来源：Fusion strategy enables high-level expression of fungal laccase in Pichia pastoris for efficient detoxification of aflatoxin B1 and zearalenone（Applied Food Research）| 编译：DNA Lab Space
导读
真菌漆酶因氧化还原电位高，被视为霉菌毒素脱除的理想工具，但异源表达困难长期制约其应用。本研究将来源于赭色齿毛菌（Steccherinum ochraceum）的漆酶SoLac与黑曲霉木聚糖酶AnXynB融合，成功在毕赤酵母X33中实现分泌表达，15-L发酵罐中漆酶体积酶活达到9,102.0 U/L。融合蛋白可在无介体条件下直接转化AFB1和ZEN，转化率分别达71.0%和72.9%，且转化产物毒性显著降低，在真实饲料原料体系中同样有效。
研究背景
气候变化持续威胁全球作物生产，粮食安全问题日益严峻。霉菌毒素污染是粮食供应链中的持久性挑战——这些由特定真菌产生的次级代谢产物同时污染食品与饲料，危害人类和动物健康，并造成农业与食品行业的经济损失。目前已鉴定出400余种霉菌毒素，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）和玉米赤霉烯酮（ZEN）最为常见。AFB1主要由黄曲霉和寄生曲霉合成，常污染玉米、花生和大米，具有致癌、致畸和免疫抑制效应；ZEN则由镰刀菌属真菌产生，易在玉米和小麦等谷物中积累，具有雌激素样活性，与乳腺、卵巢和前列腺等多种生殖系统癌症相关。过去十年间，开发可靠的AFB1和ZEN脱除方法成为研究热点。
研究方法
2.1 菌株、培养基与试剂
基因克隆实验使用大肠杆菌Trans1（TransGen Biotech，北京），蛋白异源表达在毕赤酵母X33（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中进行。大肠杆菌在低盐Luria-Bertani培养基中于37 °C培养，根据需要添加25 mg/L博来霉素（zeocin）。毕赤酵母在30 °C下分别于酵母蛋白胨葡萄糖培养基（YPD，含100 mg/L zeocin）、缓冲甘油复合培养基（BMGY）和缓冲甲醇复合培养基（BMMY）中培养。固体培养基添加2%琼脂。ABTS（2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、丁香醛连氮（SGZ）、2,6-二甲氧基苯酚（2,6-DMP）、AFB1、ZEN和山毛榉木聚糖均购自Sigma-Aldrich（St. Louis，MO，USA）。限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific（Waltham，MA，USA）。
【数据】菌株：E. coli Trans1、P. pastoris X33；培养基：低盐LB（37 °C，25 mg/L zeocin）、YPD（30 °C，100 mg/L zeocin）、BMGY、BMMY；固体培养基：2%琼脂；试剂来源：Sigma-Aldrich、Thermo Fisher Scientific
2.2 AnXynB-SoLac融合蛋白的表达与纯化
来源于S. ochraceum的漆酶基因（SoLac，GenBank ID：TCD63669.1）和来源于A. niger的木聚糖酶基因（AnXynB，GenBank ID：XP_001388522.1），均去除信号肽序列后按毕赤酵母密码子偏好性进行优化，由BGI（北京）合成。信号肽通过SignalP在线工具（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）鉴定。多序列比对使用ClustalW软件进行。pPICZα(A)质粒（Invitrogen，Carlsbad，CA）作为异源基因表达载体。重组质粒采用Gibson组装法构建，引物由BGI（北京）合成。以合成基因为模板，利用相应引物通过PCR获得Solac基因和带有linker的Solac-AnxynB融合基因。DNA片段经琼脂糖凝胶回收后，连接至经EcoRI和NotI双酶切的pPICZα(A)载体中。