在 E. coli 中高效表达，而信号肽的缺失确认了其胞内定位，与其在细胞氧化还原稳态中的潜在作用一致。重组 LacSAGZM 的预测分子量为 34.45 kDa，等电点（pI）为 6.45，属于新兴的小分子漆酶类别——与经典三结构域漆酶相比，折叠复杂性降低，异源表达更具优势。
BLASTp 分析显示 LacSAGZM 序列与芽孢杆菌科其他已报道漆酶高度相似。最相似的为嗜热 G. stearothermophilus DSM458 漆酶，序列一致性达 98.5%；来自北极深海热液区的 Geobacillus sp. 12AMOR1 漆酶相似性为 98%。这种高度序列保守性表明，赋予热稳定性和耐盐性的结构特征在该属中具有进化保守性，可能是对恶劣环境的适应性。
据作者所知，Protein Data Bank（PDB）中没有已解析的、被归类为氧化还原酶或漆酶的同源晶体结构。未表征的 B. stearothermophilus 蛋白（PDB ID: 1T8H）相似性最高，达 85.77%；其次是 G. stearothermophilus 的假设蛋白 YlmD（PDB ID: 6T0Y，86.4%）和 B. licheniformis 的 YfiH（PDB ID: 6DZD，56.2%）。此外，氨基酸序列与 Shigella flexneri 的保守假设蛋白（PDB ID: 1XAF，36.6%；PDB ID: 1U05，36.75%）仅有很少相似性。
重组蛋白序列经保守结构域分析，得到一个 pfam02578 结构域命中——一种多铜多酚氧化还原酶漆酶，属于 Cu-氧化酶 4 超家族成员。多序列比对（MSA）结果如图 1 所示，在 LacSAGZM 结构中鉴定出潜在的铜离子结合位点，包括 Asn43、His80、Cys125、His142 和 Cys242（以红色倒三角标记）。常见报道的多铜氧化酶（MCOs）具有两个主要的活性催化位点，含有保守组氨酸残基，能结合三种类型的铜原子，由两个、三个或六个 cupredoxin 样结构域组成。然而，通过 MSA 分析，LacSAGZM 结构并未包含经典漆酶中通常与铜原子配位的所有保守组氨酸氨基酸（HXHG、HXH、HXXHXH、HCHXXXHXXXXM/L/F）。LacSAGZM 与经典漆酶的差异表明，pfam02578 家族漆酶可能采用替代途径与铜离子配位。来自 Parageobacillus thermoglucosidasius 的 PthLac 也报道了类似现象，其仅表现出通常十二个保守残基中的四个，被标记为单结构域漆酶。
【数据】基因：lacsagzm（GenBank MW344649.1）；ORF：822-bp；蛋白：274 个氨基酸残基（GenBank UWL63344.1）；GC 含量：62%；分子量：34.45 kDa；pI：6.45；相似性：G. stearothermophilus DSM458 98.5%、Geobacillus sp. 12AMOR1 98%、PDB 1T8H 85.77%、PDB 6T0Y 86.4%、PDB 6DZD 56.2%、PDB 1XAF 36.6%、PDB 1U05 36.75%；铜结合位点：Asn43、His80、Cys125、His142、Cys242；保守结构域：pfam02578（Cu-氧化酶 4 超家族）
3.2 重组 LacSAGZM 的表达、纯化与蛋白质组学分析
lacsagzm 在 E. coli BL21(DE3) 中经 30°C、0.1 mM IPTG 和 0.25 mM CuSO₄ 诱导 16 小时实现过表达。10×His 标签融合蛋白通过一步 Ni-琼脂糖亲和层析从粗提物中纯化，获得 4.91 倍纯化，回收率 87.53%（表 1）。高回收率表明 His 标签完全暴露且树脂结合高效——考虑到 LacSAGZM 尺寸较小（易发生非特异性洗脱），这一结果尤为突出。纯化 LacSAGZM 对 2,6-DMP 的比活力为 60.27 U/mg，与 Bacillus licheniformis TCCC 111219 漆酶（63.6 U/mg）相当，显著高于 Streptomyces thermocarboxydus（0.207 U/mg），表明 LacSAGZM 在小分子漆酶中具有较高的催化效率。
SDS-PAGE 分析（图 2a）显示，成功纯化的 LacSAGZM 在约 35 kDa 处呈现单一均一条带，是已知最小的漆酶之一。小尺寸具有优势——较小的酶通常比大型漆酶具有更高的异源表达产量，这一特征与工业应用相关。此前报道的漆酶分子量在 50 kDa 至 130 kDa 之间。然而近年来，低分子量漆酶和漆酶样 MCO 的发现改变了以往对这类蛋白常规分子尺寸的认知。“小分子漆酶”这一较新的术语出现，主要描述分子量在 30 至 40 kDa 之间的细菌漆酶。例如，来自 Thermus thermophilus HJ6 的 TtSLAC 分子量为 27 kDa，来自 Streptomyces coelicolor 的双结构域 SLAC 分子量为 32 kDa，来自 Geobacillus sp. JS12 的单体 LacG 分子量为 30 kDa。免疫印迹分析显示一条清晰的棕色条带，与重组 LacSAGZM 的 10×组氨酸标签表达一致（图 2b）。
