来源：Engineering Aspergillus oryzae for enhanced heterologous protein production by synthetic biology toolkit development and morphology control（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space
导读
米曲霉是重要的食品级酶制剂生产宿主，但遗传操作效率低、菌丝形态难以控制长期制约其工业应用。本研究开发了一套涵盖RNP介导快速基因敲除、丝氨酸整合酶介导基因整合及中性位点筛选的合成生物学工具包，并系统敲除七个细胞壁完整性相关基因，发现几丁质合成酶基因chsY缺失可使菌丝直径增加34.8%、培养液黏度降低30.6%，异源脂肪酶TLL摇瓶酶活提升52%，并在1.5 L生物反应器中实现42%的酶活提升。
研究背景
米曲霉（Aspergillus oryzae）是公认的蛋白质生产宿主，具有底物谱广、安全性高、分泌能力强等优势。然而，遗传工具效率低下和发酵过程中菌丝形态难以控制两大瓶颈限制了其工业应用。CRISPR/Cas9结合原生质体转化等技术的进步虽改善了米曲霉的基因编辑效率，破坏NHEJ通路基因（如ku70、ku80、ligD）可进一步提高同源重组效率，但丝状真菌的遗传操作仍受限于转化效率低和实验周期长。在液体深层发酵中，丝状真菌通常形成致密的菌丝球，导致发酵液黏度升高，阻碍传质和氧溶解。早期形态工程策略集中于优化发酵参数（孢子接种密度、发酵液黏度、pH）或添加微粒，但这些方法在不同发酵体系间缺乏广泛适用性。随着分子工具的发展，研究者开始从遗传层面寻找形态调控的靶点。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
大肠杆菌DH5α用于质粒构建。本研究所用工程米曲霉菌株列于补充表S1。其中，A. oryzae IFO4177 ΔKu70 ΔpyrG ΔglaA::Teton-cre用于菌丝形态遗传调控研究。所有培养基详见补充表S2。含中生霉素或四环素抗生素的平板需避光培养。
【数据】菌株：E. coli DH5α、A. oryzae IFO4177 ΔKu70 ΔpyrG ΔglaA::Teton-cre；抗生素：中生霉素、四环素；培养条件：避光
2.2 细胞壁完整性关键基因的快速敲除
本研究采用快速敲除方法获得细胞壁完整性缺陷型转化子。一方面，在体外组装Cas9蛋白与sgRNA的RNP复合物；另一方面，制备带有39 bp同源臂和筛选标记的线性供体模板。基于PEG/CaCl₂介导的原生质体转化方法，将RNP和扩增的线性供体模板（>15 μg）转化至IFO4177 ΔKu70 ΔpyrG ΔglaA::Teton-cre菌株。本工作所用sgRNA列于补充表S3，全部通过在线工具（http://www.rgenome.net/cas-designer/）设计。
为阐明米曲霉菌丝形态的调控网络，本研究选取七个关键基因进行敲除，涵盖信号通路和结构组分两个层面。信号层面靶向细胞壁完整性MAPK通路激酶基因bck1和mpkA；结构层面包括α-1,3-葡聚糖合酶基因agsB、GAG生物合成基因sphZ/ugeZ、几丁质合酶基因chsY以及甾醇调控因子srbA，旨在系统考察细胞壁合成、膜界面稳态与形态发生之间的关系。
【数据】同源臂长度：39 bp；供体DNA用量：>15 μg；转化方法：PEG/CaCl₂介导原生质体转化；敲除基因：bck1、mpkA、agsB、sphZ、ugeZ、chsY、srbA
2.3 菌丝形态的平板表征与SEM观察
本研究使用不同固体平板表征宿主与转化子之间的菌丝形态差异。PDA平板用于评估正常条件下的菌丝生长；CR平板用于评估胁迫下的细胞壁完整性；脱脂奶粉平板用于测定转化子的胞外蛋白水解活性。各平板分别接种相应转化子（每菌株三个重复），30°C培养3天。