序列确认后，质粒用DraI线性化，通过电穿孔转化至毕赤酵母X33细胞中构建重组菌株。博来霉素抗性转化子在YPD平板上筛选，然后接种于含2 mL BMGY培养基的10 mL培养管中，30 °C、220 rpm振荡培养48 h。随后菌体经8,000 × g、4 °C离心10 min收集，重悬于1.5 mL含1 mM CuSO₄的BMMY培养基中，相同条件下继续诱导培养48 h。每24 h补加甲醇至终浓度1%（v/v）。培养结束后，12,000 × g、4 °C离心10 min，测定漆酶酶活。选择漆酶酶活最高的菌株进行15-L发酵罐放大发酵。
放大发酵时，重组菌株先在50 mL YPD培养基中于30 °C、220 rpm振荡培养48 h。所得一级种子液分装至三个各含200 mL BMGY培养基的摇瓶中，过夜培养获得二级种子液。配制7.5 L基础盐发酵培养基，成分包括：0.93 g/L CaSO₄、18.20 g/L K₂SO₄、14.90 g/L MgSO₄·7H₂O、4.13 g/L KOH、40.00 g/L甘油、26.70 mL/L H₃PO₄和4.35 mL/L PTM1微量盐溶液。PTM1溶液含6.00 g/L CuSO₄·5H₂O、0.08 g/L NaI、3.00 g/L MnSO₄·H₂O、0.20 g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.02 g/L H₃BO₃、0.50 g/L CoCl₂、20.00 g/L ZnCl₂、65.00 g/L FeSO₄·7H₂O、0.20 g/L生物素和5 mL/L H₂SO₄。二级种子液接种入发酵罐，30 °C发酵，搅拌转速800 rpm，溶氧控制在20%–40%之间，用氢氧化铵控制pH约为4.5。甘油耗尽后，以18 mL/h/L的速率流加补料培养基（含12 mL/L PTM1溶液的50%甘油）。当湿细胞生物量达到160–180 g/L时，进入甲醇流加阶段。含12 mL/L PTM1溶液的甲醇以3.2 mL/h/L的速率持续流加，pH维持在接近5.5。此外，每24 h补加10 mL 0.5 M CuSO₄溶液。定期取样测定湿细胞生物量、漆酶和木聚糖酶酶活。发酵结束后收集发酵液，通过中空纤维过滤去除菌体，然后用20 mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.5）进行缓冲液置换。融合蛋白纯化采用HiTrap Q HP阴离子交换柱（GE Healthcare，Buckinghamshire，UK）。缓冲液A为20 mM NaAc-HAc缓冲液（pH 5.5），缓冲液B额外添加1 M NaCl。蛋白通过0至1 M的线性NaCl梯度洗脱。洗脱组分经SDS-PAGE检测，纯度合格的组分合并后进行缓冲液置换至储存缓冲液中。
【数据】密码子优化：毕赤酵母；载体：pPICZα(A)；限制性内切酶：EcoRI、NotI；线性化：DraI；转化方式：电穿孔；诱导条件：BMMY + 1 mM CuSO₄，30 °C，48 h；甲醇补加：每24 h至1%（v/v）；离心条件：8,000 × g/10 min/4 °C、12,000 × g/10 min/4 °C；发酵罐：15-L；基础盐培养基：7.5 L，含0.93 g/L CaSO₄、18.20 g/L K₂SO₄、14.90 g/L MgSO₄·7H₂O、4.13 g/L KOH、40.00 g/L甘油、26.70 mL/L H₃PO₄、4.35 mL/L PTM1；PTM1配方：6.00 g/L CuSO₄·5H₂O、0.08 g/L NaI、3.00 g/L MnSO₄·H₂O、0.20 g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.02 g/L H₃BO₃、0.50 g/L CoCl₂、20.00 g/L ZnCl₂、65.00 g/L FeSO₄·7H₂O、0.20 g/L生物素、5 mL/L H₂SO₄；发酵参数：30 °C、800 rpm、溶氧20%–40%、pH约4.5；补料速率：18 mL/h/L（甘油相）；甲醇流加速率：3.2 mL/h/L；诱导期pH约5.5；CuSO₄补加：每24 h 10 mL 0.5 M；纯化：HiTrap Q HP阴离子交换柱，0–1 M NaCl线性梯度
