来源：Heterologous expression of Stlac2, a laccase isozyme of Setosphearia turcica, and the ability of decolorization of malachite green（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space
导读
真菌漆酶因能氧化多种酚类及芳香胺类化合物而在工业生物催化中备受关注。本研究从玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）中鉴定出三种漆酶同工酶，并重点对Stlac2进行了毕赤酵母和大肠杆菌两种系统的异源表达。结果显示，毕赤酵母中表达的糖基化Stlac2因Asn97位点错误糖基化而丧失活性，而大肠杆菌中表达的非糖基化重组Stlac2比活力达28.23 U/mg，15分钟内可脱色67.08%的孔雀石绿，展现出工业应用潜力。
研究背景
漆酶（EC1.10.3.2）属于多铜氧化酶家族，能够催化超过200种化合物（如酚类化合物、芳香胺及其衍生物）的单电子氧化。在氧化还原介体存在下，漆酶还可将底物范围扩展至木质素等多酚聚合物。漆酶广泛存在于植物、昆虫、真菌和细菌中，其中真菌漆酶研究最为深入，也是目前唯一应用于生物技术领域的漆酶类型。
多数真菌漆酶为胞外糖蛋白，分子量55–85 kDa，糖含量10%–20%，甚至可达25%。真菌漆酶含有三个类cupredoxin结构域和四个铜离子（三种类型金属结合位点T1–T3），底物在T1位点结合，电子传递至T2/T3中心，O₂在此被还原为H₂O。氨基酸序列和糖基化修饰均会影响漆酶的催化活性和氧化还原电位，导致同一菌株中不同漆酶同工酶表现出各异特性。多种真菌中已报道存在多个漆酶同工酶，例如糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）中已研究了12种具有不同生化特性的漆酶同工酶。
研究方法
2.1 真菌培养与漆酶同工酶分离
S. turcica菌株01–23分离自中国辽宁省玉米叶片的NLB样本，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（编号9857），在河北省植物生理与分子病理学重点实验室中保存于PDA培养基、4°C条件下。
将S. turcica接种于含20 mL完全培养基的50 mL锥形瓶中，培养基中添加0.05 g/L CuSO₄，于28°C培养7天以诱导漆酶产生。过滤后的培养液经Amicon Ultra-15膜过滤器（Millipore，德国）浓缩，作为胞外粗蛋白样品用于分离。取0.2 g菌丝体在液氮中研磨，溶于10 mL磷酸盐缓冲液中提取胞内粗蛋白。
漆酶同工酶采用Native-PAGE（10%）分离，用含2 mM漆酶底物ABTS和2,6-DMP的0.1 M柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.0）染色，室温孵育。
【数据】菌株：S. turcica 01–23；培养基：完全培养基+0.05 g/L CuSO₄；温度：28°C；时间：7天；菌丝量：0.2 g；缓冲液：10 mL PBS；Native-PAGE浓度：10%；染色缓冲液：0.1 M柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.0）；底物浓度：2 mM ABTS和2,6-DMP
2.2 漆酶同工酶鉴定与糖基化分析（ESI-MS/MS）
染色后的漆酶同工酶活性条带用于肽质量指纹图谱鉴定（ESI-MS/MS分析）。Native-PAGE获得的条带按照北京蛋白质创新有限公司提供的批量流程处理。肽片段的MS/MS谱图在NCBI的S. turcica Et28A v1.0蛋白质数据库中进行搜索。阳性肽段定义为搜索结果中排名第一且置信水平高于95%的肽段。随后对鉴定到的肽段对应谱图进行人工核查。
【数据】数据库：S. turcica Et28A v1.0（NCBI）；阳性肽段标准：排名第一且置信度>95%；分析平台：ESI-MS/MS
2.3 RNA提取与cDNA合成