用无菌手术刀从PDA平板切取约10 mm²样品（厚度≤3 mm），正面朝上置于含2.5%戊二醛的1.5 mL离心管中，4°C固定约10小时。后续处理步骤——临界点干燥、喷金和成像——由中科百测平台完成。扫描电子显微镜（Hitachi SU8010）在工作距离11–12 mm、加速电压5 kV条件下操作；所有SEM图像均包含比例尺。
【数据】培养基：PDA、CR、脱脂奶粉平板；温度：30°C；时间：3天；样品大小：约10 mm²（≤3 mm厚）；固定液：2.5%戊二醛；固定条件：4°C、约10 h；SEM参数：工作距离11–12 mm、加速电压5 kV
2.4 米曲霉IFO4177中目标酶的发酵
摇瓶发酵中，目标酶生产菌株以孢子悬浮液（终浓度10⁶孢子/mL）接种于淀粉培养基（500 mL摇瓶装液量100 mL），30°C、220 rpm振荡培养6天。
为评估菌株在受控、可放大条件下的性能，使用1.5 L生物反应器（T&J-CloudReady 1.5 L，T&J Bio-engineering Co. Ltd.，上海）进行批次发酵。种子培养首先按上述摇瓶发酵方法制备3天，然后以10%（v/v）接种量转移至生物反应器（工作体积500 mL）。发酵条件为30°C、pH 6.5、溶解氧（DO）维持在30%。搅拌转速初始设为200 rpm；当DO首次降至10%以下时，搅拌转速自动与DO信号耦合以维持DO在10%。发酵运行4天。
【数据】摇瓶发酵：孢子终浓度10⁶孢子/mL，培养基为淀粉培养基，装液量100 mL/500 mL瓶，30°C，220 rpm，6天；反应器发酵：1.5 L规模，接种量10%（v/v），工作体积500 mL，30°C，pH 6.5，DO 30%，初始转速200 rpm，DO耦合控制10%，4天
2.5 菌丝形态定量分析
使用ImageJ软件从显微图像中定量菌丝形态。液体培养物通过系统取样测量平均菌丝直径；固体培养物通过追踪单根菌丝计算菌丝分枝频率（每毫米分枝数）。详细方案（包括每次测量的样本量n）见补充方法S1及相应图注。
【数据】定量参数：平均菌丝直径、分枝频率（分枝数/mm）；软件：ImageJ；样本量：见补充方法S1及图注
2.6 发酵液表观黏度测定
使用旋转黏度计（NDJ-8S型）在室温下测定发酵液的表观黏度。测量在标准化条件下（样品体积、转子和转速）进行，以确保样品间的可比性。详细测量方案见补充方法S2。
【数据】仪器：NDJ-8S旋转黏度计；测量条件：室温、标准化样品体积/转子/转速
2.7 转录组分析
将孢子悬浮液接种于淀粉培养基（孢子终浓度10⁶/mL），30°C、220 rpm振荡培养4天。收集菌丝体（≥3 g），4°C下8000 r/min离心10分钟，用ddH₂O洗涤两次，液氮速冻后送北京擎科生物科技有限公司进行RNA完整性评估（补充表S4–5）。合格的样品在DNBSEQ平台上进行RNA测序。读段比对至A. oryzae RIB40基因组进行表达定量。使用DESeq2从表达矩阵中鉴定差异表达基因（DEGs）。调整后p值（FDR）< 0.05且|log2FC| ≥ 1的基因视为显著差异表达。每个条件设置两个独立生物学重复。样品重复性通过VST转换数据的PCA和欧氏距离热图评估（见补充图S1）。
【数据】培养条件：淀粉培养基，孢子终浓度10⁶/mL，30°C，220 rpm，4天；菌丝体收集量：≥3 g；离心：8000 r/min，10 min，4°C；测序平台：DNBSEQ；比对参考基因组：A. oryzae RIB40；DEG阈值：FDR < 0.05，|log2FC| ≥ 1；生物学重复：2
2.8 丝氨酸重组酶介导的米曲霉目标基因整合
采用丝氨酸重组酶介导的整合方法实现米曲霉中目标基因的快速整合，包括Thermomyces lanuginosus脂肪酶（TLL）、亮氨酸氨肽酶A（LAPA）和β-葡萄糖醛酸酶（GUS）编码基因。TLL、LAPA和GUS的酶活测定方法分别详见补充方法S3–S5。编码TLL的基因经密码子优化合成，适配米曲霉密码子偏好性（广州优康生物科技有限公司），序列见补充表S6。此前发表的方案详细描述了遗传操作过程（Yao et al., 2025）。
