来源：Heterologous laccase from the marine environment: Purification, characterization, and degradation of synthetic dyes（Biocatalysis and Agricultural Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space
导读
海洋真菌Peniophora sp. CBMAI 1063是漆酶的高产菌株。本研究将其漆酶基因Lac1在毕赤酵母中异源表达，经纯化后系统表征了该酶的生化特性，并评估了其对多种合成染料的脱色降解能力。结果显示，Lac1在低酶浓度下即可高效降解靛蓝胭脂红（2小时脱色率93%）和活性黑5（降解率65%），展现出海洋来源漆酶在生物催化修复领域的应用潜力。
研究背景
农业工业、化学和制药行业使用的化合物导致外源性物质释放到水生环境中，如农药、激素、抗生素和合成染料。合成有机染料即使在低浓度下也会对水体产生强烈影响，具有高毒性和难降解性。纺织工业是合成染料的最大消费部门，其废水富含染色、固色、印花和整理过程中使用的金属离子，形成高盐环境。虽然生物修复策略是物理化学过程的可持续替代方案，但盐度和金属离子的存在会抑制微生物生长，对生物修复效率产生负面影响。漆酶作为多铜氧化酶，能够氧化多种酚类和非酚类化合物，同时将分子氧还原为水，是生物修复过程中可行的酶学工具。然而，与陆地环境来源的漆酶相比，海洋来源漆酶的研究相对匮乏。
研究方法
菌株、培养基组成及Lac1表达
本研究使用毕赤酵母NRRL Y-11430菌株的pGAP_αA1变体，用于表达源自海洋担子菌Peniophora sp. CBMAI 1063的Lac1基因。预培养通过将新鲜平板上毕赤酵母pGAP_αA1的单菌落转移至含50 mL BMGY 1%培养基（100 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0）、1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34%酵母氮碱、4 × 10⁻⁵%生物素和1%甘油）的250 mL锥形瓶中进行。锥形瓶在30°C、150 RPM条件下培养24小时。随后，将20 mL预培养物转移至含200 mL改良BMGY 2%培养基（100 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0）、1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34%酵母氮碱、4 × 10⁻⁵%生物素和2%甘油）并补充10 μM CuSO₄的1 L锥形瓶中。锥形瓶在18°C、150 RPM条件下培养72小时以表达Lac1。表达阶段结束后，将培养物转移至50 mL Falcon管中，在10,000×g、4°C条件下离心10分钟以分离生物量。在纯化步骤之前，用KOH（10 M储备液）将上清液pH调至7.5，并过滤（孔径：0.22 μm）以去除残留细胞或细胞碎片。
【数据】菌株：毕赤酵母NRRL Y-11430（pGAP_αA1变体）；培养基：BMGY 1%和2%；CuSO₄浓度：10 μM；温度：30°C（预培养）/18°C（表达）；时间：24h（预培养）/72h（表达）；转速：150 RPM；离心：10,000×g、4°C、10min
漆酶纯化
