来源：Optimization of heterologous production of Bacillus ligniniphilus L1 laccase in Escherichia coli through statistical design of experiments（Microbiological Research）| 编译：DNA Lab Space
导读
漆酶作为一种绿色生物催化剂，在生物技术、生物修复和工业领域具有广泛应用前景。本研究针对来源于Bacillus ligniniphilus L1的耐温耐pH漆酶（L1-lacc）在大肠杆菌中产量低的问题，综合运用单因素实验（OFAT）、Plackett-Burman设计（PBD）、响应面法（RSM）和正交设计，系统优化了培养基组分和发酵工艺参数。最终实现漆酶产量7倍提升，24小时内体积酶活达到5.94 U/mL，为木质素高值化利用提供了经济高效的酶生产系统。
研究背景
漆酶（EC 1.10.3.2）属于蓝色氧化酶家族，能够催化酚类和非酚类底物氧化，同时将分子氧还原为水。漆酶及其类似的多铜氧化还原酶广泛存在于真菌、细菌、昆虫和植物中，在合成代谢和分解代谢反应中发挥多种功能。借助介体系统，漆酶具有广泛的底物谱，已在纺织、纸浆造纸、生物质转化、生物技术、制药和生物修复等高价值领域作为"绿色"生物催化剂得到应用。近年来，漆酶的工业应用已扩展到沼气与生物乙醇生产、生物燃料电池、生物活性天然产物、生物传感器、临床应用等领域。
真菌漆酶具有较高的氧化还原电位（500–800 mV），相比细菌漆酶（340–490 mV）应用范围更广。然而，真菌漆酶受限于生长缓慢、产量低、纯化困难和生产成本高等问题。研究者前期已从Bacillus ligniniphilus L1中克隆获得一种温度和pH稳定性良好的漆酶L1-lacc，该酶在木质素氧化和生物乙醇生产中的脱木质素方面表现出显著活性。但L1-lacc在原始菌株和异源系统中的酶产量均较低。本研究旨在通过统计实验设计优化重组大肠杆菌BL21菌株的培养基组分和发酵参数，实现L1-lacc的高水平生产。
研究方法
2.1 化学试剂、菌株、载体与培养基
所有化学试剂均为分析纯或更高纯度，除非另有说明，均购自国药集团化学试剂（中国上海）和Sigma-Aldrich。异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）和2,2-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）购自上海生工生物工程技术有限公司（中国上海）。引物由苏州Synbio Technologies合成。L1-lacc的来源菌株Bacillus ligniniphilus L1 DSM 26145T常规培养于2216E培养基（5 g蛋白胨、1 g酵母提取物、34 g NaCl、0.1 g Fe3(PO4)4，溶于1 L海水中），pH 9.0。宿主菌株E. coli BL21（DE3）及重组菌E. coli-L1-lacc常规培养于液体Luria-Bertani培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，pH 7.0）或添加50 μg mL⁻¹卡那霉素的LB琼脂平板上。
【数据】培养基：2216E（pH 9.0）/ LB（pH 7.0）；抗生素：50 μg mL⁻¹卡那霉素；菌株：Bacillus ligniniphilus L1 DSM 26145T、E. coli BL21 (DE3)
2.2 L1-lacc在大肠杆菌中的异源表达
异源L1-lacc表达菌株为携带L1-lacc基因的E. coli BL21 (DE3)，该菌株在前期研究中构建（Zhu et al., 2020b）。简言之，以Bacillus ligniniphilus L1 DSM 26145T的L1-lacc开放阅读框（1515 bp，GenBank No. WP-017726125.1）为模板，合成密码子优化基因（Synbio Tech，中国苏州）。将该基因插入IPTG诱导型pET-28a(+)载体的Nco1/Xho1位点，并携带C端His6标签。构建的pET-28(a)-L1-lacc载体通过热激法按标准方案转化至E. coli BL21 (DE3)，在含50 μg mL⁻¹卡那霉素的平板上筛选。