【数据】目标基因：TLL、LAPA、GUS；TLL基因：密码子优化合成；整合方法：丝氨酸重组酶介导；参考方案：Yao et al., 2025
2.9 以GUS为报告基因评估候选中性位点的转录和表达活性
以GUS作为报告基因评估不同候选中性基因组位点的转录和表达活性。通过定量PCR（qPCR）比较插入天然高表达amyA位点与其它中性位点的GUS mRNA水平，评估转录活性。使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒（长沙 Accurate Biology）在ABI 7500 Fast实时PCR系统上测定目标基因的相对表达水平，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gpdA）作为内参进行归一化。RNA提取和cDNA合成按此前描述的方法进行（Yao et al., 2025）。每个样品设三个技术重复，相对转录水平采用2^–ΔΔCT方法计算。各位点的表达活性通过测定GUS酶活评估，详见上述酶活测定部分。qPCR所用引物列于补充表S7。
【数据】qPCR试剂盒：SYBR Green Premix Pro Taq HS（Accurate Biology）；仪器：ABI 7500 Fast；内参基因：gpdA；技术重复：3；计算方法：2^–ΔΔCT
2.10 统计分析
所有实验均设置至少两个独立生物学重复。使用GraphPad Prism软件（9.0版）进行统计分析。两组间比较时，分别采用Shapiro-Wilk检验和F检验评估正态性和方差齐性。数据满足参数检验假设时，采用非配对Student's t检验。多于两组间的比较采用单因素方差分析（原文截断）。
【数据】统计软件：GraphPad Prism 9.0；正态性检验：Shapiro-Wilk；方差齐性检验：F检验；两组比较：非配对t检验；多组比较：单因素方差分析；生物学重复：≥2
研究结果
3.1 米曲霉高效合成生物学工具包的构建
#### 3.1.1 RNP介导的快速基因敲除策略
结合PEG/CaCl₂介导的原生质体转化方法，本研究建立了基于体外预组装Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物的编辑系统，有效避免外源DNA的引入，显著降低脱靶效应。该RNP策略在编辑效率和脱靶控制方面较传统质粒型CRISPR/Cas9系统具有明显优势。在烟曲霉中，RNP介导的编辑结合微同源定向修复实现了95–100%的靶向准确率，而相同物种中质粒型CRISPR的效率仅为25–53%（Zhang et al., 2016）。在黑曲霉中，RNP递送在野生型菌株中实现了100%的单基因敲除效率，优于传统质粒型方法（Nan et al., 2021）。在Thermothelomyces thermophilus中的系统比较进一步阐明了脱靶风险的差异：RNP递送的脱靶风险最低，因为核酸酶活性是瞬时的；而质粒递送——尤其是Cas蛋白被整合并组成型表达时——与较高的脱靶风险相关（Kwon et al., 2019）。
基于此，本研究进一步开发了使用短同源臂（39 bp）的RNP介导快速基因敲除策略。以A. oryzae IFO4177 Δku70 ΔpyrG为底盘细胞，快速敲除了参与半乳糖胺半乳聚糖合成（sphZ和ugeZ）、α-1,3-葡聚糖合酶（agsB）、几丁质合酶（chsY）、SREBP（srbA）以及激酶级联信号通路（bck1和mpkA）的关键基因，获得菌丝形态突变菌株。这些突变体在PDA平板上表现出明显的表型差异（图1A）。
【数据】RNP编辑效率（烟曲霉）：95–100%；质粒型CRISPR效率（烟曲霉）：25–53%；RNP敲除效率（黑曲霉）：100%；同源臂长度：39 bp；底盘菌株：IFO4177 Δku70 ΔpyrG；敲除基因：sphZ、ugeZ、agsB、chsY、srbA、bck1、mpkA
