来源：Temperature-Dependent Thumb Domain Dynamics of Xylanase TsaGH11: Insights from Molecular Dynamics Simulations.（Int J Mol Sci）| 编译：DNA Lab Space
导读
GH11木聚糖酶在食品、饲料、制浆造纸及生物燃料工业中应用广泛。本研究解析了来自解糖热厌氧杆菌的TsaGH11在1.4 Å分辨率下的晶体结构，并通过300、320、340、360 K下的全原子分子动力学模拟，揭示了温度对底物识别拇指域构象动态的影响。研究发现，在最适温度340 K下，TsaGH11的底物结合裂隙主要采用闭合构象，但拇指域波动显著增大，呈现开放与闭合构象的采样，提示底物识别可能遵循构象选择机制。
研究背景
木质纤维素生物质是地球上最丰富的可再生碳资源，在可持续生物基产业发展中具有核心地位。木聚糖占木质纤维素生物质的显著比例，其高效降解对可再生生物质向高附加值产品转化至关重要。木聚糖酶属于糖苷水解酶（GH），催化植物细胞壁主要半纤维素组分——木聚糖中β-1,4-木糖苷键的水解。在制浆造纸工业中，木聚糖酶用于生物漂白以减少苛刻化学处理；在食品和饲料工业中，通过降解非淀粉多糖改善面团操作性、面包品质和营养利用率。木聚糖酶将木聚糖水解为木糖和低聚木糖，促进木质纤维素生物质酶法糖化产生可发酵糖，进而转化为生物燃料和高附加值生化产品。
基于序列相似性和结构特征，木聚糖酶被分为多个GH家族，其中GH10和GH11研究最为广泛。GH11木聚糖酶对木聚糖主链具有高催化效率和底物特异性。来自解糖热厌氧杆菌的GH11木聚糖酶TsaGH11表现出高催化活性，是工业应用中有吸引力的酶。此前已在低温（冷冻态）和室温条件下研究了TsaGH11拇指域的柔性，但最适温度下的底物识别机制尚不清楚。
研究方法
4.1 蛋白制备与结晶
蛋白表达、纯化和结晶参照已发表方法进行。简要流程如下：含有TsaGH11基因（UniProt编号：I3VTR8）的重组DNA转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。细胞在添加卡那霉素（100 μg/mL）的LB培养基中培养，蛋白表达以0.5 mM IPTG在18°C过夜诱导。收集细胞并经超声破碎，细胞碎片通过14,000 rpm离心1小时去除。上清液使用Ni–NTA亲和柱纯化，随后经Sephacryl S-100柱（Cytiva，乌普萨拉，瑞典）进行尺寸排阻色谱，柱缓冲液含10 mM Tris–HCl（pH 8.0）和200 mM NaCl。蛋白纯度通过SDS–PAGE监测，蛋白浓度采用Bradford法测定。纯化蛋白用Centricon浓缩器（Merck，伯灵顿，马萨诸塞州，美国；截留分子量10 kDa）浓缩。结晶采用悬滴气相扩散法，22°C条件下进行。TsaGH11溶液（约30 mg/mL，2 μL）与等体积结晶溶液混合，结晶溶液含0.1 M醋酸钠（pH 4.6）和3.5–4.0 M醋酸铵。液滴在24孔VDX板中与500 μL储液平衡。TsaGH11晶体在2周内出现。
【数据】菌株：大肠杆菌BL21(DE3)；抗生素：卡那霉素100 μg/mL；诱导剂：0.5 mM IPTG；温度：18°C；离心：14,000 rpm×1 h；缓冲液：10 mM Tris–HCl（pH 8.0）+200 mM NaCl；蛋白浓度：约30 mg/mL；结晶温度：22°C；结晶溶液：0.1 M醋酸钠（pH 4.6）+3.5–4.0 M醋酸铵；晶体出现时间：2周内
4.2 数据收集
X射线衍射数据在浦项加速器实验室（PLS-II，浦项，韩国）11C光束线收集。TsaGH11晶体在含20%（v/v）乙二醇的结晶溶液冷冻保护剂中浸泡5秒。衍射数据在100 K下收集，使用Pilatus 6M检测器（Dectris，巴登-达特维尔，瑞士）记录。衍射数据使用Xia2程序（版本0.3.8.0）在韩国科学技术信息研究院（KISTI，大田，韩国）全球科学数据枢纽中心（GSDC）处理。
【数据】光束线：PLS-II 11C；冷冻保护剂：20%（v/v）乙二醇；浸泡时间：5 s；数据收集温度：100 K；检测器：Pilatus 6M；处理软件：Xia2（版本0.3.8.0）
4.3 结构解析
