来源：UV-He-Ne Laser Sequential Mutagenesis Improves Protease Production of Bacillus velezensis: Comparison with Traditional UV Mutagenesis.（Foods）| 编译：DNA Lab Space
导读
诱变育种是微生物菌种改良的经典手段，但传统紫外（UV）诱变在提升目标性状的同时常伴随大量有害突变。本研究将UV的损伤效应与He-Ne激光的修复效应相结合，构建"损伤-修复"序贯诱变模式，应用于贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）的蛋白酶高产菌株选育。结果显示，UV-LA处理将正突变率从12.50%提升至16.67%，突变株酶活从20.81 U/mL提升至34.04 U/mL，且传代20次后酶活下降幅度从44%降至23%。基因组与蛋白质组分析揭示了该策略的分子机制，为微生物育种提供了新思路。
研究背景
发酵是现代生物制造的核心过程，广泛应用于食品加工、饲料添加剂生产等领域。该过程通过生物转化提升原料的营养价值和消化率，同时有助于降解抗营养因子并形成独特的产品风味。在生物发酵中，产蛋白酶菌株的性能直接决定蛋白质转化为多肽和氨基酸的效率，也是影响发酵周期、产品质量和经济效益的关键因素。贝莱斯芽孢杆菌是常用的发酵微生物，具有较强的蛋白酶分泌能力。然而，野生型菌株普遍存在代谢产物产量低、副产物组成复杂、环境适应能力差等固有局限。
微生物产酶受复杂的代谢调控网络控制，针对性地进行理性改造以提升产酶能力极为困难。相比之下，诱变育种凭借其随机性和广泛适用性，已被广泛应用于微生物菌株性能改良。与依赖化学诱变剂、存在安全和环保问题的化学诱变相比，物理诱变方法具有操作简便、成本低廉的优势。本研究旨在探索UV与He-Ne激光序贯处理对贝莱斯芽孢杆菌蛋白酶产量的影响，并与传统UV诱变进行比较。
研究方法
2.1 材料
贝莱斯芽孢杆菌（CICC 23571）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（北京，中国）。FITC-酪蛋白购自Thermo Fisher Scientific（Waltham, MA, USA）。L-乳酸脱氢酶活性检测试剂盒（BC0685）、发光微生物细胞活力检测试剂盒（CA3700）、磷酸果糖激酶活性检测试剂盒（BC0530）、异柠檬酸脱氢酶活性检测试剂盒（BC0400）和ATP酶活性试剂盒（BC0960, BC0060）均购自北京索莱宝科技有限公司。其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司（北京，中国）。
【数据】菌株：Bacillus velezensis CICC 23571；试剂来源：Thermo Fisher Scientific、Solarbio；试剂纯度：分析纯
2.2 生长曲线测定
参照Feng等[18]的方法，将活化菌株接种于100 mL LB液体培养基中，30°C培养36 h。培养期间测定培养物在600 nm处的吸光度值。根据培养时间和OD600值绘制生长曲线。
【数据】培养基：LB液体培养基；体积：100 mL；温度：30°C；时间：36h；检测波长：600 nm
2.3 微生物诱变处理
使用多光源诱变设备（MLME，江苏大学制造，镇江，中国）对菌株进行诱变处理。该设备配备UV光源（254 nm；Philips，荷兰）和He-Ne激光源（632 nm；Melles Griot Inc.，Carlsbad, CA, USA）[10,18]。光源与样品表面之间的距离固定为10 cm。UV辐照强度为1.5 mW/cm²，在菌悬液中的估计吸收率约为99.38%。He-Ne激光的实际输出功率为10.3 mW，光束直径为0.65 mm，对应功率密度约为3 W/cm²。激光辐照在菌悬液中的估计吸收率约为99.43%。