使用配备5 mL HisTrap FF Crude（Cytiva，德国）柱的ÄKTA™ pure micro系统进行亲和色谱纯化Lac1。上样前，使用25 mL结合缓冲液（100 mM磷酸钾，pH 7.5，500 mM氯化钠）平衡柱。上清液上样后，用50 mL结合缓冲液洗涤柱，以完全去除宿主菌株的天然蛋白。随后，使用洗脱缓冲液（100 mM磷酸钾，pH 7.5，500 mM氯化钠，500 mM咪唑）通过咪唑梯度洗脱Lac1，监测280 nm处UV信号的增加。Lac1通常在40–80 mM咪唑浓度下被洗脱。将漆酶活性最高的组分混合，并在50 mL HiPrep 26/10柱（Cytiva，德国）中用脱盐缓冲液（100 mM磷酸钾，pH 6，10 μM CuSO₄）脱盐。纯化后的酶在液氮中冷冻，并在−80°C下储存直至使用。纯酶的浓度通过使用P-class纳米光度计（Implen，美国）分光光度法测定，考虑酶的分子量（MW）和280 nm处的消光系数（ε₂₈₀）。MW和消光系数使用ProtParam工具计算。通过12% SDS凝胶电泳确认酶纯化。
【数据】结合缓冲液：100 mM磷酸钾（pH 7.5）+ 500 mM NaCl；洗脱缓冲液：100 mM磷酸钾（pH 7.5）+ 500 mM NaCl + 500 mM咪唑；咪唑洗脱浓度：40–80 mM；脱盐缓冲液：100 mM磷酸钾（pH 6）+ 10 μM CuSO₄；储存温度：−80°C
Lac1大小测定及去糖基化分析
纯化漆酶的分子量通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳测定。样品制备时，将12 μL酶与8 μL 2.5× SDS样品缓冲液混合。混合物离心后，在95°C孵育10分钟。随后，每样品取10 μL上样至12% SDS凝胶。凝胶在Mini-PROTEAN-Tetra Cell系统（Bio-Rad）中于40 mA下电泳约1小时。为确定毕赤酵母对异源酶进行的糖基化率，使用PNGase F酶（NEB）进行去糖基化反应。初始反应含20 μg酶、1 μL 10×变性缓冲液和超纯水，终体积10 μL。变性在100°C下进行10分钟。随后，向反应中加入2 μL 10× PNGase F缓冲液、2 μL 10% NP-40、1 μL PNGase F和5 μL超纯水，使终体积为20 μL。反应在37°C孵育1小时。去糖基化效果通过SDS-PAGE凝胶观察。制备不含PNGase F的对照反应进行比较。
【数据】SDS-PAGE：12%凝胶，40 mA，约1h；变性：100°C、10min；去糖基化：PNGase F、37°C、1h；酶量：20 μg
酶动力学
使用ABTS（浓度：10–500 μM）、愈创木酚（50–5000 μM）和丁香醛连氮（1–100 μM）作为底物研究Lac1的动力学特性。缓冲液-酶混合物和底物分别在37°C预孵育7分钟。通过将底物加入缓冲液-酶混合物中启动反应。所有反应均在37°C下进行20分钟，使用各底物的最适pH。一个酶单位（U）定义为每分钟氧化1 μmol底物所需的酶量。酶活性以U L⁻¹表示，使用基于朗伯-比尔定律推导的公式计算：U L⁻¹ = ΔA · Vt · Df · 10⁶ / (t · ε · Vs · d)。其中U为酶活性（μmol min⁻¹ L⁻¹），ΔA为终末与初始吸光度之差，Vt为反应总体积（mL），Df为稀释因子，10⁶为将mol转换为μmol的校正因子，t为反应时间（min），ε为摩尔消光系数（M⁻¹ cm⁻¹或L mol⁻¹ cm⁻¹），Vs为样品体积（mL），d为光路长度（cm）。必要时，U L⁻¹按以下方式转换为U mL⁻¹：U mL⁻¹ = U L⁻¹/10³。
【数据】底物浓度范围：ABTS 10–500 μM、愈创木酚 50–5000 μM、丁香醛连氮 1–100 μM；反应条件：37°C、20min；预孵育：37°C、7min
pH和温度对Lac1活性和稳定性的影响