相位问题通过CCP4套件（版本8.0.012）中实现的MOLREP进行分子置换解决。TsaGH11晶体结构（PDB编号：8YYN）用作搜索模型。模型搭建和结构精修分别使用COOT（版本0.9.8.7）和PHENIX套件（版本1.20.1-4487）中的phenix.refine进行。最终模型结构使用MolProbity（版本4.5.1）验证。
【数据】搜索模型：TsaGH11（PDB：8YYN）；软件：MOLREP/CCP4 8.0.012、COOT 0.9.8.7、PHENIX 1.20.1-4487、MolProbity 4.5.1
4.4 分子动力学模拟
本研究中解析的TsaGH11开放和闭合构象晶体结构用作MD模拟的初始模型结构。全原子MD模拟使用GROMACS（版本2024.4）进行。采用AMBER99SB-ILDN力场，系统在立方体盒子中以TIP3P水分子溶剂化，确保蛋白表面与盒子边界最小距离为1 nm。添加抗衡离子中和系统电荷，能量最小化采用最陡下降算法。长程静电相互作用计算使用Particle Mesh Ewald（PME）方法。NVT平衡在目标温度下进行100 ps，使用V-rescale恒温器，键约束采用LINCS算法。NPT平衡在目标温度下进行100 ps，使用V-rescale恒温器和Parrinello–Rahman恒压器（1 bar），键约束采用LINCS算法。生产MD模拟在300、320、340和360 K下进行500 ns，MD模拟时间步长为2 fs。
【数据】软件：GROMACS 2024.4；力场：AMBER99SB-ILDN；水模型：TIP3P；边界距离：1 nm；平衡时间：NVT 100 ps + NPT 100 ps；恒温器：V-rescale；恒压器：Parrinello–Rahman（1 bar）；模拟温度：300/320/340/360 K；模拟时长：500 ns；时间步长：2 fs
4.5 MD数据分析
轨迹分析包括均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA），使用GROMACS内置分析工具进行。代表性结构通过基于RMSD的聚类获得，截断值为2 Å。从20 ns后的平衡轨迹中选择最大群体的质心结构。主成分分析（PCA）和自由能景观（FEL）分析基于前两个主成分（PC1和PC2）使用GROMACS进行。结构图使用PyMOL生成（The PyMOL Molecular Graphics System，版本2.5，Schrödinger，LLC，纽约，纽约州，美国）。
【数据】聚类截断值：2 Å；平衡时间：20 ns；分析内容：RMSD/RMSF/Rg/SASA/PCA/FEL；结构图软件：PyMOL 2.5
研究结果
2.1 TsaGH11的整体结构
为利用精确结构模型进行MD模拟，TsaGH11的高分辨率晶体结构在1.4 Å分辨率下解析，最终Rwork和Rfree值分别为0.1748和0.1884（表1）。
TsaGH11的整体结构与已报道的TsaGH11结构高度相似。简言之，TsaGH11采用GH11木聚糖酶典型的β-jelly roll折叠，包含六个底物结合位点（从−3到+3），形成拇指域、手指域和手掌域（图1A）。催化残基Glu105（亲核试剂）和Glu198（质子供体）位于底物结合裂隙中央区域，介于−1和+1位点之间（图1A）。不对称单元中存在两个TsaGH11分子，分别呈现底物结合裂隙的闭合和开放构象，分别命名为TsaGH11closed和TsaGH11open（图1B），这是晶体堆积效应所致。在晶格中，TsaGH11open与邻近TsaGH11分子广泛参与晶体堆积相互作用，而TsaGH11closed（包括拇指域）暴露于晶格中的溶剂区域。TsaGH11closed和TsaGH11open中催化残基Glu105与Glu198之间的最近距离分别为5.27和5.20 Å。手指域Trp36与拇指域Pro143之间的最近距离在两种构象间差异显著——TsaGH11closed中为3.87 Å，TsaGH11open中为5.70 Å（图1B）。手指域Asn62与拇指域Arg139之间的最近距离在两种构象间差异显著——TsaGH11closed中为5.11 Å，TsaGH11open中为6.90 Å（图1B）。
