硫酸化DK4衍生物的化学合成与生物评价

来源：Chemical Synthesis and Biological Evaluation of Sulfated DK4 Derivatives from Escherichia coli K4 Polysaccharide.（Molecules）| 编译：DNA Lab Space

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导读

硫酸软骨素（CS）的硫酸化模式与其生物学功能密切相关。本研究以微生物来源的去果糖K4多糖（DK4）为骨架，通过化学方法合成了三种硫酸化衍生物（DK4-OS、DK4-NS和DK4-O,NS），并利用NMR、FTIR、元素分析和二糖组成分析对产物进行了结构表征。生物活性评价显示，不同硫酸化模式的衍生物对胶质细胞中RhoA/ROCK1通路和髓鞘碱性蛋白（MBP）的表达产生差异性调控。这项工作为阐明硫酸化模式与胶质细胞功能之间的构效关系提供了实验基础。

研究背景

硫酸软骨素（CS）是一种广泛分布于细胞外基质和细胞表面的硫酸化糖胺聚糖。近年来，CS因其在骨关节炎、神经损伤和神经退行性疾病等多种生理病理过程中参与调控而受到广泛关注。CS由葡萄糖醛酸（GlcA）和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）的重复二糖单元构成线性多糖，其结构异质性主要来源于硫酸化模式的差异。依据硫酸基位置的不同，CS可分为CSA、CSC和CSE等亚型，不同硫酸化模式导致电荷分布和空间构象的差异，进而影响CS与蛋白质的相互作用及生物学功能。

在神经系统中，硫酸软骨素蛋白聚糖可与蛋白酪氨酸磷酸酶σ（PTPσ）、白细胞共同抗原相关磷酸酶（LAR）及Nogo受体等相互作用，参与神经再生与抑制过程的调控。因此，开发具有明确硫酸化模式的CS衍生物，对于解析其结构与功能的关系具有重要意义。本研究利用微生物来源的K4多糖经去果糖化获得DK4，再通过化学硫酸化策略合成三种硫酸化衍生物，并对其结构和生物活性进行了系统评价。

研究方法

3.1 材料

三氟乙酸（TFA）、SO₃·吡啶复合物和四丁基氢氧化铵购自阿拉丁（上海，中国）。Na₂CO₃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、Tween-20和NaCl购自国药集团化学试剂有限公司（上海，中国）。多聚赖氨酸（PLL）和牛血清白蛋白（BSA）购自索莱宝生物科技有限公司（北京，中国）。Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测试剂盒购自苏州新赛美生物技术有限公司（苏州，中国）。放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液购自碧云天生物技术研究所（上海，中国）。青霉素-链霉素（Pen/Strep）、DMEM培养基和胎牛血清（FBS）购自Gibco Invitrogen（Carlsbad, CA, USA）。MBP兔单克隆抗体、ROCK1兔单克隆抗体、RhoA兔单克隆抗体和β-actin兔单克隆抗体购自Cell Signaling Technology（Beverly, MA, USA）。所有化学品均按原样使用，除非另有说明。本研究使用去离子水。

【数据】材料来源：阿拉丁、国药集团、索莱宝、新赛美、碧云天、Gibco Invitrogen、Cell Signaling Technology；抗体：MBP、ROCK1、RhoA、β-actin兔单抗

3.2 样品制备

K4多糖从工程化大肠杆菌K4（ATCC 23502）细胞培养物中分离纯化，方法如前所述[24]。K4多糖在密封管中用25 mM TFA于100°C水解30 min，然后透析并冻干得到DK4。

【数据】菌株：大肠杆菌K4（ATCC 23502）；TFA浓度：25 mM；温度：100°C；时间：30 min

#### 3.2.1 DK4-OS衍生物的合成

DK4-OS采用基于已报道方法的改良SO₃·py/DMF硫酸化程序制备[45]。将DK4（100 mg）悬浮于无水DMF（4 mL）中搅拌，然后加入SO₃·py复合物（340 mg）的DMF溶液（1.5 mL）。反应混合物在室温下搅拌24 h。反应完成后，用NaCl饱和的丙酮（3.2 mL）沉淀产物，并通过低速离心收集。沉淀用饱和NaCl-丙酮溶液洗涤三次，溶于去离子水，用1 M NaOH中和，使用1000 Da分子量截留透析袋（索莱宝生物科技有限公司，北京，中国）对水透析，浓缩并冻干。

