地热泉来源的地衣芽孢杆菌OE-1所产粗纤维素酶的表征研究

来源：Characterization of crude cellulase produced by Bacillus licheniformis OE-1 from the Diyadin hot springs, Ağrı Province.（Int Microbiol）| 编译：DNA Lab Space

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导读

极端环境是发掘工业适用酶的重要资源库。本研究从土耳其阿勒省迪亚丁温泉分离得到地衣芽孢杆菌OE-1菌株，对其所产粗纤维素酶进行了系统表征。该酶最适pH 9.0、最适温度60°C，兼具嗜碱与耐热特性；以羧甲基纤维素为底物时，Vmax为2.29 U mL⁻¹，Km为0.1691 mg/mL。研究还揭示了多种化合物对该酶的抑制类型，并计算了活化能等热力学参数，为工业应用提供了基础数据。

研究背景

纤维素是地球上最丰富的生物聚合物，是植物细胞壁的主要结构成分。除植物外，藻类、被囊动物和某些细菌也能合成纤维素。化学上，纤维素是由β-D-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的同多糖，经验式为(C₆H₁₀O₅)ₙ。

耐碱耐热酶在纺织、制浆造纸、饲料和食品工业中具有重要的生物技术潜力。在纺织行业，这类酶可在生物抛光和石洗处理中减少对刺激性化学品的依赖；在制浆造纸工业中，它们促进木质纤维素结构降解，提高漂白效率并减少氯基化学品的使用；在饲料工业中，水解纤维组分的能力可增强营养消化率并改善饲料转化率；在食品工业中，热稳定酶应用于果汁澄清、降粘、增香和油脂提取等过程，可缩短加工时间并提高产品质量。在此背景下，微生物纤维素酶因在木质纤维素生物质可持续转化为高附加值产品中的核心作用而备受关注。

研究方法

材料

Sephadex G-100、电泳试剂、银染化学品、甘氨酸-NaOH缓冲液、磷酸钠缓冲液、二硝基水杨酸（DNS）、酒石酸钾钠、考马斯亮蓝G-250试剂及葡萄糖均购自Sigma-Aldrich（德国）。

固体培养基上纤维素酶活性的定性筛选

细菌的产纤维素酶能力初步在CMC-LB琼脂上通过刚果红染色法评估。培养物在55°C下孵育24小时，随后用刚果红染色并洗涤以观察水解圈。这些初步试验证实了该细菌能够产生纤维素酶。

【数据】培养基：CMC-LB琼脂；温度：55°C；时间：24h；染色方法：刚果红染色

硫酸铵沉淀法提取纤维素酶

将分离菌株接种于pH 7.0的LB液体培养基中，在55°C、100 rpm条件下培养24小时。培养结束后，培养液在4°C下以10,000 rpm离心15分钟以去除菌体细胞，所得上清液转移至无菌Falcon管中。使用DNS法的初步试验显示上清液中存在纤维素酶活性。沉淀弃去，对上清液采用硫酸铵分级沉淀，饱和度从10%逐步增加至80%。然而，由于各组分中未观察到显著的沉淀或酶活性，后续所有分析均使用粗上清液作为主要酶源。

【数据】培养基：LB液体培养基（pH 7.0）；温度：55°C；转速：100 rpm；时间：24h；离心：10,000 rpm，15 min，4°C；硫酸铵饱和度：10%–80%逐级递增

粗纤维素酶的制备

将细菌分离株在Luria-Bertani（LB）肉汤中于55°C、pH 7.0、100 rpm振荡条件下培养24小时。为获得粗纤维素酶，液体培养物以10,000 rpm离心15分钟。基于DNS测定结果，确认酶活性为胞外性质（存在于上清液中），弃去沉淀。该无细胞上清液随后用作所有进一步表征试验的粗酶源。

【数据】培养基：LB肉汤；温度：55°C；pH：7.0；转速：100 rpm；时间：24h；离心：10,000 rpm，15 min

纤维素酶活性的测定与表征

采用DNS法测定酶的最适温度、最适pH、pH稳定性、4°C储存稳定性、最适离子浓度及动力学参数（Kₘ和Vₘₐₓ）。方法如下：将上清液中的酶与溶于缓冲液的羧甲基纤维素（CMC）在Eppendorf管中于不同pH和温度下共同孵育10分钟。随后加入DNS试剂，升温至100°C终止反应。将试管置于冰浴中10分钟，在540 nm处测定吸光度值。酶活性以相对值或通过葡萄糖标准曲线所得斜率计算。该方法中，DNS试剂颜色从浅黄色变为深橙色，与培养基中葡萄糖含量成正比，可通过分光光度法检测。上述孵育时间通过预试验确定。最适离子强度测定使用固定最适pH的甘氨酸-NaOH缓冲液，所得结果也包含缓冲液离子的影响。

