来源：Synthesis of methyldopa-copper nanoparticles with laccase mimics activity for colorimetric detection of norepinephrine.（Sci Rep）| 编译：DNA Lab Space
导读
天然漆酶在环境修复和生物传感中应用广泛，但稳定性差、成本高。本研究以甲基多巴为仿生双齿配体，合成了聚甲基多巴-铜纳米颗粒（PMD-Cu NPs），在近生理条件下展现出类漆酶催化活性，可在无外加氧化剂条件下氧化去甲肾上腺素并产生比色信号。动力学分析显示Km=45.0 µM、Vmax=5.0 µM/min，催化性能优于多数已报道的铜基儿茶酚纳米酶。该平台兼具催化降解与定量检测双重功能，并通过EPPI和BAGI工具验证了其绿色分析特性。
研究背景
纳米酶作为模拟生物酶的催化平台，相比天然酶具有制备简便、功能可调、稳定性强等优势。在各类纳米酶中，铜基漆酶模拟物因能通过分子氧氧化酚类和儿茶酚底物而备受关注，其在生物传感、污染物降解和绿色化学领域具有应用潜力。漆酶模拟物不产生过氧化氢等有害中间体，特别适合环境芳香族污染物的降解。
然而，现有铜基纳米酶大多采用多巴胺、没食子酸或单宁酸等简单儿茶酚衍生物作为配体，仅提供氧供体配位。这种化学设计对铜的氧化还原环境控制有限，导致Cu(I)/Cu(II)循环不稳定、耐久性差。本研究引入甲基多巴作为仿生双齿配体，其儿茶酚-胺双官能团结构能更精确地模拟天然多铜氧化酶的配位环境，实现对铜氧化还原循环的电子调控，从而增强底物亲和力和热稳定性。
研究方法
分析设备与软件工具
所制备纳米材料的物理和元素特征使用扫描电子显微镜（SEM）及能量色散X射线光谱（EDX）检测，均在Quanta FEG-250系统上完成；高分辨透射电子显微镜（HRTEM）使用JEM-2100 HRT仪器（JEOL，日本）。所有离心操作使用PrO-Research台式冷冻离心机（Centurion Scientific Ltd.，英国），转速范围500至15,000 rpm。官能团分析和化学键合信息通过FT-IR光谱法获得，使用Shimadzu IR 435设备。结晶性和物相组成的结构信息通过X射线衍射（XRD）采集，使用Rigaku Smart Lab系统。PMD-Cu NPs的热稳定性通过热重分析（TGA）评估，使用Shimadzu TGA-50仪器（京都，日本）。粒径分布通过动态光散射（DLS）分析评估，使用Malvern Instruments（英国）的Zetasizer Nano-ZS。X射线光电子能谱使用配备单色Al Kα辐射源（1486.6 eV）的XPS仪器进行，以研究样品表面元素组成和电子结构。光学吸光度数据使用SHIMADZU UV-1900i分光光度计（京都，日本）获得，配备双光束装置并通过UV Probe软件（版本2.43）控制。测量使用1 cm石英比色皿，光谱分辨率1 nm，扫描速度2800 nm/min。
【数据】离心转速范围：500–15,000 rpm；XPS激发源：Al Kα 1486.6 eV；光谱分辨率：1 nm；扫描速度：2800 nm/min
材料与试剂
合成和分析所需材料均购自认证供应商，未经进一步纯化直接使用。甲基多巴（98%）、无水硫酸铜（99%）和去甲肾上腺素（NE）（98%）购自Sigma-Aldrich（美国）。氢氧化钠（98%）、盐酸（37% w/w）和磷酸二氢钠（99%）由Bio-chem（埃及）供应。缓冲溶液配制使用0.02 M磷酸二氢钠溶液作为基底，用NaOH在持续搅拌下逐步滴定将pH精确调至6.0，使用pH玻璃电极（Jenway，英国）确保均匀性。所有试剂均为分析纯，并按标准实验室规程处理。
【数据】甲基多巴纯度：98%；硫酸铜纯度：99%；NE纯度：98%；NaOH纯度：98%；HCl浓度：37% w/w；磷酸二氢钠纯度：99%；缓冲液浓度：0.02 M；缓冲液pH：6.0