2.3 酶活测定
漆酶酶活通过监测1 mM ABTS在50 mM NaAc-HAc缓冲液（pH 4.8）中的氧化反应测定。在30 °C下记录420 nm处吸光度增加，持续3 min。1个单位（1 U）漆酶酶活定义为每分钟催化生成1 μmol产物所需的酶量。木聚糖酶酶活测定在含1%（w/v）山毛榉木聚糖的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液（pH 5.0）中、55 °C反应10 min。释放的还原糖量用3,5-二硝基水杨酸法测定。1个单位（1 U）木聚糖酶酶活对应每分钟释放1 μmol木糖当量所需的酶量。蛋白浓度采用Bradford法测定。
【数据】漆酶酶活：1 mM ABTS、50 mM NaAc-HAc（pH 4.8）、30 °C、420 nm、3 min；1 U = 1 μmol产物/min；木聚糖酶酶活：1%山毛榉木聚糖、柠檬酸-Na₂HPO₄（pH 5.0）、55 °C、10 min；1 U = 1 μmol木糖当量/min；蛋白定量：Bradford法
2.4 重组漆酶的生化特性表征
使用纯化的重组AnXynB-SoLac进行漆酶性质表征。在30 °C下测定漆酶最适pH，三种底物ABTS、2,6-DMP和SGZ浓度均为1 mM。实验采用不同的100 mM缓冲体系覆盖特定pH范围：甘氨酸-HCl（pH 2.0）、柠檬酸-Na₂HPO₄（pH 3.0–7.0）、Tris-HCl（pH 7.0–9.0）和甘氨酸-NaOH（pH 9.0–12.0）。SoLac的最适温度以ABTS为底物，在20 °C至90 °C范围内测定。pH稳定性评估：将酶适当稀释后，在pH 2.0至12.0的缓冲液中于30 °C孵育1 h，以ABTS为底物测定残余酶活。热稳定性评估：将稀释酶液与100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）混合，分别在40、50、60和70 °C下处理不同时间，按预定时间间隔取样测定残余酶活。SoLac的动力学行为在70 °C下测定，底物浓度范围分别为ABTS（0.5–4 mM，pH 4.0）、SGZ（0.05–0.1 mM，pH 6.0）和2,6-DMP（0.1–1.5 mM，pH 6.0）。获得的数据通过非线性回归拟合Michaelis–Menten方程，使用GraphPad Prism 10软件（版本10.0.0；San Diego，CA，USA）进行分析。每个实验设三次重复。
【数据】最适pH测定：30 °C，底物1 mM，缓冲液100 mM（甘氨酸-HCl pH 2.0；柠檬酸-Na₂HPO₄ pH 3.0–7.0；Tris-HCl pH 7.0–9.0；甘氨酸-NaOH pH 9.0–12.0）；最适温度：20–90 °C；pH稳定性：pH 2.0–12.0，30 °C，1 h；热稳定性：40/50/60/70 °C，100 mM Tris-HCl（pH 9.0）；动力学：70 °C，ABTS 0.5–4 mM（pH 4.0）、SGZ 0.05–0.1 mM（pH 6.0）、2,6-DMP 0.1–1.5 mM（pH 6.0）；分析软件：GraphPad Prism 10；重复次数：3次
2.5 分子对接
AFB1和ZEN的化学结构来自PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）。AnXynB-SoLac融合蛋白的三维结构由AlphaFold 3（https://alphafoldserver.com/）建模预测——该工具代表当前结构预测领域的最先进水平，可提供接近实验精度的模型——并通过Ramachandran图评估验证。
【数据】结构来源：PubChem；结构预测：AlphaFold 3；验证方式：Ramachandran图
研究结果
3.1 AnXynB-SoLac融合蛋白在毕赤酵母中的异源表达