pH对酶活性的影响使用动力学测定（第2.4节）中的三种底物确定。pH范围为2至8，使用McIlvaine（pH 2）、柠檬酸钠（pH 3）、乙酸钠（pH 4和5）和磷酸钾（pH 6、7和8）缓冲液，终浓度均为100 mM。后续分析仅使用ABTS作为底物。在不同pH值下的稳定性分析中，酶在30°C下于pH 2至7范围内孵育1、2和12小时。孵育零时的酶活性视为100%。温度对Lac1活性的影响在100 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 3）中测定。测试温度为25、30、40、50、60和65°C。稳定性通过T50 1h分析确定，定义为酶在孵育1小时后保持50%初始活性时的温度。该分析的反应由0.27 mg mL⁻¹酶（溶于100 mM磷酸钾缓冲液，pH 6，补充10 μM CuSO₄）配制，随后在热循环仪中于25至80°C范围内孵育1小时。反应含5 μL酶、195 μL 100 mM柠檬酸钠缓冲液和0.5 mM ABTS。25°C孵育条件下的酶活性视为100%。
【数据】pH范围：2–8；缓冲液：McIlvaine/柠檬酸钠/乙酸钠/磷酸钾（100 mM）；温度范围：25–65°C（活性）/25–80°C（稳定性）；酶浓度：0.27 mg mL⁻¹；ABTS浓度：0.5 mM；T50 1h测定：1h孵育
抑制剂、金属离子、溶剂和NaCl对Lac1活性的影响
为评估不同变量对Lac1活性的影响，将酶与不同浓度（10%、20%和30% [v/v]）的有机溶剂——2-丙醇、乙腈、丙酮、苯、氯仿、二甲基亚砜（DMSO）、乙醇、己烷、甘油和甲醇——以及抑制剂（0.1、0.5和1 mM）——2-巯基乙醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、L-半胱氨酸、叠氮化钠和十二烷基硫酸钠（SDS）——共同孵育。氯化钠在10、50、100和500 mM浓度下测试。多种离子（K⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ag²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Mg²⁺和Mn²⁺）在5、10和15 mM浓度下测试。所有反应在加入底物（ABTS）前于37°C孵育7分钟。残余活性与对照（无添加物的酶反应）进行比较。
【数据】有机溶剂浓度：10/20/30%（v/v）；抑制剂浓度：0.1/0.5/1 mM；NaCl浓度：10/50/100/500 mM；金属离子浓度：5/10/15 mM；孵育：37°C、7min
Lac1及漆酶-介体系统对合成染料的脱色
Lac1的脱色能力使用购自Sigma-Aldrich（巴西）或Synth（巴西）的不同化学基团合成染料测定：刚果红（CR）、活性黑5（RB）、雷马素亮蓝R（RBBR）、靛蓝胭脂红（IC）、结晶紫（CV）和孔雀石绿（MG）。所有染料均在50 mg L⁻¹浓度下测试，CV除外，其在12.5 mg L⁻¹下测试。两种浓度均被视为环境相关浓度。
【数据】染料种类：CR、RB5、RBBR、IC、CV、MG；染料浓度：50 mg L⁻¹（CV为12.5 mg L⁻¹）
研究结果
Lac1纯化与去糖基化分析
两步纯化法被证明可有效纯化异源Lac1（图1，泳道1）。然而，脱盐后样品在SDS-PAGE凝胶上出现两条带（一条约72 kDa，另一条约76 kDa）。毕赤酵母异源表达蛋白在SDS凝胶上的双条带模式已有先前研究报道。在这些报道中，两条带均对应同一蛋白的不同蛋白型（proteoforms），经Western blot或蛋白质测序验证。异源蛋白/酶的不同蛋白型表达通常与两种蛋白型之间不同的N-糖基化模式和/或其中之一信号肽加工不当有关。为验证本研究中观察到的双条带是否对应不同N-糖基化模式的蛋白型，我们使用PNGase F酶进行去糖基化测定。如果大小差异与N-糖基化相关，则PNGase F处理后SDS凝胶上应观察到单一条带。然而，如图1（泳道2）所示，双条带模式仍然存在。随后观察到约60 kDa和约68 kDa的条带。