标准溶液配制
#### 去甲肾上腺素标准溶液的制备
NE储备液以1.0 mg/mL的浓度配制，将适量NE溶解于蒸馏水中。
【数据】NE储备液浓度：1.0 mg/mL；溶剂：蒸馏水
PMD-Cu NPs的合成
PMD-Cu NPs按照已建立的文献方法合成，以确保可重复性和结构完整性。制备PMD-Cu NPs时，先分别配制两种溶液：一种含甲基多巴，浓度0.5 mg/mL；另一种含五水硫酸铜，甲基多巴与铜的质量比为2:1。将两种溶液等体积混合，用校准的数字pH计（Jenway，英国）将混合物pH精确调至7.06 ± 0.05。系统在室温下持续搅拌24小时，使甲基多巴单元与铜离子之间有效配位。在近中性条件和延长反应时间下，甲基多巴发生自发氧化聚合，同时与Cu²⁺离子配位，此过程遵循先前报道的Cu-螯合聚多巴胺纳米酶的合成方法。因此，所得材料被命名为聚甲基多巴-铜纳米颗粒（PMD-Cu NPs）。
反应结束后，通过12,000 rpm离心10分钟分离所得纳米颗粒。固体产物用去离子水洗涤三次，确保去除残留离子和未结合组分。
【数据】甲基多巴浓度：0.5 mg/mL；甲基多巴:铜质量比：2:1；反应pH：7.06 ± 0.05；反应温度：室温；反应时间：24 h；离心转速：12,000 rpm；离心时间：10 min；洗涤次数：3次（去离子水）
PMD-Cu NPs的结构与分析评价
为研究合成的PMD-Cu NPs的物理化学性质，采用了一系列表征工具。使用扫描电子显微镜和高分辨透射电子显微镜（HRTEM）进行形貌观察，以考察颗粒形态和表面结构。通过EDX分析确定元素分布和组成，确认铜与甲基多巴组分的整合。FTIR光谱提供了框架内键合环境的信息，识别了参与金属-配体配位的官能团。通过XRD评估结晶性和物相纯度，揭示合成材料的结构特征。XPS测量验证了铜的存在并阐明其氧化态，直接提供了表面化学信息，确认了铜配位纳米酶的成功形成。热行为（包括分解模式）通过可控加热条件下的热重分析评估。紫外-可见光谱也被用于检查可能影响氧化还原行为的电子跃迁。这种多技术评估对于确定材料的特性及其作为稳定功能性纳米酶的潜力至关重要。
【数据】表征手段：SEM、HRTEM、EDX、FTIR、XRD、XPS、TGA、UV-Vis
PMD-Cu NPs氧化催化性能研究
以NE为模型底物检验所合成PMD-Cu NPs的类漆酶氧化行为。总反应体积3.0 mL，将10.0 µL Cu-甲基多巴悬浮液（1.0 mg/mL）与24.0 µL NE溶液混合，用磷酸盐缓冲液（pH调至6.0）补足体积。混合物在40 °C孵育10分钟，使催化氧化充分进行。孵育后收集紫外-可见吸光度读数以监测产物生成。为确认PMD-Cu NPs的特异性催化作用，在相同条件下进行了不含催化剂的平行试验。所有实验均进行三次重复（n=3），结果以平均值±标准差（SD）表示。
【数据】反应总体积：3.0 mL；催化剂用量：10.0 µL（1.0 mg/mL）；NE用量：24.0 µL；缓冲液pH：6.0；反应温度：40 °C；反应时间：10 min；重复次数：n=3
pH对PMD-Cu NPs催化效率的影响
pH对PMD-Cu NPs催化功能的调节作用通过在受控缓冲条件下引发氧化反应来评估。取等体积（各50.0 µL）的PMD-Cu NPs分散液（1.0 mg/mL）和NE溶液，用相同磷酸盐缓冲液（pH 6.0）将总体积调至3.0 mL。反应在40 °C下孵育30分钟。孵育后测量吸光度以评估底物氧化程度，从而反映纳米酶的pH敏感性。
【数据】催化剂用量：50.0 µL（1.0 mg/mL）；NE用量：50.0 µL；总体积：3.0 mL；缓冲液pH：6.0；反应温度：40 °C；反应时间：30 min
PMD-Cu NPs在底物氧化中的温度响应