取5 mL处于对数期中期的细菌培养物转移至无菌管中，用3 mL无菌生理盐水洗涤两次并重悬。随后，取100 μL菌悬液（约5 × 10⁸ CFU/mL）转移至1.5 mL无菌管中，置于MLME中进行诱变处理。光源从样品管上方照射菌悬液以获得最大辐照效果[2,18,19]。整个辐照过程中无菌管保持开启状态，以防管盖阻挡入射光。UV处理时间设为0–30 min，He-Ne激光处理时间为0–120 min。对于UV-He-Ne激光序贯（UV-LA）处理，He-Ne激光处理时间固定为20 min，UV处理时间范围为0–30 min。
处理后的菌悬液经梯度稀释后涂布于LB平板。30°C培养24 h后计数菌落。致死率按以下公式计算（若计算所得致死率为负值，表明处理促进了细菌生长；此时取绝对值并记录为增长率）[10]：
L = (CC − CT) / CC × 100%
其中L为致死率，CC为未处理样品中的菌落数，CT为处理样品中的菌落数。
【数据】UV波长：254 nm；UV辐照强度：1.5 mW/cm²；UV吸收率：99.38%；激光波长：632 nm；激光功率：10.3 mW；光束直径：0.65 mm；功率密度：3 W/cm²；激光吸收率：99.43%；光源距离：10 cm；菌悬液浓度：5 × 10⁸ CFU/mL；UV处理时间：0–30 min；激光处理时间：0–120 min；UV-LA序贯处理中激光时间固定20 min、UV时间0–30 min；培养条件：30°C、24h
2.4 产蛋白酶突变株的高通量筛选
根据本课题组前期研究设计了产蛋白酶菌株的高通量筛选方法（图1）[10]。简言之，将诱变后的菌液首先涂布于酪蛋白平板（酪蛋白，5 g/L；酵母提取物，5 g/L；氯化钠，5 g/L；十二水合磷酸氢二钠，2 g/L；溴百里酚蓝，0.05 g/L；琼脂，15 g/L）。30°C培养24 h后，挑选水解圈较大的单菌落，接种于96孔深孔板中振荡培养。所得培养物以10%接种量接种于含900 μL无菌LB培养基的48孔深孔板中，30°C、300 r/min培养24 h。初筛采用荧光蛋白酶活性测定法。将初筛获得的酶活性最高的前96株菌株重新培养，并使用UV蛋白酶活性检测方法进行复筛。荧光和UV吸光度测定使用多功能酶标仪（SPARK，Tecan，Männedorf，瑞士）。最终筛选获得蛋白酶活性最高的UV菌株和UV-LA菌株。
【数据】酪蛋白平板成分：酪蛋白5 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L、十二水合磷酸氢二钠2 g/L、溴百里酚蓝0.05 g/L、琼脂15 g/L；培养条件：30°C、24h；接种量：10%；培养基体积：900 μL；振荡培养条件：30°C、300 r/min、24h；复筛菌株数：96株
#### 2.4.1 荧光法测定蛋白酶活性
参照Stonoha-Arther等[20]的实验方法并作适当修改，将培养后的菌悬液以2000 rpm离心15 min，收集上清液进行分析。实验使用384孔板。首先向每孔中加入37.5 μL待测酶液，37°C孵育5 min以平衡。随后向每孔中加入37.5 μL浓度为10 μg/mL的FITC-酪蛋白溶液，用微板离心机短暂离心以确保各组分充分混合。384孔板必须在37°C孵育30 min。反应完成后，将384孔板置于酶标仪中，激发波长设为485 nm，发射波长设为538 nm，进行荧光检测。
【数据】离心条件：2000 rpm、15 min；酶液体积：37.5 μL；平衡条件：37°C、5 min；FITC-酪蛋白浓度：10 μg/mL；体积：37.5 μL；反应条件：37°C、30 min；激发波长：485 nm；发射波长：538 nm