仅考虑多肽链时，异源Lac1的预测大小为66 kDa（含α-淀粉酶-αMFΔ信号肽）和58 kDa（不含该信号肽）。因此，图1泳道2中观察到的较低条带可能对应缺乏信号肽的Lac1蛋白型，而较高条带对应N端仍附着α-淀粉酶-αMFΔ肽的蛋白型。蛋白型预测大小与SDS凝胶上对应条带之间的微小差异可能由O-糖基化引起，这也是毕赤酵母进行的修饰。最终，Lac1大小估计约为72 kDa，糖基化部分估计为19.4%（估算基于SDS凝胶泳道1中观察到的较低条带和去除信号肽后的酶多肽链）。这些结果与真菌漆酶的先前报道相符——漆酶是单体糖蛋白，平均大小在50至100 kDa之间，糖基化部分占酶总质量的10–45%。
【数据】Lac1分子量：约72 kDa；糖基化比例：19.4%；去糖基化后条带：约60/68 kDa；预测多肽大小：66 kDa（含信号肽）/58 kDa（不含信号肽）
底物特异性与酶催化效率
海洋Lac1的动力学参数（Vmax、Km和Kcat）首次被测定。为此使用了三种底物：ABTS、愈创木酚和丁香醛连氮（表1）。Lac1对丁香醛连氮的亲和力最高（Km = 0.017 mM），其次是ABTS（Km = 0.043 mM），而对愈创木酚的亲和力很低（Km = 1 mM）。丁香醛连氮衍生自丁香醛，被认为是真正的漆酶底物，因为其他多铜氧化酶（如酪氨酸酶）无法氧化该底物。Lac1以ABTS为底物获得的Km值与Fontes等人（2021）对Peniophora sp. CBMAI 1063部分纯化漆酶池的测定结果（Km = 0.047 mM）非常接近。另一方面，来自Stemphylium lucomagnoense的海洋漆酶对ABTS和丁香醛连氮表现出更高亲和力，Km值分别为0.02和0.003 mM。来自Peniophora cinerea的陆地LacA漆酶对ABTS的亲和力也高于Lac1（Km = 0.012 mM）。需要注意的是，对常用于酶学表征的底物具有更高亲和力并不一定意味着对环境中相关分子（如染料、农药和其他外源性物质）具有更高亲和力/催化效率。Lac1对丁香醛连氮的催化效率最高（6.26 × 10⁵ s⁻¹ M⁻¹），其次是ABTS（4.00 × 10⁵ s⁻¹ M⁻¹）。根据Bar-Even等人（2011）的研究，大多数酶，尤其是与次级代谢相关的酶，其Kcat/Km比率为10⁵ s⁻¹ M⁻¹。例外的是，一些漆酶可被表征为扩散限制酶，催化效率约为10⁸至10⁹ s⁻¹ M⁻¹，如真菌Pleurotus ostreatus的POXA3a和POXA3b漆酶以及Cerrena sp.的DLac漆酶。担子菌漆酶比子囊菌漆酶具有更高的氧化还原电位。这可能与催化效率有关，如海洋子囊菌Pestalotiopsis sp.和Stemphylium lucomagnoense的漆酶，其Kcat/Km比率分别为10³ s⁻¹ M⁻¹（SlLac2）和10⁴ s⁻¹ M⁻¹（PsLac1），比Lac1对相同底物的效率低10–100倍。
【数据】Km值：丁香醛连氮 0.017 mM、ABTS 0.043 mM、愈创木酚 1 mM；Kcat/Km：丁香醛连氮 6.26×10⁵ s⁻¹ M⁻¹、ABTS 4.00×10⁵ s⁻¹ M⁻¹
温度和pH对Lac1活性和稳定性的影响