为探索PMD-Cu NPs的热稳定性和活性窗口，在一系列温度下进行NE氧化反应。将催化剂（50.0 µL，1.0 mg/mL）和NE（100.0 µL）加入700.0 µL pH 6.0磷酸盐缓冲液中。组装好的混合物在30 °C至90 °C的不同温度下孵育30分钟。孵育后使用紫外-可见光谱评估产物生成。
【数据】催化剂用量：50.0 µL（1.0 mg/mL）；NE用量：100.0 µL；缓冲液体积：700.0 µL（pH 6.0）；温度范围：30–90 °C；孵育时间：30 min
去甲肾上腺素氧化速率监测
为追踪PMD-Cu NPs催化的NE氧化进程，制备含50.0 µL催化剂（1.0 mg/mL）和50.0 µL NE的反应体系，用pH 6.0磷酸盐缓冲液补足体积。反应在40 °C下进行，每5分钟收集等分试样，持续60分钟。每个样品立即通过紫外-可见分光光度法分析以监测吸光度变化，从而绘制反应动力学曲线。
【数据】催化剂用量：50.0 µL（1.0 mg/mL）；NE用量：50.0 µL；缓冲液pH：6.0；反应温度：40 °C；采样间隔：5 min；总监测时间：60 min
使用PMD-Cu NPs定量检测去甲肾上腺素
为建立NE浓度与光学信号之间的关系，使用不同体积的NE储备液（50.0 µM）进行比色测定。
【数据】NE储备液浓度：50.0 µM
研究结果
热稳定性与粒径分析
甲基多巴-Cu纳米颗粒（PMD-Cu NPs）的热行为通过热重分析（TGA）和微分热重（DTG）检测，如图1a所示。TGA曲线（蓝色）显示150 °C以下的初始失重，归因于物理吸附水和残留溶剂的去除。200至450 °C之间发生主要失重，对应与Cu表面配位的甲基多巴有机层分解。DTG峰位于约400 °C附近，确认了包括芳香族和羧酸酯官能团在内的封端分子的降解。450 °C以上重量趋于稳定，直至800 °C仅略有下降，表明形成了热稳定的无机残留物，推测为加热过程中金属Cu氧化形成的CuO。总重量保持率（75–80%）表明无机（Cu基）组分含量高，确认了具有大量金属含量的纳米颗粒成功形成。
动态光散射（DLS）用于评估所合成PMD-Cu纳米颗粒在水性介质中的流体动力学特性。如图1b所示，纳米颗粒的Z-平均流体动力学直径为419.5 nm，多分散指数（PdI）为0.468。基于强度的粒径分布显示两个颗粒群体，中心分别位于约15.9和435.5 nm，表明胶体悬浮液中存在多个流体动力学群体。相应的zeta电位分析（图S1）显示表面电位为-43.0 mV，表明颗粒表面带高度负电荷，具有良好的静电胶体稳定性。完整的DLS和zeta电位报告见补充信息。
图1 (a) PMD-Cu NPs的TGA分析和(b)动态光散射（DLS）光谱。
【数据】Z-平均流体动力学直径：419.5 nm；PdI：0.468；粒径群体：约15.9 nm和435.5 nm；zeta电位：-43.0 mV；TGA失重区间：<150 °C（吸附水）、200–450 °C（有机层分解）；DTG峰：约400 °C；总重量保持率：75–80%
形貌、组成和结构表征
PMD-Cu NPs的形貌和组成通过SEM、EDX、TEM和SAED表征，如图2所示。SEM图像（图2a）显示聚集的片状结构，表面粗糙、边界不规则，这是金属-有机杂化材料的典型特征。该形貌源于干燥过程中甲基多巴封端纳米颗粒的部分堆叠或聚集。EDX光谱（图2b）显示强烈的Cu峰以及对应于甲基多巴配体的C、N和O信号，确认了有机封端分子与金属表面的成功配位。不存在额外峰表明样品纯度高且Cu离子被有效还原。TEM成像（图2c）显示分散良好的近球形纳米颗粒，平均直径范围为50至80 nm，与DLS数据一致。相对均匀的衬度和低聚集程度突出了Cu纳米颗粒与甲基多巴分子之间的强相互作用，这种相互作用阻碍了颗粒聚集。选区电子衍射（SAED）图案（图2d）显示同心衍射环，可指标化为面心立方（fcc）Cu相的（111）、（200）和（220）晶面，确认了结晶纳米颗粒核心的多晶性质。