【数据】底物：CMC；检测波长：540 nm；反应时间：10 min；终止温度：100°C；冰浴：10 min；缓冲液：甘氨酸-NaOH

葡萄糖标准曲线

为测定酶活性，制备了葡萄糖标准曲线。从储备液配制不同浓度的葡萄糖溶液，在540 nm处测定吸光度。每个样品重复测定三次，取三次测定值的算术平均值。所得数据绘制为标准曲线。

【数据】检测波长：540 nm；重复次数：3次（取算术平均值）

以CMC为底物测定纤维素酶的Km和Vmax值

使用上清液作为酶源测定动力学参数。测量在最适条件下进行。不同CMC浓度下的酶活性首先通过葡萄糖标准曲线（y = 0.1631x）将吸光度值（OD540）换算为葡萄糖当量（µmol）。随后采用Lineweaver-Burk双倒数作图法（1/V对1/[S]）确定Km和Vmax值。Vmax和Km值从线性图的y截距（1/Vmax）和x截距（-1/Km）经数学计算得出。

【数据】标准曲线方程：y = 0.1631x；作图法：Lineweaver-Burk双倒数图

纤维素酶动力学参数的测定

酶活性测定在12.5–90°C温度范围内进行。计算所得活性值的对数（log K），温度以1/T × 1000表示。利用所得图绘制Arrhenius曲线，活化能（Ea）由该曲线的斜率确定。活化焓（ΔH）按方程ΔH = Ea - R × T计算。随后确定Q₁₀值，该值表示温度每升高10°C时酶活性的变化倍数。Q₁₀通过将相差10°C的两个温度下测得的较高活性值除以较低活性值计算。对于Q₁₀值，考虑了20°C和30°C下的活性测量值。Arrhenius图的斜率由方程给出：Slope = -Ea / (2.303 × R)，其中Ea为活化能，R为通用气体常数（R: 1.987 cal·mol⁻¹·K⁻¹）。

【数据】温度范围：12.5–90°C；气体常数R：1.987 cal·mol⁻¹·K⁻¹；Q₁₀计算温度：20°C和30°C

凝胶过滤色谱法部分纯化纤维素酶

采用凝胶过滤色谱法对分离自迪亚丁温泉的细菌所产纤维素酶进行部分纯化。Sephadex G-100用作凝胶基质。

【数据】凝胶基质：Sephadex G-100

Warburg法定性监测蛋白质

凝胶过滤色谱后所得洗脱液中的蛋白质含量采用Warburg-Christian法定性监测。该方法严格用于纯化过程中含蛋白质组分的快速筛选和鉴定。通过测定280 nm处的吸光度监测样品中蛋白质的存在，该波长主要检测芳香族氨基酸残基。这些测量用作快速筛选工具，以识别富含蛋白质的洗脱液并汇集用于进一步分析，而非用于比活性的精确定量测定。

【数据】检测波长：280 nm；方法：Warburg-Christian法

SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

纯化组分通过SDS-PAGE分析，使用12%分离胶和5%浓缩胶。电泳后，尝试使用高灵敏度银染方案对蛋白质条带进行显色。然而，由于纯化酶组分中蛋白质浓度极低，凝胶上无法清晰观察到明显的蛋白质条带。因此，本研究无法通过SDS-PAGE精确定量酶的分子量。

【数据】分离胶浓度：12%；浓缩胶浓度：5%；染色方法：银染

Bradford法定量测定蛋白质

为计算酶的基本参数（包括总活性、比活性、总蛋白和纯化倍数），采用Bradford法对蛋白质浓度进行定量测定。在595 nm处测定吸光度值，蛋白质含量使用牛血清白蛋白（BSA）标准曲线计算。所有测量重复三次，使用算术平均值进行最终计算。