多项研究已报道漆酶在AFB1和ZEN转化中的有效性。真菌漆酶因具有高氧化还原电位，是霉菌毒素脱除的理想酶资源。在毕赤酵母中异源表达实现漆酶的大规模制备，是推动实际应用的有效途径。来源于S. ochraceum的真菌漆酶（SoLac）作为适合生物技术过程的模型，被选用于毕赤酵母X33中的异源表达。氨基酸序列分析显示，SoLac含17个氨基酸的信号肽序列，其后是501个氨基酸的成熟漆酶序列。基于比对研究，该蛋白序列与不同物种来源的漆酶表现出显著相似性。结构分析在SoLac中鉴定出四个保守的铜氧化酶结构域（图1A），这是漆酶型酶的典型特征。此外，SoLac在保守半胱氨酸（Cys472）下游第10个氨基酸位置含有一个苯丙氨酸残基（Phe482），该苯丙氨酸作为1型铜中心的轴向配体，是高氧化还原电位真菌漆酶的特征（图1B）。
Solac基因序列经毕赤酵母密码子优化后，插入pPICZα(A)质粒形成pPICZα(A)-Solac。随后将该载体转化至毕赤酵母X33细胞，构建重组菌株P. pastoris/SoLac。然而，在10 mL培养管中发酵后，P. pastoris/SoLac发酵上清液中检测不到漆酶活性，SDS-PAGE也未观察到SoLac蛋白条带。来自Peniophora sp.、A. oryzae和T. versicolor的真菌漆酶已实现毕赤酵母中的异源分泌表达。鉴于毕赤酵母对不同漆酶在翻译后加工过程中的处理效率存在差异，SoLac表达失败可能归因于分泌不成功、胞内积累或表达水平过低而无法检测。
木聚糖酶近年来在生物技术领域受到关注，被用作融合标签以促进毕赤酵母中异源蛋白的高水平生产。为实现SoLac在毕赤酵母中的高效异源表达，本研究采用融合表达策略。选择来源于A. niger的木聚糖酶AnXynB作为融合伴侣——该酶已报道可在毕赤酵母中表达，具有广泛的pH和温度适应性、在不同pH条件下的强稳定性以及高效的催化活性。然而，两个功能结构域的直接融合可能导致蛋白质错误折叠和酶活降低。使用linker连接蛋白结构域是提高表达水平和维持分子稳定性的有效策略。这些优势主要源于linker的三维灵活性，为每个结构域的正确折叠和保持各自活性提供了足够的空间自由度。许多天然木聚糖酶由碳水化合物结合模块（CBM）和催化结构域组成，二者通过linker连接，分别执行底物结合和催化功能。为确保木聚糖酶和漆酶蛋白的正确折叠与活性，在AnXynB和SoLac之间引入了来源于Bacillus sp. 41M-1木聚糖酶催化结构域与CBM之间天然序列的linker（SASSGGTTPTTT），而天然AnXynB不含CBM。构建pPICZα(A)-AnxynB-Solac载体，表达N端延伸含有去除18个氨基酸信号肽的AnXynB的SoLac衍生蛋白。重组质粒线性化后转化至毕赤酵母X33，获得P. pastoris/AnXynB-SoLac菌株。在10 mL试管中诱导48 h后，融合酶达到93.0 U/L的峰值漆酶酶活。发酵上清液的SDS-PAGE分析显示一条分子量约80 kDa的清晰蛋白条带。这些结果表明SoLac在毕赤酵母中成功表达并有效分泌。
已报道多种策略可提高真菌漆酶在毕赤酵母中的表达水平，包括启动子和分泌信号肽筛选、密码子优化及培养条件优化等。此外，融合表达也是一种可行途径。由于木聚糖酶在毕赤酵母中高表达，已被融合至多种难表达蛋白，如生长抑素和胰岛素样生长因子-1。通过在漆酶N端引入源自Volvariella volvacea木聚糖酶的10残基肽段标签，也实现了漆酶在毕赤酵母中的表达。这些融合策略在保持生物活性的同时大幅提高了表达水平。这可能是因为额外的N端木聚糖酶有助于毕赤酵母中异源蛋白的正确翻译后加工。此外，木聚糖酶已被普遍用作饲料添加剂，可促进饲料中植物细胞壁内木聚糖的分解、改变肠道微生物群落、提高饲料转化效率。因此可以推断，漆酶-木聚糖酶融合蛋白具有双重功能。
【数据】SoLac信号肽：17个氨基酸；成熟漆酶：501个氨基酸；保守结构域：4个铜氧化酶结构域；轴向配体：Phe482（Cys472下游第10位）；单独表达SoLac：检测不到酶活；AnXynB-SoLac融合表达：93.0 U/L（10 mL试管，48 h）；蛋白分子量：约80 kDa
3.2 15-L发酵罐中AnXynB-SoLac融合蛋白的生产
