来源：Heterologous Expression of Thanatin Using Dual Transposon System in Saccharomyces cerevisiae.（Biology (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
细菌耐药性已成为全球公共卫生的重大威胁，亟需开发新型抗菌药物。Thanatin是一种源自昆虫血淋巴的21氨基酸阳离子抗菌肽，对多种革兰氏阴性和阳性菌具有强效杀灭作用，但其高效低成本生产仍是难题。本研究利用Ty2反转录转座子和PiggyBac转座子系统，将thanatin基因稳定整合至酿酒酵母CENPK2基因组中，实现了抗菌肽的分泌表达。工程菌株发酵上清液对四种致病菌均表现出显著抑制效果，且不损伤兔红细胞，为抗菌肽的绿色低成本生产提供了新路径。
研究背景
抗菌肽（AMPs）是先天免疫系统的重要效应分子，通过多种机制对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、寄生虫及病毒表现出广谱活性，被视为应对全球抗生素耐药性危机的候选药物。Thanatin（GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM）是首个从蝽科昆虫Podisus maculiventris免疫血淋巴中分离的含21个氨基酸的抗菌肽，其β-发夹结构由Cys11和Cys18之间的单个二硫键稳定。Thanatin通过靶向革兰氏阴性菌LPS转运系统中的关键周质蛋白LptA和 outer membrane 蛋白LptD发挥抗菌作用。然而，thanatin的传统生产途径——化学合成或大肠杆菌/毕赤酵母异源表达——存在成本高、内毒素污染风险等问题。酿酒酵母作为GRAS（公认安全）微生物，具有发酵条件简单、无内毒素污染、遗传工具丰富等优势，是抗菌肽异源生产的理想宿主。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养基
菌株材料：大肠杆菌Top10用于质粒构建；酿酒酵母CENPK2作为实验宿主菌株；大肠杆菌O157:H7（ATCC K88）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 9027）、维氏气单胞菌JL-2（ATCC 13124）和鲍曼不动杆菌（ATCC 19606）用于抗菌活性测定。
质粒载体：pUC57、pESCgp04-HIS和pBluescript作为克隆载体，pESC-LEU提供LEU2筛选标记。
酵母培养基：YPD培养基含10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖；固体培养基另加20 g/L琼脂。
细菌培养基：大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌和维氏气单胞菌JL-2使用LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨、10 g/L NaCl）；固体培养基加20 g/L琼脂。鲍曼不动杆菌使用TSB培养基（17.0 g/L胰酶消化酪蛋白胨、3.0 g/L大豆蛋白胨、5.0 g/L NaCl、2.5 g/L葡萄糖、2.5 g/L磷酸氢二钾）；固体培养基加20 g/L琼脂。
试剂来源：限制性内切酶购自New England Biolabs（NEB，美国马萨诸塞州伊普斯威奇）；质粒提取试剂盒购自Genstar（中国北京）；其他化学试剂均为分析纯。本研究所用引物列于表S1。
【数据】培养基成分：YPD（10 g/L酵母提取物+20 g/L蛋白胨+20 g/L葡萄糖）；LB（5 g/L酵母提取物+10 g/L蛋白胨+10 g/L NaCl）；TSB（17.0 g/L酪蛋白胨+3.0 g/L大豆蛋白胨+5.0 g/L NaCl+2.5 g/L葡萄糖+2.5 g/L磷酸氢二钾）；琼脂：20 g/L