【数据】检测波长：595 nm；标准蛋白：BSA；重复次数：3次

多种化合物对纤维素酶抑制效应的研究

EDTA、MgSO₄、KCl、KI和SDS的IC50值通过最佳拟合非线性回归确定。

【数据】测试化合物：EDTA、MgSO₄、KCl、KI、SDS；IC50测定方法：剂量-反应曲线最佳拟合

研究结果

固体培养基上的纤维素酶产生

OE-1菌株的胞外纤维素酶活性在CMC-LB琼脂平板上进行了评估。孵育后，刚果红染色及随后的NaCl洗涤显示出由酶解羧甲基纤维素形成的水解圈。清晰的透明圈表明纤维素分解活性，经测量获得半定量活性值。OE-1菌株产生直径为29 mm的水解圈，酶指数为5.14，这些数值已在我们的已发表工作中报道。文献比较表明这些值较为显著。虽然公认固体培养基上的水解圈可能不能直接反映液体培养产量，但所得结果指向该菌株具有良好的酶学潜力。

【数据】水解圈直径：29 mm；酶指数（EI）：5.14

硫酸铵沉淀结果

B. licheniformis OE-1在液体培养基中培养后，对酶液进行硫酸铵沉淀。沉淀从10%饱和度开始，逐步增加至80%。然而，尽管重复该过程三次，所有组分中均未检测到酶活性。这种活性损失可能是高盐浓度下的结构变性，或残余盐对用于活性测定的DNS试剂产生干扰所致。然而，从工业角度来看，需要大量且昂贵的纯化步骤是一个重要的限制因素。本研究未进行进一步复杂的纯化，而是聚焦于粗酶的动力学和理化表征。B. licheniformis OE-1产生的粗纤维素酶因其稳定性和动力学特性，可能成为直接工业应用的潜在候选者。绕过昂贵的纯化过程可为大规模应用提供经济和操作上的优势。因此，后续实验使用离心后上清液中的粗酶进行。此后，“粗酶”一词即指含有纤维素酶的上清液。

【数据】硫酸铵饱和度范围：10%–80%；重复次数：3次；结果：所有组分均无酶活性

粗纤维素酶的最适pH

最适pH通过DNS法以CMC为底物测定纤维素酶活性来确定。结果以相对活性（%）表示，最高活性对应的pH值定义为100%。结果表明，粗酶具有嗜碱特性，在pH 9.0时检测到最大活性。pH 9.0时显著增加的酶活性可能归因于有利的静电条件和活性位点残基的最佳质子化状态（p < 0.05，n = 3）。

【数据】最适pH：9.0；统计检验：Duncan多重极差检验，p < 0.05，n = 3

纤维素酶的最适离子强度

在最适pH条件下，使用DNS法以CMC为底物测定离子强度对粗酶活性的影响，结果以相对活性（%）表示。离子强度分析使用固定pH的甘氨酸-NaOH缓冲液系统进行。结果表明，粗酶的最适离子强度为100 mM。中等离子强度水平支持酶活性，而较高浓度显著降低活性，可能是由于静电平衡被破坏（p < 0.05，n = 3）。

【数据】最适离子强度：100 mM；缓冲液：甘氨酸-NaOH；统计检验：Duncan多重极差检验，p < 0.05，n = 3

纤维素酶的最适温度

相对活性随温度升高而显著增加，在60°C时达到最大值。在更高温度下，观察到统计学上显著的下降，不同的字母分组表明各温度之间存在显著差异（p < 0.05，n = 3）。

【数据】最适温度：60°C；统计检验：Duncan多重极差检验，p < 0.05，n = 3

纤维素酶在4°C下的储存稳定性

酶活性通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定，测量释放的还原糖在540 nm处的吸光度。测定活性相对于初始时间点（0 h）进行评价，初始时间点定义为100%。样品活性在75小时内保持统计学稳定（p > 0.05）。虽然在2.5小时和3.5小时观察到微小但显著的波动（p < 0.05），但活性随后恢复至基线水平。到100小时时，活性出现显著下降（p < 0.05），至200小时时，活性降至初始值的约70%（p < 0.05，n = 3）。

【数据】储存温度：4°C；稳定期：至75h（p > 0.05）；100h时显著下降（p < 0.05）；200h时活性：约为初始值的70%

葡萄糖标准曲线

酶活性的计算需要葡萄糖标准曲线的斜率。为此，通过在540 nm处测定吸光度制备了葡萄糖标准曲线。

【数据】检测波长：540 nm

纤维素酶以CMC为底物的Km-Vmax值结果

以上清液作为酶源，基于Lineweaver-Burk双倒数图，计算得出酶的Vmax为2.29 U mL⁻¹，Km为0.1691 mg/mL。

【数据】Vmax：2.29 U mL⁻¹；Km：0.1691 mg/mL；底物：CMC；作图法：Lineweaver-Burk双倒数图

纤维素酶的动力学参数

为确定粗纤维素酶的热物理性质，计算了活化能（Ea）、活化焓（ΔH）和Q₁₀值。Ea和ΔH值分别为2.82 kcal/mol和2.16 kcal/mol。在热物理学中，Ea代表启动底物水解所需的最小能垒，而ΔH反映酶-底物过渡态形成过程中的热力学能量变化。此外，温度系数（Q₁₀）描述温度每升高10°C反应速率的变化倍数，计算为1.22。