#### 2.4.2 UV法测定蛋白酶活性
按照Lu等[10]的方法，将细菌培养物以2000 r/min离心15 min。取50 μL上清液转移至96孔板中，30°C预热2 min。加入50 μL酪蛋白溶液，振荡混匀后于30°C孵育10 min。加入100 μL三氯乙酸终止反应，以4000 rpm离心5 min。取20 μL上清液转移至新的微板中，加入100 μL碳酸钠溶液，随后加入20 μL福林试剂。充分混匀后于30°C孵育20 min显色。使用酶标仪（SPARK，Tecan，Männedorf，瑞士）在680 nm处测定吸光度。对照组为先向50 μL待测液中加入100 μL三氯乙酸，再加入50 μL酪蛋白溶液，其余步骤相同。
【数据】离心条件：2000 r/min、15 min；上清液体积：50 μL；预热条件：30°C、2 min；酪蛋白溶液体积：50 μL；反应条件：30°C、10 min；三氯乙酸体积：100 μL；离心条件：4000 rpm、5 min；上清液转移量：20 μL；碳酸钠溶液体积：100 μL；福林试剂体积：20 μL；显色条件：30°C、20 min；检测波长：680 nm
2.5 遗传稳定性测试
野生菌株和突变菌株在LB培养基中连续传代培养。每株菌传代20次，选取第1、3、5、10、15和20代菌株进行分析。按2.4.2节所述方法测定蛋白酶活性，以确定各突变菌株的遗传稳定性。
【数据】传代次数：20次；检测代次：第1、3、5、10、15、20代
2.6 L-乳酸脱氢酶（L-LDH）活性测定
将野生菌株和突变菌株分别接种于10 mL LB液体培养基中，30°C、180 rpm振荡培养24 h作为种子培养物。以1%接种量将种子培养物转移至含10 mL LB培养基的50 mL无菌摇瓶中，在相同条件下培养9 h。培养期间采集样品，按照L-LDH活性检测试剂盒说明书（北京索莱宝科技有限公司）进行分析。
【数据】培养基：LB液体培养基；体积：10 mL；培养条件：30°C、180 rpm、24h（种子培养）；接种量：1%；摇瓶规格：50 mL；培养时间：9h
2.7 微生物活力测定
菌株按2.6节所述方法培养。培养期间采集样品，按照发光微生物细胞活力检测试剂盒说明书（北京索莱宝科技有限公司）进行分析。
【数据】培养条件同2.6节；检测试剂盒：发光微生物细胞活力检测试剂盒
2.8 磷酸果糖激酶（PFK）活性测定
菌株按2.6节所述方法培养。分别在培养9 h和20 h时取样。将5 mL培养液转移至无菌10 mL离心管中，按照磷酸果糖激酶活性检测试剂盒说明书（北京索莱宝科技有限公司）进行分析。
【数据】取样时间点：9h、20h；取样体积：5 mL；离心管规格：10 mL
2.9 异柠檬酸脱氢酶（IDH）活性测定
菌株按2.6节所述方法培养。分别在培养9 h和20 h时取样。将5 mL培养液转移至无菌10 mL离心管中，按照异柠檬酸脱氢酶活性检测试剂盒说明书（北京索莱宝科技有限公司）进行分析。
【数据】取样时间点：9h、20h；取样体积：5 mL；离心管规格：10 mL
2.10 ATP酶活性测定
菌株按2.6节所述方法培养。分别在培养9 h和20 h时取样。将5 mL培养液转移至无菌10 mL离心管中，按照ATP酶活性试剂盒说明书（北京索莱宝科技有限公司）进行分析。
【数据】取样时间点：9h、20h；取样体积：5 mL；离心管规格：10 mL
2.11 基因组测序
将筛选获得的突变菌株送往北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组测序。使用Illumina NovaSeq平台进行测序。以贝莱斯芽孢杆菌CICC 23571的基因组为参考，使用BWA软件进行序列比对，使用GATK软件进行变异检测。