2.2 合成Thanatin
合成thanatin（纯度>95%）购自南京Synpeptide有限公司。
【数据】合成肽纯度：>95%；供应商：Synpeptide Co., Ltd.（南京）
2.3 表达载体设计与构建
载体构建需准备以下关键模块：启动子TEF1和TDH3、α-因子信号肽、ADH1终止子。筛选标记URA3和LEU2各融合CL1降解信号。目标基因由两个串联thanatin序列组成，其间通过肠激酶切割位点连接。所有遗传元件均使用含同源重组序列的引物进行PCR扩增，PCR产物经胶回收后用于Gibson组装。thanatin异源表达盒示意图见图2A。
#### 2.3.1 基于Ty2反转录转座子的载体构建
Ty反转录转座子序列已被广泛用作酵母异源基因表达的整合位点。本研究根据Jérôme Maury等人定义的酿酒酵母Ty2共有序列设计引物Ty2-ITR-F和Ty2-ITR-R。以酿酒酵母CENPK2基因组DNA为模板扩增Ty2长末端重复序列（LTR）。随后用两对引物（Ty2-upstream-F(Gib)/Ty2-upstream-R(Gib)和Ty2-downstream-F(Gib)/Ty2-downstream-F(Gib)）对获得的LTR片段进行扩增，分别生成上游和下游同源臂。
随后进行重叠PCR，将KlURA3-CL1插入上下游同源臂之间，融合片段通过Gibson组装连接至线性化pUC57骨架，获得通用整合质粒pUC57-Ty2-KlURA3-CL1。
依次组装启动子、α-因子信号肽、串联thanatin基因和终止子构建表达盒。该表达盒用引物pTEF1-F(Gib)和tADH1-R(Gib)扩增后，通过Gibson组装插入线性化pUC57-Ty2-KlURA3-CL1质粒的5′上游同源臂与KlURA3基因之间，生成最终重组表达质粒pUC57-Ty2-thanatin（图2B）。
【数据】模板：酿酒酵母CENPK2基因组DNA；整合位点：Ty2 LTR；筛选标记：KlURA3-CL1；组装方法：Gibson assembly
#### 2.3.2 基于PiggyBac转座子的载体构建
pESCpg04-PiggyBac转座酶质粒构建：为构建PiggyBac转座酶表达载体，使用引物Tpos-F(Gib)和Tpos-R(Gib)从含有Corey Brizzee等人所述序列的质粒中PCR扩增超活性PiggyBac转座酶编码序列。所得PCR产物通过Gibson组装插入pESCgp04-HIS载体，组装质粒转化感受态细胞，获得重组质粒pESCgp04-HIS-PiggyBac转座酶（图2C）。
pBluescript-PiggyITR-Thanatin构建：对于PiggyBac反向末端重复序列（ITR）构建，分别以合成基因片段为模板，使用引物PB-3′ITR-F(Gib)/PB-3′-ITR-R(Gib)和PB-5′ITR-F(Gib)/PB-5′-ITR-R(Gib)扩增3′ITR+绝缘子和5′ITR+绝缘子片段。ITR序列对转座酶识别和转座至关重要，绝缘子片段可增强转座稳定性和表达效率。为构建最终表达质粒，首先通过重叠PCR将LEU2-CL1片段插入PiggyBac转座子的上下游同源臂之间。融合片段随后通过Gibson组装连接至线性化pBluescript骨架，获得通用整合质粒pBluescript-PiggyBac-LEU2-CL1。
依次组装启动子、α-因子信号肽、串联thanatin基因和终止子构建表达盒，生成三个表达盒（Than1、Than2和Than3）。Than1插入5′ITR同源臂与LEU2-CL1之间，Than2和Than3插入线性化pBluescript-PiggyBac质粒的LEU2-CL1与3′ITR同源臂之间，通过Gibson组装获得重组表达质粒pBluescript-PiggyBac-thanatin（图2D）。
【数据】转座酶：超活性PiggyBac转座酶；ITR：3′ITR+绝缘子、5′ITR+绝缘子；筛选标记：LEU2-CL1；组装方法：Gibson assembly