为提升SoLac产量，在15-L发酵罐中对P. pastoris/AnXynB-SoLac菌株进行补料分批发酵。甘油耗尽后，以补料培养基流加6 h，湿细胞重量达到163.8 g/L。随后诱导重组菌株分泌融合蛋白。在甲醇诱导阶段，发酵液中湿细胞重量及漆酶和木聚糖酶酶活均持续上升（图2A）。诱导8 d后湿细胞重量达到峰值442.7 g/L。诱导6 d时测得漆酶酶活5,947.8 U/L、木聚糖酶酶活92.7 U/mL，至第9天分别进一步升至最高水平9,102.0 U/L和150.3 U/mL（图2A）。此外，木聚糖酶和漆酶的酶活呈强正线性相关（R² = 0.9792），证明AnXynB和SoLac的有效融合表达。
多项研究报道了补料分批发酵条件下真菌漆酶在毕赤酵母中的异源表达。例如，来源于Moniliophthora roreri的漆酶在3-L发酵罐中产生281,000 U/L的峰值体积酶活；T. trogii来源基因在毕赤酵母中于2-L发酵罐达到2,520 U/L；Coriolopsis trogii漆酶在毕赤酵母中于30-L发酵罐经4.5 d发酵达到720 U/L。这些表达产量的差异可能归因于多种因素，如酶的催化特性、分泌信号的差异、密码子适应性、基因拷贝数和发酵优化等。AnXynB-SoLac融合蛋白通过离子交换层析从发酵液中纯化获得。
【数据】发酵罐规模：15-L；甘油耗尽后补料时间：6 h；诱导前湿细胞重量：163.8 g/L；峰值湿细胞重量：442.7 g/L（诱导8 d）；第6天酶活：漆酶5,947.8 U/L、木聚糖酶92.7 U/mL；第9天峰值酶活：漆酶9,102.0 U/L、木聚糖酶150.3 U/mL；线性相关R² = 0.9792；文献对比：M. roreri漆酶281,000 U/L（3-L罐）、T. trogii漆酶2,520 U/L（2-L罐）、C. trogii漆酶720 U/L（30-L罐，4.5 d）
3.3 重组漆酶的生化特性
对纯化的AnXynB-SoLac融合蛋白中的漆酶组分进行生化特性表征。以ABTS为底物时，漆酶在pH 2.5左右表现出最高活性；以SGZ为底物时最适pH约为5.5；以2,6-DMP为底物时最适pH约为6.0（图3A）。温度活性曲线显示，以ABTS为底物时，漆酶活性在70 °C附近达到峰值（图3B）。pH稳定性实验表明，该漆酶在pH 5.0至12.0范围内孵育1 h后仍能保持较高残余活性。热稳定性方面，在40 °C和50 °C下处理较长时间后酶活损失有限，但在60 °C和70 °C下酶活迅速下降。动力学参数测定结果显示，以ABTS为底物时K_m值为0.14 mM，以SGZ为底物时K_m值为0.02 mM，以2,6-DMP为底物时K_m值为0.18 mM。
【数据】最适pH：ABTS约pH 2.5、SGZ约pH 5.5、2,6-DMP约pH 6.0；最适温度：ABTS底物约70 °C；pH稳定性：pH 5.0–12.0孵育1 h保持高残余活性；热稳定性：40/50 °C稳定，60/70 °C快速失活；K_m值：ABTS 0.14 mM、SGZ 0.02 mM、2,6-DMP 0.18 mM
3.4 分子对接模拟
利用AlphaFold 3预测了AnXynB-SoLac融合蛋白的三维结构（图4A）。结构显示漆酶结构域、木聚糖酶结构域和linker分别以紫色、绿色和橙色标示。分子对接模拟预测了AFB1和ZEN与AnXynB-SoLac融合蛋白的结合模式。对接结果表明，SoLac可能直接与AFB1和ZEN相互作用。
【数据】结构预测：AlphaFold 3；对接分子：AFB1、ZEN；结合方式：SoLac与霉菌毒素直接相互作用
3.5 AFB1和ZEN转化条件的优化
在无介体条件下，对AnXynB-SoLac融合蛋白催化AFB1和ZEN转化的温度和pH条件进行优化。温度优化实验在pH 7.0的100 mM Tris-HCl缓冲液中进行，AFB1和ZEN浓度均为10 mg/L，融合蛋白用量6,000 U/L，反应时间20 h。结果显示，在50 °C条件下AFB1和ZEN的转化率最高（图5A）。pH优化实验在50 °C下进行，pH范围4.0至9.0。结果表明，在pH 7.0时AFB1和ZEN的转化效率最佳（图5B）。在优化条件下（50 °C、pH 7.0、20 h），AFB1的转化率达到71.0%，ZEN的转化率达到72.9%。
【数据】反应体系：10 mg/L AFB1/ZEN + 6,000 U/L融合蛋白 + 100 mM Tris-HCl（pH 7.0）、50 °C、20 h；最适温度：50 °C；最适pH：7.0；AFB1转化率：71.0%；ZEN转化率：72.9%