FTIR分析（图S2a）显示，甲基多巴与Cu离子配位后其特征振动带发生明显位移，表明金属-配体相互作用成功。约3400 cm⁻¹处的宽O–H伸缩带以及归属于C=O和N–H官能团的谱带相对于游离甲基多巴在位置和强度上均发生位移，提示羟基和氨基参与了铜配位。类似的谱图变化在铜-儿茶酚配位体系中已有广泛报道。需要指出的是，直接的Cu–N伸缩振动通常出现在远红外（FIR）区域（约250–450 cm⁻¹），该区域超出本次FTIR测量的光谱范围。因此，甲基多巴与Cu离子之间的配位是通过配体振动带的系统性变化推断的，并得到XPS、XRD和EDX互补表征结果的进一步佐证。XRD分析进一步支持PMD-Cu NPs的配合物形成和结构演化。衍射图谱显示宽特征与尖锐峰的组合，表明部分结晶性。在2θ 20°至40°之间观察到的反射是含铜结晶域的特征，表明杂化结构内存在局部有序区域。未观察到对应于游离甲基多巴的衍射峰，确认其与Cu离子完全配位且配体结构发生改变。此外，金属-有机体系中常见的低角度衍射特征可能源于周期性配位基序或聚合物框架的短程有序（图S2b）。
XPS分析进一步证实了PMD-Cu NPs中铜的表面化学组成和氧化态。Cu 2p光谱的分解显示在结合能934.8 eV（Cu 2p3/2）和954.6 eV（Cu 2p1/2）处Cu²⁺占主导贡献，同时在932.6 eV和952.5 eV处存在对应Cu⁺物种的低强度组分。混合铜价态的共存以及强金属-配体相互作用支持了纳米颗粒的氧化还原活性和表面稳定性（图S3）。XPS和SAED结果之间的表观差异源于这两种技术不同的探测深度。XPS本质上是表面敏感的，因此主要检测Cu²⁺以及少量与表面氧化和聚甲基多巴基质配位相关的Cu⁺贡献。相比之下，SAED探测的是纳米颗粒的结晶内部，其衍射图案反映的是纳米颗粒核心的晶体结构。因此，综合结果与以结晶Cu核心为主、周围环绕薄氧化含铜表面层的结构一致，这是铜基纳米颗粒在环境条件下暴露时常见的结构特征。
图2 (a) SEM图像，(b) EDX光谱，(c) 显示均匀分布、纳米级尺寸的PMD-Cu NPs的TEM图像，以及(d) 显示清晰同心衍射环、确认PMD-Cu NPs多晶性质的SAED图案。
所采用的合成方案以及FTIR、XPS、TGA、XRD和EDX结果与先前报道的基于儿茶酚的聚合物纳米酶的Cu-螯合聚甲基多巴纳米颗粒的形成一致。观察到的金属-配体相互作用、配体振动带的变化、XPS揭示的混合铜氧化态以及稳定有机基质的存在共同支持了PMD-Cu杂化纳米结构的成功形成。
在确认PMD-Cu杂化纳米结构后，综合表征结果进一步表明所合成纳米颗粒具有优异的物理化学性质。TGA确认了其高热稳定性，而DLS、SEM和TEM揭示了相对均匀的粒径分布（50–80 nm）和良好的形貌均一性。SAED图案证明了纳米颗粒的多晶性质，XPS则确认了由表面氧化和强金属-配体相互作用引起的Cu²⁺和Cu⁺物种共存。综合这些发现表明，所制备的PMD-Cu纳米颗粒具有优异的结构完整性、胶体稳定性和氧化还原活性特征，使其成为催化、传感和生物电化学应用的有吸引力的候选材料。
【数据】TEM粒径范围：50–80 nm；SAED晶面：(111)、(200)、(220)；FTIR O–H伸缩带：约3400 cm⁻¹；Cu 2p3/2结合能：934.8 eV（Cu²⁺）、932.6 eV（Cu⁺）；Cu 2p1/2结合能：954.6 eV（Cu²⁺）、952.5 eV（Cu⁺）；XRD衍射区间：2θ 20–40°
PMD-Cu NPs类漆酶催化活性评估
PMD-Cu NPs的类漆酶活性以去甲肾上腺素（NE）为模型底物进行评估，因其结构中含有儿茶酚部分，是漆酶氧化的合适底物。
图3显示了PMD-Cu NPs对NE氧化的催化活性研究结果。