收集S. turcica过滤菌丝体，液氮研磨。使用RNA Simple Total RNA kit（天根，中国）提取总RNA，用Eppendorf Bio Photometer plus测定RNA含量。反转录使用Prime Script™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，日本）获得cDNA，用于StLAC2基因扩增。
【数据】RNA提取试剂盒：RNA Simple Total RNA kit（天根）；反转录试剂盒：Prime Script™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）；定量仪器：Eppendorf Bio Photometer plus
2.4 重组漆酶Stlac2在毕赤酵母KM71H中的表达
用于真核表达的StLAC2 cDNA通过PCR扩增，使用引物StLAC2-PP-F（5′-CATGGAATTCATGTCTTACAATGGTTC-3′，含EcoRI酶切位点）和引物StLAC2-PP-R（5′-CATGTCTAGATCAATGATGATGATGATGATGCAGGCCCGAGTCGATCTG-3′，含XbaI酶切位点），克隆至pPICZαA表达载体（图S2b）。PCR使用Taq DNA聚合酶，扩增片段经提取后插入pMD-19载体进行测序。重组质粒pMD-19-StLAC2经EcoRI和XbaI双酶切后，连接至经相同酶切处理的pPICZαA载体，构建质粒pPICZα-StLAC2。经测序确认插入序列正确的pPICZα-StLAC2质粒通过电转化导入宿主菌P. pastoris KM71H。
转化子在含100 μg/mL zeocin的YPDS平板上筛选，28°C培养2天。获得的菌落用α-factor引物（5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′）和3'AOX引物（5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′）进行PCR筛选（图S2d）。正确转化子接种于4 mL BMGY培养基，28°C、220 rpm培养20小时。随后离心收集细胞，重悬于BMMY培养基（OD₆₀₀~1.0）。加入甲醇至终浓度1%（v/v），诱导3天。表达培养物进行10% SDS-PAGE分析。空载体pPICZαA作为对照。诱导培养6天后的上清液按此前描述的方法进行Western blot检测。
【数据】引物：StLAC2-PP-F（含EcoRI位点）/StLAC2-PP-R（含XbaI位点）；载体：pPICZαA；宿主菌：P. pastoris KM71H；筛选抗生素：100 μg/mL zeocin；YPDS平板培养：28°C、2天；BMGY培养：4 mL、28°C、220 rpm、20 h；BMMY诱导：OD₆₀₀~1.0、1%甲醇、3天；SDS-PAGE浓度：10%
2.5 重组漆酶Stlac2在大肠杆菌Rossetta（DE3）中的表达与纯化
用于原核表达的StLAC2 cDNA通过PCR扩增，使用引物StLAC2-EC-F（5′-CATGGAATTCATGTCTTACAATGGTTCG-3′，含EcoRI酶切位点）和引物StLAC2-EC-R（5′-CATGAAGCTTTCACAGGCCCGAGTCGATCTGG-3′，含HindIII酶切位点），克隆至pET32表达载体（图S2c）。质粒pET32-StLAC2按上述方法构建，但使用EcoRI和HindIII酶切，转化至E. coli Rossetta（DE3）。
转化子在含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选，用T7引物（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）和T7 Terminator引物（5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′）进行PCR确认（图S2e）。含重组载体pET32-StLAC2的转化子在37°C、220 rpm、含50 μg/mL氨苄青霉素条件下培养。当OD₆₀₀达到0.7–0.8时，加入1 mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组Stlac2表达。加入IPTG 3小时后收集细胞，用10% SDS-PAGE检测。