#### 3.1.2 Bxb1/PhiC31丝氨酸重组酶介导的快速基因整合系统
5-氟胞嘧啶（5-FC）是一种经典抗真菌药物（Bu et al., 2023）。fcy1基因是5-FC的作用靶点，在真菌中高度保守，编码胞嘧啶脱氨酶，可将5-FC转化为细胞毒性化合物5-氟尿嘧啶（5-FU）（Després et al., 2022）。基于这一原理，本研究在米曲霉中开发了噬菌体来源丝氨酸重组酶（Bxb1/PhiC31）介导的便捷基因整合方法。
首先，确认了5-FC对A. oryzae IFO4177的细胞毒性。然后，在高表达amyA（编码α-淀粉酶A）位点敲除内源fcy1基因（AO090003000802）并插入来自黑曲霉的异源fcy1基因，遵循此前在黑曲霉中建立的landing pad策略（Yao et al., 2025）。最后，使用cre/loxp系统进行标记回收。该系统使用特异性定向的lox66和lox71位点；Cre诱导后， intervening序列被切除并被一个低重组酶亲和力的突变lox72位点替代，允许在后续转化中高效回收标记（Cai & Chen, 2021）（图1B）。
在真菌转化过程中，将修复质粒与瞬时表达丝氨酸整合酶的质粒共转化至原生质体，无需同源臂即可实现高效基因整合，显著提高了米曲霉的转化效率（图1C–a）。为系统评估该位点的表达能力，选取两种模型蛋白进行测试：一种是米曲霉来源的亮氨酸氨肽酶A（AOLAPA）（图1C–b），用于评估内源蛋白的表达水平；另一种是大肠杆菌来源的β-葡萄糖醛酸酶（GUS），作为经典异源报告蛋白，用于检验该系统表达外源蛋白的能力（图1C–c）。实验结果表明两种蛋白均在工程菌株中成功表达，证明基于amyA位点的通用平台可靠且高效，适用于米曲霉中内源和异源蛋白的过量生产。
【数据】5-FC靶基因：fcy1（AO090003000802）；整合位点：amyA；标记回收系统：cre/loxp（lox66/lox71→lox72）；整合方法：丝氨酸重组酶（Bxb1/PhiC31）介导，无需同源臂；测试蛋白：AOLAPA（内源）、GUS（异源）
#### 3.1.3 中性位点文库的构建与筛选
为鉴定米曲霉基因组中适合高效异源基因整合与表达的中性位点，本研究建立了生物信息学筛选流程（图1D）。该流程利用公开的组学数据，系统地将候选池从全基因组筛选缩小到有限的高潜力靶点，具体如下（图1D–a）。
##### 3.1.3.1 中性位点的全基因组初筛
基于米曲霉模式菌株RIB40的参考基因组，系统注释了所有基因间区（IGRs），鉴定出12376个非编码区域。为确保遗传中性（基因整合后对宿主细胞生理影响最小）和大DNA片段插入能力，筛选长度超过3 kb的IGRs，获得1428个IGRs作为初级候选文库。
【数据】参考基因组：RIB40；注释IGRs总数：12376；筛选阈值：>3 kb；初级候选IGRs：1428
##### 3.1.3.2 基于染色质可及性的功能筛选
由于异源基因整合和表达效率与染色质可及性密切相关，本研究使用米曲霉RIB40菌株的ATAC-seq数据（Huang et al., 2021）评估初级候选IGRs的染色质开放状态。计算每个IGR的ATAC-seq信号强度（FPKM）。以FPKM > 100作为高可及性阈值，鉴定出70个位于开放染色质区域的IGRs，预测这些区域具有更高的整合效率和转录潜力。
【数据】ATAC-seq数据来源：RIB40菌株（Huang et al., 2021）；可及性阈值：FPKM > 100；高可及性IGRs：70
##### 3.1.3.3 基于局部转录活性的终筛与实验验证
基于局部转录活性进行进一步筛选。利用RNA-seq数据，以每个候选IGR为中心定义10 kb基因组窗口（上下游各5 kb），量化该窗口内总RNA-seq读段覆盖度，作为基础转录活性的代理指标。选择读段数最高的五个IGRs作为预测的高表达中性位点进行实验验证。