【数据】DK4用量：100 mg；无水DMF：4 mL；SO₃·py：340 mg（溶于1.5 mL DMF）；温度：室温；时间：24 h；沉淀剂：NaCl饱和丙酮3.2 mL；透析袋截留：1000 Da

#### 3.2.2 DK4-NS衍生物的合成

采用基于已报道多糖修饰程序的改良方法[46]。将DK4（100 mg）悬浮于2 M NaOH溶液（10 mL）中，加热至60°C，搅拌28 h。冷却至室温后，离心反应混合物，用2 M HCl将上清液调至pH 7.0。所得溶液加热至40°C，加入Na₂CO₃（160 mg），然后在4 h内分批加入SO₃·py复合物（260 mg）。冷却至室温后，用1 M NaOH调至pH 7.4，使用1000 Da分子量截留透析袋对水透析，浓缩并冻干。

【数据】DK4用量：100 mg；NaOH浓度：2 M（10 mL）；温度：60°C；时间：28 h；pH调节：2 M HCl调至pH 7.0；Na₂CO₃：160 mg；SO₃·py：260 mg（4 h内分批加入）；最终pH：7.4（1 M NaOH）

#### 3.2.3 DK4-O,NS衍生物的合成

采用基于已报道多糖修饰程序的改良方法[47]。将DK4（100 mg）溶于水（20 mL），用H⁺型阳离子交换树脂充分交换，然后冻干。所得产物溶于去离子水（10 mL），用四丁基氢氧化铵溶液中和，冻干得到产物（70 mg）。将该产物溶于无水DMF（3.5 mL），分批加入SO₃·py复合物（300 mg）。反应混合物加热至50°C搅拌24 h。混合物冷却至室温后用NaCl饱和的丙酮沉淀。沉淀溶于0.2 M NaCl溶液（1 mL），用2 M NaOH调至pH 7.8，再次用丙酮沉淀。沉淀溶于水（2 mL），加热至40°C，加入Na₂CO₃（112 mg），在4 h内分4批加入SO₃·py复合物（112 mg）。反应继续24 h，然后透析并冻干。

【数据】DK4用量：100 mg；阳离子交换树脂：H⁺型；四丁基铵盐产物：70 mg；无水DMF：3.5 mL；SO₃·py（第一步）：300 mg；温度：50°C；时间：24 h；0.2 M NaCl：1 mL；pH：7.8（2 M NaOH）；Na₂CO₃：112 mg；SO₃·py（第二步）：112 mg（4批/4 h）；反应时间：24 h

3.3 表征

傅里叶变换红外光谱（FTIR）使用NEXUS仪器（Thermo Nicolet, Madison, WI, USA）进行。¹H和¹³C核磁共振（NMR）实验在Bruker Advance III 400 MHz波谱仪（Bruker BioSpin, Billerica, MA, USA）上于60°C进行。多糖以25 mg/mL的浓度溶于D₂O。多糖衍生物的元素分析使用Vario Micro Cube（Elementar, Langenselbold, Germany）进行。细胞毒性试验使用SpectraMax M2酶标仪（Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA）在450 nm处测定96孔板中样品的吸光度。

【数据】NMR频率：400 MHz；温度：60°C；样品浓度：25 mg/mL（D₂O）；检测波长：450 nm

3.4 二糖分析

合成CS衍生物的二糖分析按前述方法进行[26]。简要而言，样品溶于缓冲液，用软骨素酶ABC（ChABC）在37°C消化24 h。通过煮沸终止反应，然后离心。上清液用Sephadex G-25 M柱脱盐，并使用HPLC（Shimadzu, Japan）分析。