B因子分析显示两种构象间柔性区域分布存在显著差异（图1C,D）。在TsaGH11closed中，β-jelly roll折叠核心以外的区域（主要包含环区）表现出相对较高的B因子，而在TsaGH11open中，高柔性主要出现在拇指域和β链之间的环区。TsaGH11closed和TsaGH11open的平均B因子值分别约为20.45和16.99 Ų。这些结果表明晶体堆积可显著影响晶体结构中的局部柔性，可能导致与蛋白在溶液中内在构象动力学的差异。基于晶体堆积效应和结构分析，TsaGH11的闭合构象被认为在分子柔性方面更具生物学相关性，因为它在晶格中更暴露于溶剂区域。
【数据】分辨率：1.4 Å；Rwork：0.1748；Rfree：0.1884；催化残基间距（closed）：5.27 Å；催化残基间距（open）：5.20 Å；Trp36-Pro143间距（closed）：3.87 Å；Trp36-Pro143间距（open）：5.70 Å；Asn62-Arg139间距（closed）：5.11 Å；Asn62-Arg139间距（open）：6.90 Å；平均B因子（closed）：20.45 Ų；平均B因子（open）：16.99 Ų
2.2 TsaGH11的MD模拟
MD模拟中观察到的分子柔性可能受初始结构模型选择的影响。因此，TsaGH11开放和闭合构象的模拟结果预计会有所不同。尽管TsaGH11的闭合构象被认为更具生物学相关性（特别是考虑到晶体堆积效应），本研究仍对两种构象均进行了MD模拟，以获得对TsaGH11分子柔性更全面的理解，并评估初始结构模型对构象动力学的影响程度。在先前研究中，TsaGH11在30、50、70和90°C下的相对酶活分别约为55%、90%、100%和30%。基于这一温度依赖性酶活谱，MD模拟在300、320、340和360 K下进行500 ns，以研究TsaGH11的温度依赖性结构变化。
#### 2.2.1 TsaGH11closed的温度依赖性MD模拟
TsaGH11closed在300 K下的RMSD值在0.07–0.10 nm范围内窄幅波动，表明构象高度稳定（图2A）。在320和340 K下，RMSD值相对于300 K适度增加，通常在约0.09–0.14 nm范围内，波动略宽，表明柔性增强但未丧失整体结构稳定性（图2A）。相比之下，在360 K下，RMSD行为显著不同（图2A）。初始平衡阶段后，RMSD随时间逐渐增加，达到约0.25–0.35 nm的值，在模拟中后期观察到几个显著尖峰，表明发生了显著的大规模构象重排（图2A）。TsaGH11closed在300、320、340和360 K下的平均RMSD值分别为0.106、0.136、0.126和0.208 nm，表明在360 K下发生了显著结构变化。
TsaGH11closed在300、320和340 K下的Rg值在约1.51–1.53 nm范围内表现出相似波动，无明显系统性漂移，表明蛋白保持整体紧凑结构（图2B）。在360 K下，Rg值出现轻微上移且分布更宽，最大值达到约1.60 nm，表明整体堆积部分松散（图2B）。
300、320和340 K下的SASA值在相似范围内，而在360 K下观察到轻微上漂移（图2C）。TsaGH11closed在300、320、340和360 K下的平均SASA值分别为81.56、82.72、83.02和86.35 nm²。
RMSF分析显示，TsaGH11closed在300 K下大多数残基的RMSF值<0.20 nm，表明结构相对刚性（图2D）。与300 K下的RMSF值相比，320 K下的RMSF值在底物结合裂隙对侧的α-螺旋区域（Lys180–Leu186）适度增加（图2D）；然而，相对于更高温度下观察到的波动，这些波动较为温和。在340 K下，拇指域（Pro143–Gly147）观察到显著波动，RMSF值达到约0.40 nm，表明在最佳酶活温度附近拇指域柔性增强（图2D）。在360 K下，N端（Thr29–Tyr32）和底物结合裂隙对侧（Pro74–Tyr80和Arg162–Leu186）均观察到显著波动，RMSF值范围约0.45–0.55 nm（图2D），而拇指域的波动相对于340 K时有所下降。