重组子通过菌落PCR筛选，插入序列经DNA测序验证。L1-lacc过表达菌株命名为E. coli-L1-lacc。在前期酶学研究中，重组L1-lacc成功表达为60 kDa的胞内可溶性蛋白，通过C端6xHis标签纯化，并以ABTS、愈创木酚、2,6-二甲氧基苯酚（2,6-DMP）和丁香醛连氮（SGZ）为底物测定其生化性质和活性（Zhu et al., 2020b）。纯化酶以ABTS为底物的比活力为201.57 ± 0.5 U mg⁻¹（Zhu et al., 2020b）。本研究中使用含重组酶的E. coli-L1-lacc澄清裂解液进行所有测定。
【数据】基因：L1-lacc ORF 1515 bp；载体：pET-28a(+)；表达宿主：E. coli BL21 (DE3)；蛋白大小：60 kDa；比活力：201.57 ± 0.5 U mg⁻¹（ABTS底物）
2.3 培养制备与酶提取
重组菌株E. coli-L1-lacc划线接种于含50 μg mL⁻¹卡那霉素的LB琼脂平板，37°C培养12 h。挑取单菌落接种于5 mL含卡那霉素的LB培养基，37°C、180 rpm振荡培养过夜。以该过夜预培养物按1%（v/v）接种量接种基础发酵培养基，用于生物量积累和异源L1-lacc表达。初始培养在500 mL锥形瓶中进行，每瓶含100 mL培养基。初始基础培养基组成为：20 g/L玉米浆、10 g/L淀粉、20 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl、2 g/L MgSO4、0.1 g/L KH2PO4、0.1 g/L K2HPO4，pH 7.0，添加50 μg mL⁻¹卡那霉素。接种后的培养基在37°C、180 rpm条件下培养至OD600达到0.6，然后冷却至25°C，加入0.5 mM IPTG诱导。随后细胞在25°C、180 rpm条件下培养24 h。之后通过离心（8000 rpm，10 min，4°C）收集细胞，沉淀用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤两次。细胞重悬于10 mL PBS中，冰浴超声破碎30 min。通过离心（12,000 rpm，30 min，4°C）去除细胞碎片，所得粗蛋白裂解液用于漆酶活性测定以确定漆酶产量。
【数据】接种量：1%（v/v）；培养容器：500 mL锥形瓶/100 mL培养基；诱导剂：0.5 mM IPTG；诱导时机：OD600=0.6；诱导温度：25°C；诱导时间：24 h；转速：180 rpm；离心：8000 rpm/10 min/4°C；破碎：冰浴超声30 min；二次离心：12,000 rpm/30 min/4°C
2.4 漆酶产量的测定
以2,2′-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）为底物检测漆酶活性。ABTS溶液配制方法：将300 μL 1 mM ABTS溶液加入2600 μL 50 mM醋酸钠-醋酸缓冲液（pH 4.5）中。混合液在37°C水浴中孵育5 min，用于紫外分光光度计OD420调零。随后，在1 mL石英比色皿中加入970 μL ABTS混合液和30 μL漆酶溶液（用水稀释10倍）。在1 min时读取吸光度值，每个测定重复三次。漆酶产量计算公式如下（2.1）：
Y = N × Vtotal × ∆OD420 × 10⁶ / (Venzyme × 36000 × T × L) × (Vextract / Vbroth)
其中，Y表示1 mL发酵培养基中重组E. coli-L1-lacc的漆酶产量（U/mL）；N为漆酶提取液的稀释倍数；Vtotal为漆酶测定反应总体积（mL）；Venzyme为加入反应体系的漆酶提取液体积（mL）；∆OD420为反应液在420 nm处T时间内的吸光度增加值；36000为ABTS在420 nm处的摩尔消光系数（L mol⁻¹cm⁻¹）；T为反应时间（min）；L为比色皿光程（cm）；Vbroth为发酵液体积（mL）；Vextract为漆酶澄清提取液体积（mL）。1个漆酶单位定义为每分钟转化1 μmol ABTS所需的酶量，漆酶产量以每毫升培养基的酶单位（U/mL）表示。