【数据】酶：软骨素酶ABC（ChABC）；温度：37°C；时间：24 h；脱盐：Sephadex G-25 M柱；分析仪器：HPLC（Shimadzu）

3.5 细胞培养

AST和OPCs按照已报道方法分离培养[8]。简要而言，从出生后24 h的Sprague–Dawley（SD）大鼠收集大脑皮层，轻轻置于冷PBS中，用0.125%胰蛋白酶消化10 min。然后离心细胞悬液，将所得细胞沉淀重悬于DMEM中。细胞悬液在37°C孵育30 min以减少成纤维细胞。将上清液转移到预先包被PLL（0.01%）的T75培养瓶中，细胞在由89% DMEM、10% FBS和1% Pen/Strep组成的完全培养基中培养。约10天后，混合胶质细胞振荡1 h（37°C，230 rpm）以去除小胶质细胞。剩余的贴壁细胞维持在增殖培养基中，得到AST/OPCs共培养体系。

【数据】动物：出生后24 h SD大鼠；胰蛋白酶：0.125%，10 min；孵育：37°C，30 min；PLL包被：0.01%；培养基：89% DMEM + 10% FBS + 1% Pen/Strep；培养时间：约10天；振荡：37°C，230 rpm，1 h

3.6 CCK-8检测

使用CCK-8评价材料的细胞毒性。将AST/OPCs（1 × 10⁵/mL）接种到96孔板中，在37°C、5% CO₂条件下孵育使其贴壁。然后，用不同浓度（0、5、25、50、100和200 μg/mL）的DK4-OS、DK4-O,NS和DK4-NS处理细胞48 h（37°C，5% CO₂加湿环境）。随后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育1.5 h。使用SpectraMax M2酶标仪在450 nm处测定光密度（OD）。

【数据】细胞密度：1 × 10⁵/mL；处理浓度：0、5、25、50、100、200 μg/mL；处理时间：48 h；温度：37°C；CO₂：5%；CCK-8：10 μL/孔；孵育：1.5 h；检测波长：450 nm

3.7 蛋白质印迹分析

AST/OPC细胞在相同条件下培养，并用指定浓度的DK4组分处理48 h。处理后，细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解15 min。使用BSA作为标准品定量蛋白质浓度。等量蛋白质（每孔30 μg）通过8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并转移到PVDF膜（PerkinElmer, Waltham, MA, USA）上。膜用TBST缓冲液（含0.1% Tween-20的PBS中加入5%脱脂奶粉）在室温封闭1 h，然后在4°C与靶蛋白一抗孵育过夜，随后与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在室温孵育1 h。用TBST洗涤五次后，使用增强化学发光（ECL）底物显色蛋白质条带，并使用Tanon 5200 Multi化学发光成像系统（Tanon，上海，中国）成像[48,49]。

【数据】裂解时间：15 min；蛋白上样量：30 μg/孔；SDS-PAGE：8%；封闭：室温1 h；一抗孵育：4°C过夜；二抗孵育：室温1 h；洗涤：TBST×5次

3.8 统计分析

使用单因素方差分析和SPSS v.16.0软件进行统计分析。定量数据以三次重复实验的平均值±标准差表示。p值小于0.05作为差异有统计学意义的阈值（ p < 0.05， p < 0.01， p < 0.001，**** p < 0.0001，"ns"表示不显著）。

【数据】统计方法：单因素方差分析；软件：SPSS v.16.0；重复次数：3次；显著性阈值：p < 0.05

研究结果

2.1 DK4衍生物的化学表征

本研究采用微生物-化学联合策略制备了三种DK4衍生物，包括DK4-OS、DK4-O,NS和DK4-NS。在前期工作中，我们从工程化大肠杆菌K4获得了微生物来源的K4多糖[32]。通过温和酸水解去除果糖分支后，得到DK4作为软骨素类似物，并作为合成硫酸化DK4衍生物的前体（图1）。