2.4 酵母转化与Thanatin生产
酿酒酵母CENPK2感受态细胞采用醋酸锂法制备。构建Ty2系统菌株时，将1 µg线性化pUC57-Ty2-thanatin转化至CENPK2感受态细胞。构建PB系统菌株时，将1 µg线性化pBluescript-PiggyBac-thanatin和1 µg pESCgp04-HIS-PiggyBac转座酶共转化至CENPK2感受态细胞。构建双系统（Ty2+PB）菌株时，将上述质粒共转化至预先制备的Ty2转化株感受态细胞。每次转化中，将DNA混合物加入100 µL感受态细胞，同时加入5 µL鲑鱼精DNA和500 µL PEG/LiAc溶液。42°C热激15分钟后，细胞恢复培养并涂布于缺乏组氨酸和亮氨酸的合成完全培养基（SC-His-Leu）或缺乏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸的培养基（SC-Ura-His-Leu）。阳性转化子在29°C培养2–4天后筛选。
发酵时，将经确认的转化子单菌落接种至YPD肉汤中，29°C、220 rpm振荡过夜培养。然后将过夜培养物以初始OD600=0.1接种至100 mL新鲜YPD培养基，29°C、220 rpm培养5天。每24小时测定OD600监测细胞生长。所有发酵均设三个独立生物学重复（n=3）。数据以平均值±标准差（SD）表示。不同菌株间细胞生长的统计比较采用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey事后检验，p值<0.05认为差异有统计学意义。培养上清液通过4°C、12,000×g离心10分钟收集，−20°C保存备用。
【数据】转化量：1 µg线性化质粒；感受态细胞体积：100 µL；鲑鱼精DNA：5 µL；PEG/LiAc：500 µL；热激：42°C，15 min；培养温度：29°C；筛选时间：2–4天；发酵体积：100 mL；初始OD600：0.1；转速：220 rpm；发酵时间：5天；离心：4°C，12,000×g，10 min
2.5 转化株摇瓶发酵
阳性菌落划线于YPD平板活化。单菌落接种YPD肉汤过夜培养。对于携带Ty2系统、PB系统或双系统的转化株，将1%（v/v）过夜种子培养物接种至100 mL YPD培养基，29°C、220 rpm振荡培养5天。每24小时测定OD600以评估不同转座子系统对生长的影响。
【数据】接种量：1%（v/v）；培养基：100 mL YPD；温度：29°C；转速：220 rpm；时间：5天；OD600检测间隔：24 h
2.6 Tris-Tricine-SDS-PAGE分析
发酵液离心（4°C，12,000 rpm，10 min），上清液在相同条件下再次离心。取500 μL上清液用3 kDa截留分子量超滤管浓缩至100 μL。
【数据】离心：4°C，12,000 rpm，10 min（两次）；浓缩体积：500 μL→100 μL；截留分子量：3 kDa
研究结果
3.1 重组Thanatin在酿酒酵母中的表达
将质粒pUC57-Ty2-thanatin转化至CENPK2，转化子在SC-Ura平板上筛选。经PCR验证的阳性转化子命名为Ty2整合菌株（Ty2）。将pESCgp04-HIS-PiggyBac转座酶和pBluescript-PiggyBac-thanatin分别共转化至CENPK2和Ty2菌株，在SC-His-Leu和SC-Ura-His-Leu平板上筛选。阳性转化子经PCR验证后命名为PB整合菌株（PB）和双整合菌株（PB+Ty2）。这些结果表明，PB系统和Ty2/PB组合转座子系统均可高效导入酿酒酵母，为thanatin异源表达提供了可靠平台。重组菌株的PCR验证结果见图3。
【数据】筛选培养基：SC-Ura、SC-His-Leu、SC-Ura-His-Leu；验证方法：PCR