【数据】底物：ABTS（1 mM）；缓冲液：50 mM醋酸钠-醋酸缓冲液（pH 4.5）；测定波长：420 nm；反应温度：37°C；反应时间：1 min；稀释倍数：10倍
2.5 培养基组分的单因素（OFAT）筛选
#### 2.5.1 氮源及浓度
以基础发酵培养基为起点，筛选6种氮源（玉米浆、蛋白胨、酵母提取物、(NH4)2SO4、NH4Cl和尿素），每种在培养基中添加20 g/L。设置6组平行发酵，每组三次重复，以氮源为唯一变量。菌株E. coli-L1-lacc按2.3节所述程序培养，以24 h漆酶产量为响应值。随后，选择表现最好的3种氮源制备复合混合物（每两种混合，比例为1:1、2:1或1:2，wt/wt）。这些复合氮源混合物同样以20 g/L的添加量筛选其对漆酶生产的影响。最后，将表现最佳的复合氮源混合物按5个水平（10、15、20、25和30 g/L）筛选培养基中的最佳浓度。
【数据】氮源种类：6种（玉米浆、蛋白胨、酵母提取物、(NH4)2SO4、NH4Cl、尿素）；筛选浓度：20 g/L；复合比例：1:1、2:1、1:2（wt/wt）；浓度水平：10、15、20、25、30 g/L
#### 2.5.2 碳源及浓度
使用上述筛选得到的最佳复合氮源及浓度，以碳源为唯一变量进行筛选。筛选5种碳源（淀粉、葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖），每种在培养基中添加10 g/L。选择表现最佳的碳源，按5个水平（5、10、15、20、25 g/L）筛选最佳浓度。
【数据】碳源种类：5种（淀粉、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖）；筛选浓度：10 g/L；浓度水平：5、10、15、20、25 g/L
#### 2.5.3 无机盐种类及浓度
基于上述筛选的最佳组分，筛选4种无机盐，浓度分别为：0.1 g/L KH2PO4、0.1 g/L K2HPO4、2 g/L MgSO4和5 g/L NaCl。由于K2HPO4、MgSO4和NaCl对漆酶效价影响较大，选择这三种盐进行下一步筛选。三种盐按3个水平筛选最佳浓度：K2HPO4（0.05、0.1、0.15 g/L）、MgSO4（0.5、1、2 g/L）和NaCl（5、7.5、10 g/L）。
【数据】无机盐：KH2PO4（0.1 g/L）、K2HPO4（0.1 g/L）、MgSO4（2 g/L）、NaCl（5 g/L）；浓度水平：K2HPO4 0.05–0.15 g/L、MgSO4 0.5–2 g/L、NaCl 5–10 g/L
2.6 基于统计实验设计的培养基优化
#### 2.6.1 Plackett-Burman设计（PBD）筛选显著因素
采用Plackett-Burman设计（PBD）筛选对漆酶产量影响最显著的因素。基于上述OFAT筛选结果，选择5个培养基变量进行PBD筛选，使用Design-Expert 12软件设计12组实验。5个因素（A：复合氮源、B：葡萄糖、C：K2HPO4、D：MgSO4和E：NaCl）在−1（低水平）和+1（高水平）两个水平进行筛选。
【数据】实验设计：PBD，12组实验；因素数：5个；水平：−1/+1
研究结果
3.1 L1-lacc的异源表达及基础培养基中的产量
重组菌株E. coli-L1-lacc在前期研究中已完成设计、表达、纯化和表征（Zhu et al., 2020b）。尽管在该前期研究中L1-lacc纯化后比活力达到201.57 U mg⁻¹（以ABTS为底物），但每升培养基可获得的总酶活（产量）仍然较低。本研究重建了载体和重组菌株，旨在通过优化培养基和工艺条件提高酶产量。由于纯化后产量较低，且本研究采用的优化设计需要大量的实验批次，因此所有活性测定均使用澄清细胞裂解液，因为这些裂解液也具有较高活性。重组L1-lacc在E. coli-L1-lacc中成功表达为可溶性蛋白，如图1 SDS-PAGE所示（总细菌裂解液和可溶性组分）。L1-lacc的理论计算分子量为57.8 kDa，但蛋白洗脱位置略高，约为65 kDa，这很可能是由于存在小的His标签。