以DK4为多糖骨架化学合成了DK4衍生物。本研究以三氧化硫-吡啶复合物为关键硫酸化试剂，可将硫酸基引入DK4链的羟基或氨基上。与基于保护的半合成方法[33]相比，该方法避免了多步保护和脱保护步骤，而酶法和化学酶法[34]通常具有更好的位置选择性，但依赖于特定的磺基转移酶和高效的PAPS供应系统[35]。DK4-OS通过在无水DMF中于室温下将DK4与吡啶-三氧化硫复合物（SO₃·py）反应制备。对于DK4-NS的合成，首先在碱性NaOH条件下对DK4进行脱乙酰化以暴露游离氨基，然后在Na₂CO₃存在下进行N-硫酸化以维持适当的碱性环境。对于DK4-O,NS，DK4首先通过H⁺型阳离子交换树脂和四丁基氢氧化铵处理转化为其四丁基铵盐，然后溶于无水DMF进行硫酸化。经过沉淀、重新溶解和进一步硫酸化，获得所需的O,N-硫酸化衍生物。所有产物均通过沉淀、透析、浓缩和冻干纯化，得到相应的硫酸化DK4衍生物。因此，本方法被选为用于比较性构效关系研究的可行策略，而非生产完全序列定义的自然结构。由于对未保护聚合物进行直接修饰可能产生异质的硫酸盐分布并影响分子量或链构象，因此使用NMR波谱、元素分析和二糖组成分析对产物进行了表征。

【数据】硫酸化试剂：SO₃·py复合物；反应溶剂：无水DMF；DK4-OS：室温反应；DK4-NS：NaOH脱乙酰+Na₂CO₃条件下N-硫酸化；DK4-O,NS：四丁基铵盐转化+两步硫酸化

#### 2.1.1 NMR波谱分析

未修饰DK4的¹H和¹³C NMR特征已在前期研究中报道[26]。因此，这里仅简要总结主要信号归属，为与硫酸化DK4衍生物的比较提供结构基线。GlcA和GalNAc残基分别标记为A和B。所有样品均显示位于3.50–5.20 ppm范围内的特征性质子信号模式。约2.32 ppm处的信号归属于GalNAc的乙酰氨基甲基质子（图2a）。对于DK4，3.60–4.30 ppm范围内的信号归属于GlcA的H2、H3、H5和GalNAc的H6[32]。

O-硫酸化通常会改变取代位置及其附近质子的化学环境，相应的共振通常出现在3.90–4.80 ppm范围内[36]。在DK4-OS和DK4-O,NS的¹H NMR谱中，4.48和4.53 ppm处的信号分别归属于B66S和B46S[26]。同时，DK4-OS和DK4中约2.32 ppm处的N-乙酰甲基质子信号仍然清晰可检测，表明修饰后N-乙酰结构基本保留。相比之下，DK4-NS和DK4-O,NS中约2.32 ppm处的N-乙酰甲基信号显著减弱。

在DK4的谱图中，4.80和4.85 ppm处的信号分别归属于GlcA的H1和GalNAc的H1。化学修饰后，DK4-O,NS的B1信号移至4.90 ppm，而DK4-OS和DK4-NS的变化较小，B1信号分别移至4.87和4.86 ppm。这些结果表明三种硫酸化DK4衍生物的主要多糖骨架在化学修饰后基本保留，而观察到的化学位移变化反映了硫酸基引入引起的糖残基局部化学环境的改变。

结构通过¹³C NMR波谱进一步验证，如图2b所示。23.0 ppm处的信号与GalNAc单元的乙酰氨基甲基碳相关，标记为B2″。175.3和174.7 ppm处的信号分别与GlcA（A6）和GalNAc（B2′）单元的羰基碳相关。与DK4相比，硫酸化后DK4衍生物表现出相似的¹³C NMR谱图轮廓，表明软骨素骨架保存良好。GalNAc的C-4和C-6位被确定为主要硫酸化位点[37]。对于DK4-O,NS，约174.7 ppm处N-乙酰羰基碳信号的缺失表明GalNAc残基成功脱乙酰化。