图4显示了在PMD-Cu NPs存在下邻苯三酚及其氧化产物的紫外-可见吸收光谱，在420.0 nm处呈现特征吸收最大值。插图为氧化前（左）和氧化后（右）反应溶液的照片，证明黄色氧化产物的形成。
图5显示了pH（a）和温度（b）对PMD-Cu NPs催化去甲肾上腺素氧化性能的影响。数据来自三次独立实验，以平均值±标准差（SD）表示（n=3）。
图6（a）显示了在优化实验条件（磷酸盐缓冲液，pH 6.0，40 °C）下PMD-Cu NPs催化的去甲肾上腺素的时间依赖性氧化。（b）为Michaelis-Menten曲线，展示初始反应速率与去甲肾上腺素浓度之间的关系。表观动力学参数为Km=45.0 µM，Vmax=5.0 µM/min。数据来自三次独立实验，以平均值±标准差（SD）表示（n=3）。
图7为PMD-Cu NPs氧化去甲肾上腺素的机理示意图。
去甲肾上腺素的比色定量检测
图8为使用PMD-Cu NPs比色测定去甲肾上腺素的校准曲线。数据来自三次独立实验，以平均值±标准差（SD）表示（n=3）。
选择性评估
图9显示了常见潜在干扰物质在相同实验条件下的紫外-可见吸收光谱，证明基于PMD-Cu NPs的比色测定法具有高选择性。干扰化合物观察到可忽略的吸光度响应，确认干扰极小。
可持续性与分析性能评估
图10为所提出的基于PMD-Cu NPs的比色传感平台的可持续性和分析性能评估。（a）环境绩效和实用性指数（EPPI）评估展示了总体可持续性得分以及样品制备、仪器、试剂、废物产生和实用性绩效指数（PPI）的各自贡献。（b）蓝色适用性等级指数（BAGI）评估展示了所开发方法的分析适用性和总体绿色度，BAGI总分为75.0，确认了其优异的实际适用性和对绿色分析化学原则的符合性。
讨论与解读
本研究成功以甲基多巴为多功能有机配体合成了PMD-Cu纳米颗粒，构建了稳健的类漆酶纳米酶。甲基多巴的配位环境通过氨基官能团提供氧化还原活性儿茶酚部分和强Cu螯合能力，使纳米酶在温和、水性、无过氧化物的条件下展现出高效的氧化酶样活性。PMD-Cu NPs催化去甲肾上腺素氧化并产生清晰可定量的比色响应，证明了其作为催化和传感平台的双重功能。
系统评估显示最佳催化活性在pH 6.0和40 °C条件下，这些条件与生物和环境系统相关。重要的是，纳米酶在宽pH范围和高达80 °C的温度下仍保持显著活性，远超天然漆酶的操作稳定性——天然漆酶通常在60 °C以上变性且仅在窄pH窗口内起作用。动力学分析显示Km=45.0 µM和Vmax=5.0 µM/min，反映了强底物亲和力和快速催化转换，与先前报道的铜基纳米酶相比具有优势。改进的动力学平衡归因于甲基多巴配体提供的酶模拟铜配位环境。
编译者解读
该研究的关键创新在于配体选择——甲基多巴的双官能团设计（儿茶酚-胺）比传统多巴胺或没食子酸配体更精确地模拟了天然多铜氧化酶的配位环境，实现了对铜氧化还原循环的电子级调控。从合成生物学应用角度看，这种"配体工程"策略为设计多功能纳米酶提供了新范式：一个分子同时承担配位、聚合、稳定和信号转导功能。值得关注的是，该平台兼具污染物降解和定量检测双重功能，契合绿色分析化学的发展方向。EPPI和BAGI评估（BAGI得分75.0）从量化角度验证了方法的环保性。局限在于当前研究仍以单一底物验证为主，其在复杂真实样品中的抗干扰能力和多底物适应性有待进一步探索。
参考来源
Mouhamed AA, Mahmoud AM, Bell JG, Hussein OG. Synthesis of methyldopa-copper nanoparticles with laccase mimics activity for colorimetric detection of norepinephrine. Sci Rep. PMID: 42469398. DOI: 10.1038/s41598-026-61978-6.
PMID: 42469398