#### 3.1.1 Tris-Tricine-SDS-PAGE与LC-MS/MS鉴定结果
如图4所示，与CENPK2对照相比，PB、Ty2和PB+Ty2菌株的浓缩发酵上清液中检测到一条4至8 kDa之间的额外蛋白条带。单体thanatin的理论分子量约为2.4 kDa。本研究表达的是2×thanatin构建体（两份拷贝通过肠激酶切割位点连接），预期分子量约为5.4 kDa。凝胶上观察到的8 kDa条带可能反映表达肽的翻译后修饰或聚集。观察到的条带与预期值一致，表明目标肽成功分泌至培养基中，有利于下游纯化和应用。
值得注意的是，表达盒含有LEU2-CL1融合筛选标记，该设计理论上可通过反向筛选富集多拷贝整合子。实践中，所有工程菌株均表现出稳健生长（图7），并成功将thanatin分泌至上清液中。这些结果表明基于CL1的筛选策略可有效支持高产发酵且不损害宿主适应性。在应用方面，该方法可直接纳入工业生产菌株工程流程——高拷贝数和宿主活力两者缺一不可。
如图5、图6和图7所示，对Ty2、PB和PB+Ty2菌株目标条带的LC-MS/MS分析鉴定出thanatin特异性肽序列（Ty2和PB：GSKKPVPIIYCNR；PB+Ty2：GSKKPVPIIYCNRRT）。这些数据证实thanatin衍生肽在三种工程菌株中均成功表达。高分辨率质谱检测到这些特异性序列为thanatin基因盒的表达提供了证据，支持基于转座子的肽表达策略的可靠性。
【数据】目标蛋白分子量：单体约2.4 kDa，二聚体约5.4 kDa；凝胶条带：4–8 kDa；LC-MS/MS鉴定序列：Ty2/PB为GSKKPVPIIYCNR，PB+Ty2为GSKKPVPIIYCNRRT
#### 3.1.2 不同转座子系统及Thanatin表达对酵母生长的影响
CENPK2、Ty2、PB和PB+Ty2菌株在YPD培养基中的生长曲线如图8所示。所有菌株表现出相似的生长趋势，约72小时达到最大生物量。最大OD600值分别为14.48（CENPK2）、14.77（Ty2）、14.49（PB）和14.5（PB+Ty2），表明转座子系统或thanatin表达在测试条件下均未显著影响宿主生长。这些数据证明基因修饰带来的代谢负担极小，工程菌株的生长性能与野生型宿主基本相当。从应用角度看，这种生长稳健性是发酵生产的重要特征——支持使用简单培养基和标准培养方案，有利于工艺放大。
【数据】最大OD600：CENPK2为14.48，Ty2为14.77，PB为14.49，PB+Ty2为14.5；达峰时间：约72 h
3.2 HPLC定量分析结果
采用高效液相色谱（HPLC）定量抗菌肽浓度时，首先使用重组肠激酶（P4237-1000U）切割发酵液中的串联肽，然后以化学合成抗菌肽为标准品进行定量。结果（图9B）显示，PB+Ty组发酵上清液中含thanatin嵌合肽的产量达到27.37 ± 3.52 mg/L，PB组为14.56 ± 2.18 mg/L（图9C），Ty组为20.36 ± 2.91 mg/L（图9D）。所有数值均为三个独立生物学重复的平均值。肠激酶消化后，串联肽产生两个片段，其中仅一个携带EK标签。选择无EK标签的片段作为HPLC定量的分析物。然而，由于肠激酶切割后分子质量发生变化，该方法测定的浓度可能与完整串联肽的实际浓度存在偏差。所有样品均进行三次独立重复分析，所示数据代表各实验组的平均值。
【数据】产量：PB+Ty组27.37 ± 3.52 mg/L；PB组14.56 ± 2.18 mg/L；Ty组20.36 ± 2.91 mg/L；标准品保留时间：6.297 min；样品保留时间：PB+Ty为5.703 min，PB为5.713 min，Ty为5.693 min；肠激酶：P4237-1000U
3.3 体外抗菌活性结果
浓缩发酵上清液对四种指示菌株的抗菌活性如图10所示。处理前，所有细菌培养物调整至初始OD600=0.01，工程菌株72小时培养液用新鲜YPD培养基归一化至相同OD600后再收集上清液，以确保测试的分泌产物量相当。重组肽对四种菌株均表现出抑制效果。PB组和Ty2组的抑制率高于阴性对照，证实了肽的功能性异源表达。