3.6 金属离子对AFB1和ZEN转化的影响
在100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）中，分别加入10 mM的不同金属离子，与AFB1和ZEN（各10 mg/mL）及AnXynB-SoLac融合蛋白（6,000 U/L）在50 °C下共孵育10 h，评估金属离子对转化效率的影响。结果显示，不同金属离子对AFB1和ZEN的转化产生不同程度的影响（图6）。
【数据】金属离子浓度：10 mM；AFB1/ZEN浓度：10 mg/mL；融合蛋白：6,000 U/L；缓冲液：100 mM Tris-HCl（pH 7.0）；温度：50 °C；时间：10 h
3.7 AFB1和ZEN的转化产物鉴定
通过LC-MS/MS分析鉴定了AFB1和ZEN的主要转化产物。AFB1的主要转化产物为AFQ1，ZEN的主要转化产物为13-OH-ZEN-醌、15-OH-ZEN和ZOM-1。图7展示了AnXynB-SoLac融合蛋白催化AFB1（图7A）和ZEN（图7B）转化的反应路径。
【数据】AFB1主要产物：AFQ1；ZEN主要产物：13-OH-ZEN-醌、15-OH-ZEN、ZOM-1
3.8 转化产物的细胞毒性评估
利用HepG2细胞评估了AnXynB-SoLac融合蛋白转化产物的细胞毒性。AFB1转化体系（含或不含AFB1）在50 °C下孵育24 h后处理HepG2细胞。结果显示，经AnXynB-SoLac融合蛋白转化后，产物的细胞毒性显著低于未转化的AFB1（图8A）。同样，ZEN转化产物的毒性也显著降低（图8B）。这些结果表明，AnXynB-SoLac融合蛋白介导的转化过程有效降低了AFB1和ZEN的毒性。
【数据】细胞系：HepG2；处理条件：50 °C、24 h；结果：转化产物毒性显著低于未转化霉菌毒素
3.9 真实饲料原料中霉菌毒素的转化
将AnXynB-SoLac融合蛋白应用于真实饲料原料（豆粕和玉米粉）中的AFB1和ZEN转化。在含有豆粕和玉米粉的反应体系中，AnXynB-SoLac融合蛋白对AFB1和ZEN均表现出有效的转化率（图9）。这表明该融合蛋白在实际饲料原料基质中具有良好的应用潜力。
【数据】原料：豆粕、玉米粉；结果：AFB1和ZEN均被有效转化（具体数值原文未详述）
讨论与解读
本研究通过将难以异源表达的真菌漆酶SoLac与黑曲霉木聚糖酶AnXynB融合，成功实现了该漆酶在毕赤酵母X33中的高水平分泌表达。单独表达SoLac时检测不到酶活，而融合表达后漆酶酶活达到9,102.0 U/L（15-L发酵罐），木聚糖酶酶活达150.3 U/mL，且两种酶活呈强正相关（R² = 0.9792），证明融合策略的有效性。融合蛋白在无介体条件下可直接转化AFB1和ZEN，50 °C、pH 7.0、20 h条件下转化率分别为71.0%和72.9%，主要产物为AFQ1、13-OH-ZEN-醌、15-OH-ZEN和ZOM-1，产物毒性显著降低。该融合蛋白在真实饲料原料（豆粕和玉米粉）中同样能有效转化AFB1和ZEN。
编译者解读： 本研究巧妙利用木聚糖酶融合标签解决了真菌漆酶在毕赤酵母中"表达难"的瓶颈——单一表达检测不到酶活，融合后达到近万单位水平，这一策略对其它难表达氧化还原酶具有直接借鉴价值。无介体条件下的霉菌毒素直接转化避免了介体添加带来的成本与安全性问题，值得关注。不过，虽然转化产物毒性显著降低，但反应时间长达20 h，未来若能在酶工程改造（如提高催化效率）和反应器设计上进一步优化，将更有助于推动该技术从实验室走向工业化应用。
参考来源
Cui L. Fusion strategy enables high-level expression of fungal laccase in Pichia pastoris for efficient detoxification of aflatoxin B1 and zearalenone. Applied Food Research, 2025. DOI: 10.1016/j.afres.2025.101475
DOI: 10.1016/j.afres.2025.101475