重组漆酶Stlac2用6×His Ni-IDA Resin（Probe Gene，中国）纯化。重组漆酶Stlac2通过包涵体蛋白提取试剂盒（Sangon，中国）从包涵体中变性复性纯化。复性前后的样品进行SDS-PAGE检测。蛋白浓度用BCA蛋白定量试剂盒（Sangon，中国）测定。
【数据】引物：StLAC2-EC-F（含EcoRI位点）/StLAC2-EC-R（含HindIII位点）；载体：pET32；宿主菌：E. coli Rossetta（DE3）；筛选抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素；培养条件：37°C、220 rpm、50 μg/mL氨苄青霉素；诱导：OD₆₀₀ 0.7–0.8时加1 mM IPTG；诱导时间：3 h；纯化介质：6×His Ni-IDA Resin；包涵体处理：Inclusion Body Protein Extraction Kit（Sangon）；蛋白定量：BCA Protein Assay kit
2.6 去糖基化分析与糖基化位点鉴定
为去除N-聚糖，真核重组Stlac2用糖蛋白变性缓冲液在100°C变性10分钟，然后用PNGase F（NEB，美国）按说明书进行去糖基化处理。去糖基化后的重组漆酶经SDS-PAGE分离。毕赤酵母中表达的重组漆酶染色条带用于糖基化位点鉴定，按照北京蛋白质创新有限公司的批量流程操作。
N-糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr）用NetNGlyc 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）预测。Stlac2的糖基化位点与已解析晶体结构的漆酶进行比较，包括Melanocarpus albomyces漆酶（PDB ID:1GW0）、Botrytis aclada漆酶（PDB ID:3SQR）、Aspergillus niger的McoG（PDB ID:5LM8）以及Thielavia arenaria的子囊菌真菌漆酶（PDB ID:3PPS）。氨基酸序列比对用DNAMAN完成。为分析糖基化的影响，Stlac2的三维结构由YASARA生成，结果用Pymol展示和分析。
【数据】去糖基化条件：100°C、10 min变性；酶：PNGase F（NEB）；预测工具：NetNGlyc 1.0；比对软件：DNAMAN；结构生成：YASARA；结构展示：Pymol；参考结构：1GW0、3SQR、5LM8、3PPS
2.7 漆酶活性测定与重组Stlac2的生化表征
以ABTS为底物，在420 nm（ε₄₂₀ = 36 mM⁻¹/cm⁻¹）处测定重组Stlac2活性。一个酶活单位（U）定义为每分钟氧化1 μmol ABTS所需的酶量。
酶活性在pH 3.0–6.5范围内测定，使用0.1 M柠檬酸缓冲液。温度效应在pH 4.5标准测定条件下，于30°C至80°C不同温度孵育反应混合物进行测定。酶活性以相对于最大活性的百分比（%相对活性）表示，最大活性设为100%。
金属离子效应通过将重组Stlac2与终浓度5和10 mM的金属离子在60°C孵育5分钟进行测定。酶活性以相对于不添加离子的百分比（%相对活性）表示。
【数据】底物：ABTS；检测波长：420 nm；ε₄₂₀ = 36 mM⁻¹/cm⁻¹；pH范围：3.0–6.5；缓冲液：0.1 M柠檬酸缓冲液；温度范围：30–80°C；标准pH：4.5；金属离子浓度：5和10 mM；孵育条件：60°C、5 min
2.8 重组Stlac2对孔雀石绿（MG）的脱色
为评价应用潜力，使用三芳基甲烷染料MG分析Stlac2的降解能力。反应混合物含100 mM Tris缓冲液，MG浓度分别为20、50、100和200 mg/L，加入100 μg/mL纯化重组Stlac2，反应体积0.5 mL，室温孵育。MG脱色通过测定618 nm处吸光度变化来跟踪，降解效率以百分比计算：脱色率% = (A₀ − Af)/A₀ × 100%。
【数据】缓冲液：100 mM Tris；MG浓度：20、50、100、200 mg/L；酶量：100 μg/mL；反应体积：0.5 mL；检测波长：618 nm；温度：室温