基于我们先前对硫酸软骨素A、C和E的NMR分析[26]，DK4-OS谱图中67.9 ppm处的峰被初步归属于GalNAc6S（B66S）。GalNAc残基的硫酸化似乎增加了其局部化学环境的异质性，导致若干碳共振出现部分分裂或加宽。对于DK4-OS，67.9和61.5 ppm处的分裂信号分别对应于GalNAc6S（B66S）和GalNAc4S（B64S）。80.4和80.7 ppm处的分裂信号分别与GalNAc6S（B36S）和GalNAc4S（B34S）一致。101.2和101.6 ppm处的峰分别与GalNAc4S和GalNAc6S的异头C1信号一致。104.4 ppm处的峰与GlcA残基的C1（A14S）一致。

因此，基于¹H和¹³C NMR分析，DK4-OS以C4和C6位硫酸化的GalNAc残基为主要组分，而DK4-O,NS主要以GalNAc的C6位O-硫酸化以及部分N-硫酸化为特征。在DK4-NS中，与DK4相比，约174.7 ppm处N-乙酰羰基碳信号减弱，表明发生了部分脱乙酰化并随后进行N-硫酸化，提示仅部分GalNAc残基被N-硫酸化。此外，所有三种衍生物均保留了DK4骨架的特征碳信号，证明衍生化过程中多糖骨架基本保持完整。

【数据】¹H NMR范围：3.50–5.20 ppm；N-乙酰甲基质子：约2.32 ppm；O-硫酸化共振范围：3.90–4.80 ppm；DK4-OS中B66S：4.48 ppm；B46S：4.53 ppm；DK4-O,NS的B1：4.90 ppm；DK4-OS的B1：4.87 ppm；DK4-NS的B1：4.86 ppm；¹³C NMR：B2″ 23.0 ppm；A6 175.3 ppm；B2′ 174.7 ppm；B66S 67.9 ppm；B64S 61.5 ppm；B36S 80.4 ppm；B34S 80.7 ppm；GalNAc4S C1 101.2 ppm；GalNAc6S C1 101.6 ppm；A14S 104.4 ppm

#### 2.1.2 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析

如图3所示，FTIR光谱为DK4的成功硫酸化提供了进一步证据。3200–3600 cm⁻¹处的宽吸收带归属于O−H伸缩振动，而约2910 cm⁻¹处的吸收带归属于不对称C−H伸缩振动。1614和1540 cm⁻¹处的吸收带归属于GalNAc残基的−CO−NH基团。1032 cm⁻¹处的强吸收带归属于C−O和C−O−C键的骨架振动。与DK4相比，DK4-OS、DK4-NS和DK4-O,NS在约1240 cm⁻¹处表现出明显的吸收带，对应于硫酸基的S=O伸缩振动。此外，三种衍生物在800–820 cm⁻¹区域观察到的增强吸收带可归属于C−O−S伸缩振动。对于DK4-NS和DK4-O,NS，与DK4相比酰胺相关吸收带强度降低，表明脱乙酰化后形成了N-硫酸化结构。因此，FTIR、¹H NMR和¹³C NMR结果证明通过化学修饰成功获得了O-硫酸化、N-硫酸化和O,N-硫酸化的DK4衍生物，同时主要多糖骨架基本保留。

【数据】O−H伸缩：3200–3600 cm⁻¹；C−H伸缩：约2910 cm⁻¹；−CO−NH：1614和1540 cm⁻¹；C−O/C−O−C骨架振动：1032 cm⁻¹；S=O伸缩：约1240 cm⁻¹；C−O−S伸缩：800–820 cm⁻¹

#### 2.1.3 元素分析

DK4由重复的GlcA−GalNAc二糖单元组成，分子式为C₁₄H₂₁NO₁₁，理论N/C摩尔比约为1:14[26]。不同硫酸软骨素衍生物的元素分析结果如表1所示。四种样品中N/C摩尔比约为1:12.5–1:13.5（原文此处数据被截断，具体数值未完整呈现）。元素分析结果与NMR和FTIR数据共同证实了硫酸基的成功引入。