【数据】测序平台：Illumina NovaSeq；比对软件：BWA；变异检测软件：GATK
2.12 蛋白质组学分析
将筛选获得的突变菌株送往北京诺禾致源科技股份有限公司进行蛋白质组学分析。蛋白质提取后，使用BCA法测定蛋白质浓度。蛋白质样品经胰蛋白酶酶解后，使用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）进行分析。使用MaxQuant软件进行蛋白质鉴定和定量分析。差异表达蛋白的筛选标准为倍数变化≥1.5倍且p值<0.05。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析使用在线工具DAVID进行。
【数据】蛋白质定量方法：BCA法；酶解试剂：胰蛋白酶；分析平台：LC-MS/MS；鉴定软件：MaxQuant；筛选标准：倍数变化≥1.5、p<0.05
研究结果
3.1 生长曲线分析
细菌菌株在不同生长阶段的生理状态各不相同。因此，了解其生长规律对于后续诱变至关重要。图2A展示了贝莱斯芽孢杆菌的生长过程，主要呈现四个不同阶段。在最初的0–4 h内，菌株进入延滞期，细胞增殖缓慢，OD600无明显变化。在此期间，菌株逐渐适应新的生长环境，调整代谢，积累后续生长所需的物质[23]。从4到18 h，菌株进入对数期，细胞快速增殖，细胞数量呈指数增长。在此阶段，细胞呈现出相对均一的生理状态，对外界刺激高度敏感，是进行诱变处理的最佳时期[18]。在18至29 h之间，菌株进入稳定期，生长速率显著减慢，细胞数量保持稳定。此时，培养基中的营养物质逐渐耗尽，代谢产物持续积累。当培养时间超过29 h时，菌株进入衰亡期，细菌死亡率增加。基于各生长阶段的特征，选择培养12 h的细胞进行后续诱变实验。
【数据】延滞期：0–4h；对数期：4–18h；稳定期：18–29h；衰亡期：>29h；诱变处理选择时间点：12h
3.2 不同光照处理条件下的致死率变化
首先，对野生菌株分别进行UV和He-Ne激光处理，以确定合适的处理时间范围。图2B显示了UV照射时间对菌株致死率的影响。结果表明，随着照射时间的增加，致死率显著升高，这与Lu等[10]的研究一致。这是因为照射时间与菌株接受的辐射剂量呈正相关。当辐射损伤超过细菌的生理耐受阈值和修复能力时，细胞难以维持正常的代谢功能，最终导致细胞死亡[24]。在经典微生物诱变中，约70–90%的致死率通常被认为适合突变体筛选，因为它在突变诱导和细胞存活之间提供了平衡[18,25]。虽然增加照射剂量可能提高突变频率，但过度的DNA损伤会降低突变体回收效率并增加有害突变的发生。因此，接近80%的致死率常被作为工业菌株改良的实用标准。基于这一标准，选择10 min的UV处理时间用于后续实验。
图2C显示了He-Ne激光对菌株的影响。He-Ne激光处理未表现出明显的致死效应。相反，它显示出双向生物效应：短期处理促进菌株生长，而长期处理抑制其生长或导致死亡。照射20 min后，细菌数量增加了31.48%。一般认为，He-Ne激光促进微生物生长的主要机制是增强ATP合成和刺激细胞内生理修复过程[26]。鉴于He-Ne激光独特的促生长效应可能增加诱变结果的多样性，选择20 min处理作为最终的激光处理时间。
在此基础上进行UV-LA处理（图2D）。He-Ne激光处理时间固定为20 min，通过改变UV处理时间调节致死率。结果表明，He-Ne激光的修复效应有效延缓了UV诱导的致死过程。在单独UV处理中，照射10 min后致死率达到80%。然而，在UV-LA处理模式下，达到80%致死率所需的UV处理时间为20 min。这表明He-Ne激光在修复UV诱导损伤方面发挥了重要作用，从而部分减轻了UV对菌株的致死效应。为便于后续比较两种诱变方法，基于80%致死率确定两种方法的处理参数。因此，采用UV处理20 min后进行He-Ne激光处理20 min构建"损伤-修复"模式对野生菌株进行诱变，并讨论该模型与传统单次UV诱变获得突变菌株的差异。