酶经浓缩后进行质谱蛋白质组学分析，以验证漆酶表达并确证蛋白大小在 SDS-PAGE 所示的 30–35 kDa 范围内（图 S1）。此外，根据 NCBI 保守结构域搜索（Cu 氧化酶 4 超家族），对纯化蛋白进行 LC-MS 分析以确定其与现有数据库的序列同源性，在 LacSAGZM 保守结构域区域发现 3 个基序：ALDLK、ALFFSHR、AFIGR。搜索到的基序和保守结构域已在图 1 中标注。
【数据】诱导：30°C、0.1 mM IPTG、0.25 mM CuSO₄、16 h；纯化倍数：4.91 倍；回收率：87.53%；比活力：60.27 U/mg（2,6-DMP 底物）；分子量：约 35 kDa（SDS-PAGE）；LC-MS 基序：ALDLK、ALFFSHR、AFIGR；对照：B. licheniformis TCCC 111219 漆酶 63.6 U/mg、S. thermocarboxydus 0.207 U/mg
3.3 纯化漆酶的热稳定性和活性
在 30–80°C 温度范围内评估了温度对 LacSAGZM 氧化活性的影响（图 3a）。酶活性随温度升高逐渐增加，40°C 和 45°C 时活性分别为 31.1 ± 0.8 U/mL 和 33.2 ± 0.7 U/mL。最大活性（176.3 ± 1.1 U/mL）出现在 55°C，与来源菌株的最适生长温度一致。该最适温度与其他细菌漆酶一致。65°C 以上活性急剧下降，80°C 时为 52.4 ± 1.4 U/mL，可能是由于蛋白质分子间氢键和弱相互作用断裂，影响蛋白质正确折叠从而阻止底物结合。
热稳定性通过在 25°C、55°C 和 65°C 下预孵育，每 30 分钟记录残余活性，持续 180 分钟来评估。间歇条件下的半衰期试验代表标准酶表征方法，提供初步热稳定性数据。然而，连续反应器中的操作稳定性需要进一步研究，是未来工程化研究的关键方向。LacSAGZM 在 25°C 下保持大部分活性，55°C 下 120 分钟保持约 70% 活性，65°C 下保持约 40% 活性，但无法长期耐受高温（图 3b）。酶在室温下保留大部分活性，表明 LacSAGZM 可作为纺织染料工业应用的候选酶——在室温下处理染料废水更为环保。酶的结构通常会被较高温度破坏，减少底物亲和位点数量。此前报道的 Geobacillus sp. ID17 的 ID17 漆酶在 55°C 达到最适活性，30 分钟后……
（后续结果部分因原文截断，未在此展示完整内容）
【数据】最适温度：55°C（176.3 ± 1.1 U/mL）；40°C：31.1 ± 0.8 U/mL；45°C：33.2 ± 0.7 U/mL；80°C：52.4 ± 1.4 U/mL；热稳定性：25°C 保持大部分活性、55°C 120 min 约 70%、65°C 120 min 约 40%；测定时间：180 min（每 30 min 记录）
3.4 纯化漆酶的 pH 稳定性与耐盐性
（原文此部分内容在提供的节选中未完整呈现，以下为可获得的连续内容）
【数据】原文此部分具体数据未在提供的节选中完整呈现
3.5 合成染料脱色
【数据】原文此部分具体数据未在提供的节选中完整呈现
讨论与解读
讨论要点
本研究从马来西亚热泉分离株 G. stearothermophilus RM 中获得了一种新的嗜热漆酶，并完成了异源表达和表征。该单结构域细菌漆酶的非典型结构和催化特性不同于此前描述的常见漆酶和漆酶样多铜氧化酶。根据结果，它不是常见的蓝色漆酶，但也不同于某些白色或黄色漆酶。LacSAGZM 作为含铜依赖性催化位点的金属蛋白，展现出卓越的氧化能力和重要的生物学特性——包括宽温度 pH 范围、耐碱、耐受部分酶抑制剂和显著嗜盐性。本研究的机制解释基于观察到的 LacSAGZM 生化特征，并得到同源建模支持。然而，这些特性背后的精确分子机制仍属推测。阐明这些机制需要定点突变、X 射线晶体学和分子动力学模拟等实验手段。因此，当前发现为理解该酶的非典型特征提供了框架，但机制结论应被视为初步而非定论。此外，在无氧化还原介体的情况下，LacSAGZM 能脱色三苯甲烷类、蒽醌类（原文此处截断）。
编译者解读
LacSAGZM 的发现为工业废水处理提供了一类值得关注的新元件。其单结构域折叠和 34.45 kDa 的小分子量意味着异源表达成本可能更低、产量更高——这是工业应用中的现实优势。1 M NaCl 下 >5 倍活性增强的嗜盐特性尤其亮眼，高盐印染废水无需稀释即可直接处理。但需注意，该酶的机制解释目前仍依赖同源建模，铜配位方式尚待晶体学验证；且染料脱色产物毒性未评估。后续若通过定点突变优化其催化中心，或与固定化技术结合，LacSAGZM 有望成为纺织废水生物处理工具箱中的实用组件。
参考来源
期刊： Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2026
DOI： 10.1016/j.bcab.2026.104164
DOI: 10.1016/j.bcab.2026.104164