【数据】DK4分子式：C₁₄H₂₁NO₁₁；理论N/C摩尔比：约1:14

2.2 硫酸化DK4衍生物对AST/OPCs细胞活力的影响

采用CCK-8法评价了三种硫酸化DK4衍生物对AST/OPCs细胞活力的影响。如图5所示，在0–200 μg/mL浓度范围内处理48 h后，不同浓度的DK4-OS、DK4-NS和DK4-O,NS对AST/OPCs的细胞活力均未产生显著的细胞毒性效应。细胞活力在各处理组中均保持在较高水平，表明这些硫酸化衍生物在该浓度范围内具有良好的生物相容性。

【数据】处理浓度：0、5、25、50、100、200 μg/mL；处理时间：48 h；检测方法：CCK-8（450 nm）

2.3 Western blotting分析

通过Western blotting分析了硫酸化DK4衍生物对AST/OPCs中RhoA、ROCK1和MBP蛋白表达水平的影响。如图6a所示，用DK4-OS、DK4-NS和DK4-O,NS刺激AST/OPCs 48 h后，三种蛋白的表达水平发生了差异性变化。图6b–d分别展示了RhoA、ROCK1和MBP相对蛋白水平的定量分析结果。统计分析显示，不同硫酸化模式的DK4衍生物对RhoA/ROCK1通路和MBP表达的调控存在显著差异（ p < 0.05， p < 0.001，** p < 0.0001，"ns"表示不显著）。

【数据】处理时间：48 h；蛋白：RhoA、ROCK1、MBP；显著性： p < 0.05， p < 0.001，** p < 0.0001

讨论与解读

本研究通过化学硫酸化策略，以微生物来源的DK4多糖为骨架成功合成了三种具有不同硫酸化模式的衍生物。NMR和FTIR分析证实，O-硫酸化主要发生在GalNAc的C4和C6位，N-硫酸化则需要先经过碱性脱乙酰化暴露氨基。三种衍生物的多糖骨架在修饰后均基本保留，这为后续构效关系研究提供了结构基础。生物活性评价表明，不同硫酸化模式的衍生物对胶质细胞中RhoA/ROCK1通路和MBP表达的调控存在差异，提示硫酸化模式可能影响神经胶质细胞的功能状态。

与基于保护的半合成方法相比，本方法避免了繁琐的保护/脱保护步骤，操作简便且产率可观。但直接对未保护聚合物进行修饰可能导致硫酸基分布不均一，且难以精确控制取代位置和程度。此外，硫酸化可能影响多糖的分子量和链构象，这些因素对生物活性的贡献尚需进一步解析。未来研究可结合化学酶法或选择性保护策略，以获得结构更均一的硫酸化衍生物，从而更精确地阐明硫酸化模式与神经功能之间的构效关系。

编译者解读

从合成生物学应用角度看，本研究体现了"微生物发酵产多糖前体+化学定点修饰"的联合策略——利用工程化大肠杆菌K4高效生产天然多糖骨架，再通过化学手段赋予其多样的硫酸化模式。这一思路规避了化学全合成硫酸软骨素的复杂步骤，也弥补了酶法依赖磺基转移酶和PAPS供应的瓶颈。但值得关注的是，化学硫酸化的位置选择性仍有限，产物为异质混合物，可能影响生物活性数据的解读。若能将此策略与酶法区域选择性硫酸化结合，或利用代谢工程在体内直接合成特定硫酸化模式的CS，将有望实现更精准的构效关系解析。本研究为神经修复相关CS衍生物的理性设计提供了有价值的参考。

参考来源

Wang Y, Chen Y, Qiu M, Xu S. Chemical Synthesis and Biological Evaluation of Sulfated DK4 Derivatives from Escherichia coli K4 Polysaccharide. Molecules. PMID: 42588567.

PMID: 42588567