这些结果表明异源表达的thanatin衍生肽对四种测试病原体均具有活性。从转化应用角度看，该方法可作为提高酵母中抗菌肽产量的策略加以探索，为制药或食品保鲜领域更高效的生产提供途径。
浓缩发酵上清液和合成thanatin标准品对四种指示菌株的MIC和MBC值见表1。与thanatin标准品相比，四种浓缩发酵上清液的MIC和MBC值均出现一定程度的升高，这可能归因于发酵上清液中异源表达的肽是由两个thanatin部分和一个EK标签组成的嵌合肽，而非天然单体肽。值得注意的是，部分发酵上清液样品对某些指示菌株的MIC和MBC值无法检测，推测是因为发酵液中目标肽浓度低于这些菌株的MIC/MBC检测阈值。CENPK2对四种指示菌株均未表现出可检测的MIC或MBC值。
【数据】初始菌液OD600：0.01；测试菌株：大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、维氏气单胞菌JL-2、鲍曼不动杆菌；统计显著性：**表示p<0.01，*表示p<0.05
3.4 SEM观察
SEM图像显示，未经处理的细菌细胞表面光滑完整。相比之下，经PB+Ty2菌株浓缩发酵上清液处理的细菌表现出显著的形态学改变，包括表面粗糙化、内陷、孔洞形成和细胞裂解（图11）。SEM数据为定性性质，不提供定量测量。
这些观察结果证实发酵上清液对细菌细胞包膜造成严重损伤，与某些抗菌肽的膜破坏效应一致。然而，thanatin通过靶向该必需转运机器中的LptA和LptD发挥抗菌活性，从而破坏LPS运输和外膜生物发生，而非直接裂解膜。观察到的形态学变化可能代表——
【数据】观察方法：SEM；处理组：PB+Ty2浓缩发酵上清液；表型变化：表面粗糙化、内陷、孔洞形成、细胞裂解
3.5 体外溶血试验结果
【数据】红细胞来源：兔；检测方法：体外溶血试验
讨论与解读
本研究利用Ty2和PiggyBac转座子系统在酿酒酵母CENPK2中成功构建了thanatin异源表达体系，获得了携带单一系统或双系统组合的工程菌株。该基于转座子的平台可实现稳定的基因组整合，避免了游离质粒系统常见的不稳定性。Thanatin此前主要通过化学合成或在大肠杆菌和毕赤酵母中异源表达生产。本研究开发的酿酒酵母系统具有多项独特优势：GRAS地位、发酵要求简单、无内毒素污染、遗传工具丰富。双系统菌株在发酵上清液中的thanatin产量达到27.37 ± 3.52 mg/L，表明酿酒酵母是一种值得深入研究的可行替代方案。然而，酿酒酵母也存在局限性，包括蛋白分泌能力通常低于毕赤酵母，以及发酵过程中酵母蛋白酶可能降解分泌肽——这些问题可在未来研究中通过蛋白酶缺陷型宿主菌株加以解决。Tris-tricine-SDS-PAGE和LC-MS/MS分析确认了thanatin衍生肽成功表达并分泌至培养基中。在相同培养条件下，Ty菌株的生长曲线——
【数据】最高产量：27.37 ± 3.52 mg/L（PB+Ty双系统）
编译者解读：本研究巧妙地将两种转座子系统——Ty2反转录转座子和PiggyBac转座子——组合应用于酿酒酵母中抗菌肽的异源表达，这种"双系统叠加"策略在合成生物学中具有方法论价值。双系统菌株产量最高（27.37 mg/L），提示不同转座子整合位点的叠加可能产生协同效应。值得注意的是，作者采用CL1降解信号融合筛选标记的设计，理论上可通过反向筛选富集多拷贝整合子，这是提升产量的潜在杠杆点。然而，当前产量仍低于毕赤酵母系统的报道水平，且嵌合肽构型（二聚体+EK标签）对MIC/MBC值的影响需进一步优化。未来若能在蛋白酶缺陷菌株中表达并优化肠激酶切割效率，该平台有望成为抗菌肽工业化生产的实用方案。
参考来源
Li S, Song J, Sun B, Liu K, Li R. Heterologous Expression of Thanatin Using Dual Transposon System in Saccharomyces cerevisiae. Biology (Basel). PMID: 42589177.
PMID: 42589177