Lac1在60°C时活性达到峰值（图2A），与Peniophora sp. CBMAI 1063漆酶池的最适温度55°C接近。大多数真菌漆酶在50至70°C之间表现出最适活性。然而，Lac1在较宽的温度范围（25–65°C）内保持至少70%的活性。关于热稳定性，Lac1的T50 1h为56.67°C（图2B），接近最适活性温度。在低于50°C的温度下，Lac1在室温孵育时保持80–100%的活性。Lac1比来自Peniophora lycii的陆地LacB漆酶更稳定，后者在50°C下半衰期不到30分钟。根据Bonugli-Santos等人（2015）的研究，更好的热稳定性是海洋来源微生物产生的酶相对于陆地微生物的优势之一。Lac1在ABTS和愈创木酚中的最适pH为3，而在丁香醛连氮中的最高活性在pH 5时达到（图2C）。相对活性在愈创木酚的pH 2至5之间、ABTS的pH 2至4之间以及丁香醛连氮的pH 5至6之间保持在50%以上。大多数真菌漆酶在酸性pH值下表现出最适活性。在pH 8时，Lac1在愈创木酚中仅检测到极低活性，而在ABTS和丁香醛连氮底物中未发现活性。尽管在pH 2时ABTS活性更高，但酶在该pH值下1小时内损失了90%以上的初始活性（图2D）。在最适pH下，半衰期在2至12小时之间。Lac1的最佳稳定性在pH 5至6之间，孵育12小时后仍保持80%以上的初始活性。来自Pestalotiopsis sp.和S. lucomagnoense的海洋漆酶在酸性pH值下似乎比Lac1更稳定，在pH 3至7之间孵育24小时后仍有50%以上活性。然而，在pH 2下的稳定性结果相似。
【数据】最适温度：60°C；T50 1h：56.67°C；最适pH：3（ABTS/愈创木酚）、5（丁香醛连氮）；pH 2稳定性：1h损失>90%活性；最佳稳定性pH：5–6（12h保持>80%）
抑制剂、金属离子、有机溶剂和盐对Lac1活性的影响
测试了最常见的漆酶抑制剂（图3A）。叠氮化钠是对Lac1活性影响最大的抑制剂，在最低测试浓度（0.1 mM）下使相对活性降低60%。L-半胱氨酸和2-巯基乙醇在向酶反应中添加0.5 mM后使Lac1活性降低50%以上。然而，漆酶抑制剂的影响需谨慎解读；虽然有些如NaN₃可直接损害酶对底物的氧化，但其他抑制剂可与氧化底物（ABTS•⁺）反应，将其还原为脱色的还原形式，因此并非直接损害酶本身。
【数据】NaN₃（0.1 mM）抑制：相对活性降低60%；L-半胱氨酸/2-巯基乙醇（0.5 mM）抑制：活性降低>50%
合成染料的脱色
Lac1在低酶浓度（0.2–0.02 U mL⁻¹）下降解了不同类别的染料。在丁香醛存在下，靛蓝胭脂红（IC）的脱色性能优异，2小时内脱色率达93%。此外，Lac1-介体系统将65%的偶氮染料活性黑5（RB5）降解为较低分子量的代谢物，植物毒性显著降低。
【数据】酶浓度：0.2–0.02 U mL⁻¹；IC脱色率：93%（2h）；RB5降解率：65%
讨论与解读
Lac1的表征揭示了其具有生物技术开发价值的特性：良好的热稳定性、在强酸性条件下的活性、对金属离子的显著耐受性以及溶剂耐受性。Lac1在有无介体的情况下均能脱色不同类别的合成染料（偶氮类、蒽醌类、三芳甲烷类和靛蓝类），且针对的是环境相关染料浓度。使用天然介体丁香醛进行脱色适用于低用量纯化酶的漆酶-介体系统，可将不同染料降解为较低分子量的代谢物。Lac1-介体系统与丁香醛的组合有效降解了RB5并显著降低了其毒性。然而，仍需优化以实现更好的脱毒率。后续研究还可探索Lac1与介体丁香醛的共固定化，以获得具有高稳定性、精细催化控制和可重复使用性的复合材料。尽管该海洋来源漆酶未表现出对高盐条件的强耐受性，但Lac1作为低盐条件下、高金属离子浓度及有机溶剂存在时有毒染料生物修复的替代生物资源，具有突出优势。
编译者解读
本研究完整呈现了海洋漆酶从基因表达到应用验证的全链条工作。方法上，亲和色谱结合去糖基化分析精准鉴定了毕赤酵母表达系统中的蛋白型异质性，这一细节常被同类研究忽略。从合成生物学应用角度看，Lac1在极低酶浓度（0.02 U mL⁻¹）下仍能高效脱色，意味着工业应用时酶生产成本可大幅降低。但海洋酶耐盐性不足这一短板也提示：若目标环境为高盐废水，可能需要通过定向进化或蛋白工程改造来提升其盐耐受性。丁香醛作为天然介体的使用则体现了绿色化学理念，避免了合成介体的二次污染风险。
DOI: 10.1016/j.bcab.2024.103485