【数据】UV处理致死率80%对应时间：10 min（单独UV）、20 min（UV-LA序贯）；He-Ne激光20 min处理后细菌数量增加：31.48%；致死率筛选标准：接近80%
3.3 突变株筛选与遗传稳定性分析
对两种诱变模式产生的突变株进行初筛，每种处理方法各筛选288个突变株。根据蛋白酶活性计算正突变率。结果显示，UV诱变的正突变率为12.50%（图2E），UV-LA诱变的正突变率为16.67%（图2F）。UV-LA诱变的突变率有所提高。推测He-Ne激光可能激活菌株修复通路，提高表达效率，促进UV诱导损伤的修复，从而增加获得正突变菌株的概率[17]。此外，根据Bannenberg等[27]的报道，菌株的修复机制会优先作用于维持其基本生命活动的代谢通路，这有助于减少诱变对产酶代谢通路的负面干扰。从突变率的角度来看，UV作为一种强效诱变光源，可以提供更广泛的突变文库，而He-Ne激光则促进代谢损伤较小的个体的恢复和生长。该方法还保留了产酶通路的突变特征，从而丰富了该通路中的正向突变[28]。
将初筛中鉴定出的酶活性较高的突变体进行复筛，选择蛋白酶活性提升最大的菌株。图2G显示了每种处理模式下最佳突变株的酶活性。UV-LA菌株的蛋白酶活性最高，达到34.04 U/mL，比野生菌株高出约79%，而UV菌株仅增加约10%。这表明在相同的筛选压力下，UV-LA模式不仅具有较高的正突变率，而且更有可能产生蛋白酶产量更高的突变菌株。基于前期实验，推测这可能是因为菌株在UV损伤后启动修复系统，特别是激活易错修复系统，增加了碱基错配的可能性，从而显著改变细菌表型[29]。
为进一步评估He-Ne激光诱导修复对菌株连续传代稳定性的影响，对突变菌株和野生菌株进行连续传代培养，并随时间监测蛋白酶活性的变化。结果如图2H所示。野生菌株表现出最佳的传代稳定性，其酶活性在20代后仅下降约19%。其酶活性下降可能与连续传代过程中自发突变的逐渐积累有关，这些突变往往具有负面效应，导致菌株性能下降[30]。相比之下，两种突变菌株在前五代均保持良好的稳定性，但此后蛋白酶活性逐渐下降。这可能是由于高强度诱变导致突变菌株的遗传不稳定性。虽然其获得了与产酶相关的有利突变，但也积累了许多隐性非靶向突变。
【数据】初筛突变株数量：每种方法288株；UV诱变正突变率：12.50%；UV-LA诱变正突变率：16.67%；UV-LA菌株蛋白酶活性：34.04 U/mL；UV-LA菌株较野生型提升：约79%；UV菌株较野生型提升：约10%；野生菌株20代后酶活下降：约19%
3.4 生理活性与关键代谢酶活性分析
图3A显示了起始菌株与突变菌株之间L-LDH活性的变化。UV-LA菌株的L-LDH活性在整个培养过程中均高于UV菌株。L-LDH是糖酵解途径的关键酶，催化丙酮酸转化为乳酸，其活性升高表明UV-LA菌株的糖酵解代谢更为活跃。
图3B显示了起始菌株和突变菌株总细胞内ATP含量的变化。UV-LA菌株的ATP含量在各时间点均显著高于UV菌株和野生菌株。ATP是细胞的主要能量货币，其含量升高说明UV-LA菌株的能量代谢更为旺盛，为蛋白质合成和分泌提供了充足的能量支持。
图3C显示了起始菌株和两种突变菌株在不同培养阶段PFK活性的变化。PFK是糖酵解途径的限速酶，催化果糖-6-磷酸转化为果糖-1,6-二磷酸。UV-LA菌株在9 h和20 h的PFK活性均高于UV菌株，表明其糖酵解通量更大。
图3D显示了起始菌株和两种突变菌株在不同培养阶段IDH活性的变化。IDH是三羧酸循环的关键酶，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸。UV-LA菌株的IDH活性在培养后期显著高于UV菌株，表明其TCA循环代谢更为活跃，为细胞提供了更多的还原力和前体代谢物。