研究结果
3.1 漆酶同工酶的分离与鉴定
从液体CM培养基中培养7天的S. turcica中收集胞内和胞外粗蛋白，用ABTS和2,6-二甲氧基苯酚（2,6-DMP）染色的Native-PAGE分离漆酶同工酶。ABTS染色比2,6-DMP染色更灵敏（图S1）。ABTS染色显示胞内粗蛋白中有两条带，浓缩的胞外粗蛋白中有一条带（图1a）。
两条带经ESI-MS/MS鉴定漆酶同工酶，肽指纹图谱与从JGI下载的S. turcica蛋白数据库比对（图1b）。条带I的蛋白肽段序列匹配Stlac2（Gi: 482813379）和Stlac6（Gi: 482808389）；条带II匹配Stlac1（Gi: 482805212）和Stlac6（Gi: 482808389），这些均归类为S. turcica中的严格意义上的漆酶。
Stlac2预测分子量较低（61.64 kDa），预测pI较低（5.00），主要分泌至胞内。另一条带鉴定为Stlac1和Stlac6，在胞内和胞外均可检测到。Stlac1和Stlac6在S. turcica的9种漆酶样多铜氧化酶中一致性最高（48.70%），预测分子量分别为65.73 kDa和65.85 kDa。由于Stlac6的预测pI为5.07，低于Stlac1的5.65，且预测分子量大于Stlac2，Stlac6的条带应位于Stlac1和Stlac2之间。但Stlac6在两条带中均被检测到，说明可能存在不同的糖基化状态。在Antheraea mylitta中曾报道丝氨酸蛋白酶抑制剂的两个亚型因糖基化状态不同而呈现不同迁移位置。
Coprinopsis cinerea中有17个漆酶基因，Leptosphaerulina sp.中有4个漆酶型多铜氧化酶。然而，多基因家族中只有少数同工酶能被检测和分离。例如，P. ostreatus全基因组中鉴定出12个漆酶基因，但只有6个漆酶被分离和表征。Ganoderma lucidum基因组含有16个漆酶基因，在不同培养条件下分泌3至5个同工酶。此外，同工酶即使对常见底物ABTS和2,6-DMP也表现出不同的底物特异性。C. cinerea的全部17个漆酶同工酶均对2,6-DMP表现出漆酶活性，但只有8个对ABTS有活性。
利用三个Pfam铜氧化酶家族的Hidden Markov Model在基因组中发现9个漆酶样多铜氧化酶，具有不同的表达模式，预测分子量相似（60.83–68.10 kDa）且pI相近，这可能使分离变得困难。q-PCR检测显示StLAC2、StLAC6和StLAC8以不同程度高表达。Stlac8虽然基因表达水平高，但未被检测到。不同的培养条件和芳香族化合物的添加也可能导致漆酶同工酶的差异产生。因此，未来将进一步研究S. turcica中漆酶同工酶的基础和应用价值。
【数据】菌株：S. turcica；培养时间：7天；染色底物：ABTS和2,6-DMP；Stlac2预测分子量：61.64 kDa；Stlac2预测pI：5.00；Stlac1预测分子量：65.73 kDa；Stlac6预测分子量：65.85 kDa；Stlac1 pI：5.65；Stlac6 pI：5.07；Stlac1/Stlac6一致性：48.70%；基因组漆酶基因数：C. cinerea 17个、P. ostreatus 12个、G. lucidum 16个；9个漆酶样多铜氧化酶预测分子量范围：60.83–68.10 kDa
3.2 重组漆酶Stlac2在毕赤酵母KM71H中的表达
为表征漆酶Stlac2，将编码序列克隆并插入含α-factor信号肽和6×组氨酸标签的质粒pPICZαA（图S2b）。构建的质粒pPICZα-StLAC2转化至P. pastoris KM71H，转化子在含zeocin（100 μg/mL）的YPD培养基上生长良好，经α-factor和AOX引物PCR验证（图S1d），表明pPICZα-StLAC2已整合至毕赤酵母的AOX位点。
带α-factor信号肽的重组漆酶Stlac2在甲醇诱导后的细胞培养上清液中经SDS-PAGE检测到单一明显条带，不同阳性转化子样品均显示该条带，而空载体pPICZα-StLAC2诱导对照和未诱导的阳性转化子样品中无条带出现（图2a）。重组漆酶经Western blot确认（图2b）。