溶解度增强标签如麦芽糖结合蛋白（MBP）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）通常用于增强目标蛋白在大肠杆菌中的溶解度。然而，在构建阶段将MBP和GST等大蛋白融合到L1-lacc上并未获得明显益处，但融合C端6xHis标签后观察到产量提高。尽管His标签不被认为是溶解度增强标签，也未被广泛报道可增强溶解度（Bernier et al., 2018），但它对L1-lacc产量更为有利。这种益处更可能是蛋白表达量增加和/或细胞生长改善的结果，而非对溶解度的直接影响，这与之前的观察一致（Woestenenk et al., 2004）。L1-lacc在可溶性组分中的含量高于不溶性组分，研究者试图通过优化培养基和发酵参数来提高活性产量。在初始未优化的基础培养基和发酵条件下，重组E. coli-L1-lacc生长至OD600为1.5，24 h内最大漆酶产量为0.84 U/mL培养基。
【数据】理论分子量：57.8 kDa；SDS-PAGE表观分子量：65 kDa；基础培养基产量：0.84 U/mL（24 h）；OD600：1.5
3.2 培养基组分的OFAT筛选
#### 3.2.1 氮源及浓度对漆酶产量的影响
培养基组分对发酵反应中目标蛋白和代谢产物的生产具有巨大影响，同时也是生产成本中最高的部分（Ardila-Leal et al., 2020; Osma et al., 2011）。研究者筛选了氮源、碳源和无机盐来源对重组L1-lacc产量的影响（图2）。氮源筛选结果显示，有机氮源（玉米浆、蛋白胨和酵母提取物）对生物量积累（以OD600计）和漆酶生产均有显著促进作用（图2a）。另一方面，无机氮源和尿素在20 g/L时对生物量和漆酶产量产生负面影响。虽然酵母提取物给出最高漆酶产量（1.91 ± 0.068 U/mL），但玉米浆（CSL）和蛋白胨也实现了约2倍于对照的产量提升，因此研究者推测任意两种来源的组合可能对产量产生协同效应。不同组合的复合氮源结果见表1。最佳漆酶产量（2.23 ± 0.034 U/mL）由蛋白胨:酵母提取物混合物（2:1，wt/wt）实现（以下简称复合氮源）。复合氮源最佳浓度筛选显示，15 g/L时漆酶产量最高（图2b）。氮对微生物生长至关重要，因为氨基酸、DNA、RNA、ATP和其他生物分子的合成均需要氮。在同源和异源发酵中，培养基氮源的优化已在漆酶效价方面取得了显著成果（Duran-Sequeda et al., 2021; Jafari et al., 2017）。
【数据】最佳氮源：酵母提取物（1.91 ± 0.068 U/mL）；最佳复合氮源：蛋白胨:酵母提取物=2:1（2.23 ± 0.034 U/mL）；最佳浓度：15 g/L
#### 3.2.2 碳源及浓度对漆酶产量的影响
在大多数微生物生长培养基配方中，碳源贡献了最高的成本（Osma et al., 2011）。碳不仅是微生物结构的基本元素，还为生长和其他细胞过程提供能量。微生物对碳源非常敏感，具有内在的摄取、利用和分配调控机制（Wang et al., 2019）。毫不意外，碳和氮是微生物培养优化中的常见靶标，通常能带来显著收益（Jafari et al., 2017; Schneider et al., 2018）。研究者筛选了5种碳源对菌株E. coli-L1-lacc漆酶生产的影响，结果显示葡萄糖给出最高产量（图2c）。与CK样品相比，葡萄糖实现的最大产量提升（1.22倍）低于有机氮源实现的提升。这在单因素设计中是可以预期的，因为用于葡萄糖筛选的培养基已经在氮含量方面进行了优化。接下来，在5至25 g/L范围内筛选葡萄糖浓度的影响，结果显示产量在20 g/L之前持续增加，超过该浓度后出现负面影响（图2d）。较高葡萄糖浓度下的抑制效应可归因于生长培养基渗透压升高，这可能对菌株生长产生负面影响，表现为OD600相应降低。葡萄糖在其他靶向漆酶生产的发酵中被确定是需要优化的关键因素（Ardila-Leal et al., 2019; Jafari et al., 2017），尽管一些研究考虑的是碳氮比（C:N）而非单独浓度（Duran-Sequeda et al., 2021; Schneider et al., 2018）。
【数据】最佳碳源：葡萄糖；最大产量提升：1.22倍；最佳浓度：20 g/L；浓度范围：5–25 g/L