为评估这些候选中性位点的表达活性，使用GUS报告蛋白系统评估了五个预选位点。初步转化实验中，一个位点未能获得转化子，有效转化率为80%（4/5）。在四个成功构建的工程菌株中，以内源高表达amyA位点为参考，通过转录水平和酶活分析定量比较表达效率。结果表明，25%（1/4）的位点（即Int2）在所有测定参数上均优于amyA对照（图1D–a-d），证实了该筛选策略从有限候选集中鉴定新型高性能表达位点的有效性。
随后，候选位点Int2和Int5分别作为阳性和阴性对照，进一步验证筛选方法。虽然初始筛选依赖于整个IGR上的平均ATAC-seq读段密度（ATAC-FPKM），但该平均值可能掩盖局部染色质异质性。图1D–e、f的结果支持这一假设：Int2切割位点精确定位于ATAC-FPKM信号的峰值处（图1D和e），而Int5切割位点与谷值重合（图1D–f）。这表明Int5的同源重组修复失败可能源于局部致密的核小体包装或抑制性染色质修饰，阻碍了RNP引导的编辑。
【数据】筛选窗口：10 kb（±5 kb）；预测位点数：5；有效转化率：80%（4/5）；优于amyA对照的位点比例：25%（1/4，即Int2）；对照位点：Int2（阳性）、Int5（阴性）
3.2 细胞壁多糖和细胞膜甾醇缺陷突变体的分析
（原文此节内容未在提供的节选范围内完整呈现，图2对应内容见原文。）
【数据】原文未详述
3.3 参与细胞壁完整性信号通路的MAPK级联基因缺陷突变体的分析
（原文此节内容未在提供的节选范围内完整呈现，图3对应内容见原文。）
【数据】原文未详述
3.4 米曲霉中*Thermomyces lanuginosus*脂肪酶（TLL）的异源表达及相关合成生物学工具
（原文此节内容未在提供的节选范围内完整呈现，图4对应内容见原文。根据摘要，chsY缺失突变体菌丝直径增加34.8%，培养液黏度降低30.6%；表达TLL的工程菌株摇瓶胞外酶活提升52%，生物反应器中酶活提高42%、黏度降低约50%。）
【数据】菌丝直径：+34.8%；黏度：−30.6%（摇瓶）；TLL摇瓶酶活：+52%；TLL反应器酶活：+42%；反应器黏度：−约50%
讨论与解读
本研究通过开发RNP介导的快速基因敲除系统、丝氨酸整合酶介导的基因整合平台以及全基因组中性位点筛选流程，构建了一套适用于米曲霉的合成生物学工具包。在发现层面，靶向缺失几丁质合成酶基因chsY被鉴定为关键形态决定因子，使菌丝直径增加34.8%，摇瓶发酵液黏度降低30.6%，并持续增强蛋白酶、内源淀粉酶和异源脂肪酶TLL的分泌。转录组分析将chsY介导的形态转变与未折叠蛋白反应（UPR）的激活联系起来。通过将工具包与该发现相结合，实现了TLL的高水平异源表达，摇瓶酶活提升52%，该优势有效放大至1.5 L生物反应器（酶活提高42%、黏度降低50%）。因此，这项工作既提供了实用的遗传工具包，也提供了chsY缺失作为可规模化形态工程策略的生物学见解，为工程改造米曲霉以提高工业蛋白产量、直接解决脂肪酶和淀粉酶等食品级酶制剂生产瓶颈提供了可行方案。
编译者解读
本研究最值得关注之处在于将形态工程与分泌通路调控联系起来——chsY缺失不仅改变了菌丝形态、降低发酵液黏度，还意外激活了UPR通路，提示细胞壁完整性扰动与蛋白分泌能力之间存在此前未被充分认识的交叉调控。从合成生物学应用角度看，RNP系统避免外源DNA整合的特性对食品级菌株的法规合规性具有天然优势；而中性位点筛选流程中"平均ATAC信号掩盖局部染色质异质性"的发现也提示，未来位点评估需要更高的分辨率。不过，chsY缺失对菌株长期稳定性和不同底物条件下的形态可塑性仍需进一步考察。
参考来源
期刊：Food Bioscience, 2026
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108317
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108317