重组漆酶Stlac2的分子量约为100 kDa（与蛋白marker相比），但Stlac2（554个氨基酸）的预测分子量为61.64 kDa。为排除蛋白二聚体的可能性，加入还原剂20% β-巯基乙醇和0.1 mol/L二硫苏糖醇进行解聚。结果显示单一明显条带未发生变化（数据未显示），说明重组漆酶Stlac2为单体，但分子量远大于预测值。重组Stlac2不能氧化底物ABTS或2,6-DMP。
【数据】宿主菌：P. pastoris KM71H；筛选抗生素：100 μg/mL zeocin；重组蛋白表观分子量：~100 kDa；Stlac2预测分子量：61.64 kDa（554 aa）；还原剂：20% β-巯基乙醇、0.1 mol/L DTT；诱导剂：甲醇；检测方法：SDS-PAGE、Western blot
3.3 重组漆酶Stlac2在大肠杆菌Rossetta（DE3）中的表达与纯化
为验证重组Stlac2分子量异常和活性丧失的原因，将编码序列插入不含信号肽的质粒pET32a（图S2c）。构建的质粒pET32-StLAC2转化至E. coli Rossetta（DE3），转化子在含氨苄青霉素（50 μg/mL）的LB培养基上生长，经T7引物PCR验证（图S1e）。
IPTG诱导后，全细胞裂解物中检测到带His标签但无信号肽的重组漆酶Stlac2，表观分子量约80 kDa，与未诱导对照相比有明显差异（图3a）。重组漆酶经Ni-IDA纯化（图3b），Stlac2特异性条带出现在沉淀中，表明表达蛋白以包涵体形式存在，纯度约70%。
目标蛋白经包涵体变性复性纯化后，纯度为87%，浓度为1.03 mg/mL。纯化重组Stlac2以ABTS为底物、pH 4.5柠檬酸缓冲液、室温条件下测定的活性为28.23 U/mg。
在大肠杆菌中表达的重组Stlac2形成包涵体，复性后可能影响酶活性，但仍表现出相对较高的ABTS氧化活性。与细菌漆酶相比，真菌漆酶在大肠杆菌中成功表达的案例较少。P. ostreatus的漆酶基因LACP83在大肠杆菌中异源表达获得3740 U/L的活性，与该菌株天然培养144小时的水平相近。Rigidoporus lignosus的重组漆酶在大肠杆菌中表达后可用作医用新型酶生物传感器。我们此前已将S. turcica的Stlac4在大肠杆菌中异源表达，活性高达127.78 U/mg，高于Stlac2的28.23 U/mg，这可能是由于Stlac2形成了包涵体所致。
【数据】宿主菌：E. coli Rossetta（DE3）；筛选抗生素：50 μg/mL氨苄青霉素；重组蛋白表观分子量：~80 kDa；包涵体纯度：~70%；复性后纯度：87%；蛋白浓度：1.03 mg/mL；比活力：28.23 U/mg（ABTS，pH 4.5，室温）；Stlac4比活力：127.78 U/mg；LACP83活性：3740 U/L
3.4 毕赤酵母中Stlac2重组蛋白的糖基化分析
用ABTS检测毕赤酵母中Stlac2重组蛋白活性时，反应混合物颜色未发生变化；而相同浓度的大肠杆菌Stlac2重组蛋白和S. turcica粗蛋白则使ABTS变为深绿色，且颜色随时间加深（图4a）。
多数真菌漆酶为糖蛋白，糖含量10%–20%，甚至可达25%。由于毕赤酵母表达系统具有翻译后修饰能力，常被用于异源表达漆酶。糖基化通常提高真菌酶的热稳定性，但具体效果取决于糖基化位置，可能导致催化活性升高或降低。
对毕赤酵母中Stlac2重组蛋白的糖基化进行了检测（图4b）。经PNGase F去糖基化后，出现两条分子量分别约为80 kDa和90 kDa的条带，而去糖基化前为100 kDa，说明高分子量是由于糖基化修饰所致。
【数据】去糖基化前分子量：~100 kDa；去糖基化后分子量：~80 kDa和~90 kDa；去糖基化酶：PNGase F；底物：ABTS
3.5 Stlac2重组蛋白糖基化位点分析
用NetNGlyc 1.0预测Stlac2的N-糖基化位点，发现Stlac2含有4个潜在的N-糖基化位点（Asn97、Asn171、Asn291和Asn488）。ESI-MS/MS分析鉴定出Asn97为实际糖基化位点（图5a）。与其他已解析结构的漆酶进行氨基酸序列比对，发现Stlac2的Asn97位于一个在真菌漆酶中相对保守的区域（图5b）。