RMSF衍生的B因子putty表示显示，在300和320 K下，TsaGH11在底物结合裂隙和活性位点处表现出相对刚性的波动（图2E）。在340 K下，拇指域表现出显著增加的柔性（图2E），表明底物结合裂隙的构象变得更加多变。相比之下，在360 K下，高波动区域的分布扩展至不仅包括底物结合区域，还包括β-jelly roll折叠的核心区域（图2E）。
【数据】RMSD（300 K）：0.07–0.10 nm；RMSD（320/340 K）：约0.09–0.14 nm；RMSD（360 K）：约0.25–0.35 nm；平均RMSD：0.106/0.136/0.126/0.208 nm（300/320/340/360 K）；Rg范围：约1.51–1.53 nm（300–340 K）；Rg最大值（360 K）：约1.60 nm；平均SASA：81.56/82.72/83.02/86.35 nm²（300/320/340/360 K）；RMSF峰值（340 K，拇指域）：约0.40 nm；RMSF范围（360 K）：约0.45–0.55 nm
#### 2.2.2 TsaGH11open的温度依赖性MD模拟
RMSD分析显示，在300 K下，TsaGH11open表现出最低的RMSD值，范围约0.08–0.13 nm，波动极小，表明构象高度稳定（图3A）。在320 K下，RMSD值相对于300 K适度增加，通常在约0.11–0.18 nm范围内（图3A）。尽管热运动增加，RMSD曲线稳定且无长期漂移，表明柔性增强但整体折叠保持。在340 K下，RMSD分布变宽（图3A）。在模拟中期（240–250 ns）附近观察到RMSD的瞬时增加；然而，这些偏差是可逆的，RMSD随后恢复到稳定基线（图3A），表明发生了局部构象重排。在360 K下，RMSD值表现出最大波动，范围约0.10–0.40 nm（图3A）。虽然未观察到持续上漂移，但即使在450 ns后稳定化，波动仍高于其他温度（图3A）。300、320、340和360 K下的平均RMSD值分别为0.1213、0.1（原文截断）。
【数据】RMSD（300 K）：约0.08–0.13 nm；RMSD（320 K）：约0.11–0.18 nm；RMSD（340 K）：瞬时增加出现在240–250 ns；RMSD（360 K）：约0.10–0.40 nm；平均RMSD（300 K）：0.1213 nm
讨论与解读
本研究对TsaGH11的两种构象状态——TsaGH11closed和TsaGH11open进行了MD模拟。两种构象状态均表现出共同的结构特征，包括拇指域波动的增强和热敏感的解折叠区域。然而，详细的MD模拟分析结果（如RMSD和RMSF曲线）显示两个系统之间存在定量差异。这些发现表明，MD模拟结果可能因初始选择的结构模型不同而有所差异。已有报道一致表明，MD模拟结果对轨迹生成所使用的起始构象敏感。TsaGH11open和TsaGH11closed获得的明显不同的MD模拟结果，为详细MD结果可能因初始结构模型选择而不同提供了一个额外例证。
GH11木聚糖酶拇指域与手指域之间的开放构象加宽了底物结合裂隙，促进底物可及性。对嗜热木聚糖酶EvXyn11TS的MD研究表明，该酶在310 K下主要采用闭合构象，而在340 K下拇指环柔性增加并向开放构象转变，提示底物可及性增强。相比之下，比较TsaGH11closed在300、320和340 K下的代表性MD结构发现，升高温度缩短了拇指域与手指域之间的距离（原文截断）。
编译者解读
本研究通过高分辨率晶体学与多温度MD模拟的联用，揭示了TsaGH11在最适温度下"闭合为主、开放采样"的底物识别机制——这一发现为GH11木聚糖酶的理性工程改造提供了明确的结构靶点。方法上，作者对开放与闭合两种构象分别进行模拟并比较，严谨地评估了初始模型对动力学结论的影响，值得同类研究借鉴。值得注意的是，360 K下观察到的解折叠区域（底物结合裂隙对侧）为热稳定性改造提供了候选位点。局限在于，模拟温度与体外酶活测定温度之间的直接对应关系仍需更多实验验证，且构象选择机制的证实尚需增强采样或实验动力学数据的支撑。
参考来源
Nam KH. Temperature-Dependent Thumb Domain Dynamics of Xylanase TsaGH11: Insights from Molecular Dynamics Simulations. Int J Mol Sci. PMID: 42589522.
PMID: 42589522