#### 3.2.3 无机盐种类及浓度对漆酶产量的影响
无机盐中的微量元素在微生物的生长和代谢中发挥重要作用。在测试的元素中，K2HPO4、MgSO4和NaCl对漆酶产量和生长有积极影响，而KH2PO4对漆酶产量没有影响，甚至导致OD600低于未添加微量元素的培养基（图2e）。选择三种具有促进生长和漆酶产量作用的微量矿物质进行浓度测试，确定其最佳浓度分别为0.1 g/L（K2HPO4）、1.0 g/L（MgSO4）和7.5 g/L（NaCl），这些浓度下漆酶产量几乎相等（图2f）。
【数据】最佳浓度：K2HPO4 0.1 g/L、MgSO4 1.0 g/L、NaCl 7.5 g/L
3.3 培养基组分的统计优化
#### 3.3.1 Plackett-Burman设计鉴定影响漆酶效价的关键培养基因素
统计DOE方法在优化研究中极为有效，因为其能够以最少的实验次数对大量因素组合进行全面测试。在OFAT筛选培养基组分后，使用PBD鉴定影响漆酶效价的最主要因素。将5个因素，即（A）复合氮源、（B）葡萄糖、（C）K2HPO4、（D）MgSO4和（E）NaCl，按补充表1a所示的浓度水平设计为Plackett-Burman矩阵，共12组实验，见表2a。表2a结果显示，第11组实验中漆酶产量最佳。数据拟合成如下一阶方程：
漆酶产量 = 2615.73 + 0.842A + 0.382B + 0.347C − 0.067D + 0.059E
其中A、B、C、D和E分别为复合氮源、葡萄糖、K2HPO4、MgSO4和NaCl浓度的系数。对模型的充分性进行了检验，通过ANOVA和Fischer检验鉴定具有统计学显著性的因素。方差分析（表3）显示模型显著（p = 0.004），模型F值为12.46。
【数据】PBD实验次数：12；模型p值：0.004；模型F值：12.46
讨论与解读
本研究通过统计优化策略显著提高了重组细菌漆酶L1-lacc在大肠杆菌宿主中的产量。首先使用单因素筛选，随后采用Plackett-Burman实验设计鉴定对L1-lacc产量影响最大的因素。最终优化设计使用响应面法（Box-Behnken设计）或正交实验设计确定漆酶产量最高的组合。最终优化培养基组成为：复合氮源（蛋白胨:酵母提取物，2:1，w/w）15.6 g/L、葡萄糖21.5 g/L、K2HPO4 0.15 g/L、MgSO4 1 g/L、NaCl 7.5 g/L。最终优化工艺参数为：IPTG浓度1 mM、诱导OD600 0.6、发酵温度20°C、发酵时间24 h、接种量5%（v/v）、装液量300 mL/500 mL锥形瓶、初始pH 7.0、转速180 rpm。与未优化培养基和基础发酵工艺参数相比，本研究的统计优化使L1-lacc产量提升7倍，摇瓶条件下24 h达到5.94 ± 0.031 U/mL。培养基组分的优化使得以最少的用量实现最大产量，并排除了不能提高产量的多余成分。
【数据】最终培养基：复合氮源15.6 g/L、葡萄糖21.5 g/L、K2HPO4 0.15 g/L、MgSO4 1 g/L、NaCl 7.5 g/L；最终工艺：IPTG 1 mM、诱导OD600 0.6、温度20°C、时间24 h、接种量5%、装液量300 mL/500 mL、pH 7.0、转速180 rpm；最终产量：5.94 ± 0.031 U/mL；提升倍数：7倍
编译者解读
本研究展示了一条清晰的合成生物学优化路径：从"基因—载体—宿主"的构建出发，将优化重心放在培养基和工艺参数的统计设计上。OFAT+PBD+RSM/正交设计的递进策略值得借鉴——先用单因素锁定方向，再用PBD降维，最后用响应面精调，每一步都有数据支撑，避免了盲目试错。7倍产量提升的幅度在异源酶生产中相当可观，但需注意该结果是在摇瓶条件下获得的，放大到发酵罐时可能面临传氧和剪切力等新问题。此外，使用粗酶液测定活性虽然便于高通量筛选，但最终应用仍需评估纯化后的比活力是否保持。整体而言，该工作为细菌漆酶的工业化生产提供了扎实的工艺基础。
参考来源
Mutanda, I. (2023). Optimization of heterologous production of Bacillus ligniniphilus L1 laccase in Escherichia coli through statistical design of experiments. Microbiological Research, 2023. DOI: 10.1016/j.micres.2023.127416
DOI: 10.1016/j.micres.2023.127416