图3E显示了起始菌株和两种突变菌株在不同培养阶段ATP酶活性的变化。ATP酶负责ATP的水解，为物质跨膜运输提供能量。UV-LA菌株的ATP酶活性高于UV菌株，这可能与其蛋白质分泌能力增强有关。
【数据】L-LDH活性：UV-LA菌株全程高于UV菌株；ATP含量：UV-LA菌株各时间点显著高于UV菌株和野生菌株；PFK活性：UV-LA菌株在9h和20h均高于UV菌株；IDH活性：UV-LA菌株培养后期显著高于UV菌株；ATP酶活性：UV-LA菌株高于UV菌株
3.5 基因组测序分析
对野生菌株、UV菌株和UV-LA菌株进行全基因组测序，比较三种菌株的基因组差异。结果显示，UV-LA菌株的突变数量少于UV菌株，且突变位点更集中在调控区域。UV-LA菌株的突变主要分布在启动子区域和调控蛋白编码基因中，这可能有助于精细调控蛋白酶的表达水平，而非简单地破坏基因功能。相比之下，UV菌株的突变分布更为分散，包含更多编码区的非同义突变，可能导致更多蛋白质功能受损。
【数据】突变数量：UV-LA菌株少于UV菌株；突变分布：UV-LA菌株集中于调控区域，UV菌株分散且编码区非同义突变更多
3.6 蛋白质组学分析
图4A显示了UV菌株与UV-LA菌株之间的差异蛋白数量。共鉴定出108个差异表达蛋白，其中56个上调表达，52个下调表达。图4B展示了差异蛋白的热图，清晰显示两株菌之间蛋白质表达谱的系统性差异。图4C的GO富集分析表明，差异蛋白主要富集在能量代谢、翻译和分泌系统相关条目中。图4D的KEGG通路分析显示，差异蛋白主要参与糖酵解/糖异生、三羧酸循环、核糖体、蛋白质输出和细菌分泌系统等通路。这些结果与前述生理生化测定结果相互印证，表明UV-LA处理通过调控能量代谢和蛋白质分泌相关蛋白的表达来提升菌株的蛋白酶产量。
【数据】差异蛋白总数：108个；上调蛋白：56个；下调蛋白：52个；主要富集通路：糖酵解/糖异生、三羧酸循环、核糖体、蛋白质输出、细菌分泌系统
讨论与解读
本研究将UV的损伤效应与He-Ne激光的修复效应相结合，构建了"损伤-修复"序贯诱变模式。与传统UV诱变相比，UV-LA处理不仅提高了正突变率（从12.50%提升至16.67%）和突变株酶活（从20.81 U/mL提升至34.04 U/mL），还显著改善了突变株的遗传稳定性（传代20次后酶活下降从44%降至23%）。机制研究表明，He-Ne激光可能通过激活菌株修复通路、优先修复维持基本生命活动的代谢通路，从而减少诱变对产酶通路的负面干扰。生理生化分析显示，UV-LA菌株的糖酵解、TCA循环和能量代谢均更为活跃。基因组测序发现UV-LA菌株的突变更集中于调控区域，蛋白质组学分析则确认了差异蛋白主要涉及能量代谢、翻译和分泌系统。
编译者解读：本研究展示了物理诱变与修复效应协同作用的巧妙设计——利用He-Ne激光的生物刺激效应"引导"修复机制向有利方向运作，在保留有益突变的同时剔除有害突变。从合成生物学角度看，这种"损伤-修复"策略为工业菌株改良提供了一种无需基因编辑工具的非转基因路径，在食品发酵等领域具有合规优势。然而，该方法的机制解析仍较粗浅——激光如何"选择"修复哪些损伤位点尚不清楚，突变在调控区的具体效应也缺乏深度验证。未来若能与CRISPR等精准工具联用，或可进一步提升育种效率。
参考来源
Liu Y, Duan Y, Luo L, Tuly JA, Ma H. UV-He-Ne Laser Sequential Mutagenesis Improves Protease Production of Bacillus velezensis: Comparison with Traditional UV Mutagenesis. Foods. PMID: 42587839.
PMID: 42587839