用YASARA构建Stlac2三维结构模型，分析Asn97糖基化对酶活性的影响。结构分析显示，Asn97位于底物结合口袋附近，该位点的糖基化可能通过空间位阻阻碍底物进入活性中心，从而导致毕赤酵母中表达的重组Stlac2丧失催化活性。这解释了为什么去糖基化后的Stlac2（如在大肠杆菌中表达的非糖基化形式）能够恢复酶活性。
【数据】预测N-糖基化位点数：4个（Asn97、Asn171、Asn291、Asn488）；实际糖基化位点：Asn97；分析方法：NetNGlyc 1.0预测、ESI-MS/MS鉴定、YASARA结构建模
3.6 重组Stlac2的生化特性表征
以ABTS为底物测定重组Stlac2在不同pH条件下的活性。在室温下，pH 3.0–6.5范围内测定最适pH，结果显示重组Stlac2在pH 4.5时表现出最高活性（图6a）。
在pH 4.5标准条件下测定温度对酶活性的影响，温度范围30–80°C。结果显示重组Stlac2在60°C时活性最高（图6b）。
金属离子对重组Stlac2活性的影响通过将酶与终浓度5和10 mM的金属离子在60°C孵育5分钟进行测定。结果显示，10 mM Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺抑制酶活性；10 mM Fe³⁺使酶活性升高至未添加离子对照的315%；Cu²⁺对酶活性无影响。
【数据】最适pH：4.5；最适温度：60°C；10 mM Na⁺/Mg²⁺/Ca²⁺/Mn²⁺：抑制活性；10 mM Fe³⁺：相对活性315%（对照=100%）；Cu²⁺：无影响；测定底物：ABTS；pH范围：3.0–6.5；温度范围：30–80°C
3.7 重组Stlac2对孔雀石绿的脱色
为评价重组Stlac2的应用潜力，以三芳基甲烷染料MG为底物进行脱色实验。反应体系含100 mM Tris缓冲液，MG浓度分别为20、50、100和200 mg/L，加入100 μg/mL纯化重组Stlac2，反应体积0.5 mL，室温孵育。结果显示，重组Stlac2在15分钟内可脱色67.08%的20 mg/L MG（图7），且无需添加任何氧化还原介体。
【数据】MG浓度：20、50、100、200 mg/L；酶量：100 μg/mL；缓冲液：100 mM Tris；反应体积：0.5 mL；温度：室温；脱色率：67.08%（20 mg/L MG，15 min）；检测波长：618 nm
讨论与解读
本研究通过Native-PAGE和ESI-MS/MS鉴定出S. turcica产生的三种活性漆酶同工酶（Stlac1、Stlac2和Stlac6），并重点对Stlac2进行了异源表达研究。毕赤酵母中表达的真核重组Stlac2因Asn97位点错误糖基化而失活——该位点靠近底物结合口袋，糖基化可能通过空间位阻阻碍底物进入。大肠杆菌中表达的重组Stlac2无需糖基化即具有催化活性，比活力28.23 U/mg，最适pH 4.5，最适温度60°C。值得注意的是，10 mM Fe³⁺可将酶活性提高至对照的315%，而Cu²⁺对活性无影响。重组Stlac2无需介体即可在15分钟内脱色67.08%的20 mg/L孔雀石绿，显示出工业应用潜力。
编译者解读：该研究的价值在于揭示了糖基化对漆酶活性的双重影响——真核系统的"过度修饰"反而可能损害催化功能，而原核系统的非糖基化形式却表现出良好的催化性能。这提示合成生物学中"表达系统-翻译后修饰-酶功能"三者间的匹配至关重要。大肠杆菌表达虽产活性酶，但包涵体复性工艺增加了生产成本，未来可通过信号肽设计、共表达分子伴侣或低温诱导等策略实现可溶性表达。Fe³⁺显著激活该酶的特性也值得关注，可能与其电子传递机制相关，为酶工程改造提供了新靶点。
参考来源
Liu N. Heterologous expression of Stlac2, a laccase isozyme of Setosphearia turcica, and the ability of decolorization of malachite green. International Journal of Biological Macromolecules, 2019. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2019.07.029
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2019.07.029