【数据】Ea：2.82 kcal/mol；ΔH：2.16 kcal/mol；Q₁₀：1.22；最适温度：60°C

使用Sephadex G-100纯化纤维素酶

对粗纤维素酶应用Sephadex G-100凝胶过滤色谱，旨在提高比活性。色谱后，计算了酶活性、蛋白质浓度、比活性和纯化倍数等参数。结果表明，比活性从4.03变为2.85 U µg⁻¹蛋白，纯化倍数为0.71。

【数据】纯化前比活性：4.03 U µg⁻¹蛋白；纯化后比活性：2.85 U µg⁻¹蛋白；纯化倍数：0.71

Bradford法蛋白质测定

蛋白质浓度通过Bradford法使用牛血清白蛋白（BSA）标准曲线进行定量。

【数据】方法：Bradford法；标准蛋白：BSA；检测波长：595 nm

SDS-PAGE分析

凝胶过滤后获得的酶样品（泳道1–2）和匀浆粗酶样品（泳道3）经SDS-PAGE分析。由于纯化酶组分中蛋白质浓度极低，凝胶上无法清晰观察到明显的蛋白质条带，因此未能通过SDS-PAGE精确确定酶的分子量。

【数据】样品：凝胶过滤后酶样品（泳道1–2）、匀浆粗酶样品（泳道3）；结果：未见清晰蛋白条带

EDTA对纤维素酶相对活性的影响

测定了不同浓度EDTA对纤维素酶相对活性的影响。不同字母表示根据Duncan多重极差检验在p < 0.05水平上差异具有统计学意义（n = 3）。

【数据】统计检验：Duncan多重极差检验，p < 0.05，n = 3

抑制效应研究结果

研究了EDTA、MgSO₄、KCl、KI和SDS对酶活性的影响。IC50值通过剂量-反应曲线计算，抑制类型通过Lineweaver-Burk图初步确定。EDTA、MgSO₄和KI被鉴定为非竞争性抑制剂，而KCl和SDS表现出非竞争性抑制特征。

【数据】IC50：原文未详述具体数值；抑制类型：EDTA/MgSO₄/KI为非竞争性抑制，KCl/SDS为非竞争性抑制

讨论与解读

化学工业虽为现代社会带来巨大利益，但与传统生产工艺相关的环境和健康问题日益突出，加速了向生物技术方法的转变。热环境（温泉）来源的菌株暗示其酶在需要高温的食品加工阶段可能具有稳定性优势。具体而言，与已有文献相比，5.14的纤维素酶指数为酶的有效性提供了积极数据。该酶在60°C和pH 9.0下表现出最佳活性，表明其适用于某些高温碱性工艺。以CMC为底物时，Vmax为2.29 U mL⁻¹，Km为0.1691 mg/mL。EDTA、MgSO₄和KI为非竞争性抑制剂，KCl和SDS为非竞争性抑制。该研究凸显了迪亚丁地热生态系统作为工业可持续生物催化剂来源的潜力。

编译者解读

本研究选择以粗酶直接表征的策略颇具实用导向——硫酸铵沉淀导致酶活完全丧失后，果断放弃纯化路线，转而评估粗酶的工业适用性。这种"反常规"路径恰好回应了工业应用中纯化成本高的痛点。值得肯定的是，研究者在无纯化酶的情况下仍完成了包括动力学、热力学和抑制类型在内的全面表征。但比活性从4.03降至2.85 U µg⁻¹蛋白、纯化倍数仅0.71的结果也提示，该酶的工业应用可能更适合以全细胞或粗酶制剂形式推进。未来若能在分子层面解析该酶的耐热耐碱机制，将更具工程改造价值。

参考来源

Eren O, Sakiroglu H. Characterization of crude cellulase produced by Bacillus licheniformis OE-1 from the Diyadin hot springs, Ağrı Province. Int Microbiol. PMID: 41961215.

PMID: 41961215