来源：Metabolic engineering of Escherichia coli for efficient production of d-phenylglycine.（Synth Syst Biotechnol）| 编译：DNA Lab Space
导读
D-苯甘氨酸（D-PHG）是β-内酰胺类抗生素合成中的关键手性砌块，传统化学合成依赖剧毒氰化物和苛刻反应条件。本研究在大肠杆菌中构建了一条全新的D-PHG从头生物合成途径，通过系统代谢工程策略——消除竞争途径、强化前体供应、优化氨基供体、增强NADPH再生——将摇瓶产量提升至6.98 g/L，3-L补料分批发酵达到9.83 g/L，为目前报道的以葡萄糖为底物从头合成D-PHG的最高产量。
研究背景
D-苯甘氨酸是一种非天然手性氨基酸，是氨苄青霉素、头孢氨苄、头孢拉定、头孢克洛及青霉素G等β-内酰胺类抗生素生产中的关键中间体。此外，D-PHG还用于制备PDK1/Aurora激酶A双抑制剂SA16，以及杀虫剂虫螨腈等农用化学品的合成。2024年全球D-PHG市场估值约8746万美元，预计2031年将增至1.26亿美元。
传统上D-PHG主要通过化学法合成，其中Bucherer-Bergs法和乙醛酸法应用最广。Bucherer-Bergs法以苯甲醛为底物，在氰化物和氨或碳酸铵存在下环化生成DL-PHG，再经高温高压水解酸化——依赖剧毒氰化物且反应条件苛刻。乙醛酸法利用乙醛酸、苯和乙酰胺合成N-乙酰苯甘氨酸。两种路线均存在显著的环境与安全隐患。已有的生物技术路线受限于生产效率低下。因此，构建一条高效、可持续的D-PHG微生物合成路线具有重要的工业价值。
研究方法
2.1 菌株与质粒
质粒构建使用大肠杆菌Trans5α菌株。以大肠杆菌BW25113作为目标产物生物合成的宿主菌株。生物合成途径通过质粒pET-lac（高拷贝数）、pCS27（中拷贝数）和pSA74（低拷贝数）组装。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑使用pTarget和pCas9质粒。本研究所用菌株和质粒的详细信息见表1和表2。
菌株XYJ01为BW25113缺失tyrB、aspC、ilvE；XYJ02为BW25113缺失pykA、pykF、tyrA、tyrB、aspC、ilvE、tyrR，并在ilvG位点基因组整合Plpp4.2-aroGfbr-aroB-aroD；XYJ03为XYJ02在yeeL位点整合P50trc-gdhA；XYJ04为XYJ03在yciQ位点整合P50trc-nadK；XYJ05为XYJ04在ylbE位点整合P10trc-pntAB。XYJ06至XYJ28为携带不同质粒组合的生产菌株（详见表1）。
【数据】宿主菌：E. coli BW25113；克隆菌：E. coli Trans5α；质粒系统：pET-lac（高拷贝，AmpR）、pCS27（中拷贝，KanR）、pSA74（低拷贝，CmR）；基因组编辑：CRISPR/Cas9（pTarget、pCas9）
2.2 培养基
LB培养基用于质粒构建和菌株培养。摇瓶发酵在M9Y培养基中进行，添加5 g/L酵母提取物、2 g/L MOPS、1 g/L NH4Cl、0.5 g/L NaCl、3 g/L KH2PO4、6.78 g/L Na2HPO4、30 g/L葡萄糖、1 mM MgSO4和0.1 mM CaCl2。培养过程中根据需要补充抗生素：卡那霉素（50 μg/mL）、氨苄青霉素（100 μg/mL）、氯霉素（25 μg/mL）。根据不同菌株需求，培养基额外添加3 g/L天冬氨酸、0.2 g/L酪氨酸，以及亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸各0.1 g/L。
【数据】基础培养基：M9Y；碳源：30 g/L葡萄糖；抗生素：卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL、氯霉素25 μg/mL；氨基酸补充：3 g/L天冬氨酸、0.2 g/L酪氨酸、各0.1 g/L亮氨酸/异亮氨酸/苯丙氨酸/缬氨酸
2.3 DNA操作
来源于东方拟无枝酸菌（A. orientalis）的hmaS基因经密码子优化以适配大肠杆菌表达。mdlB基因以恶臭假单胞菌（P. putida ATCC 12633）基因组DNA为模板经PCR扩增，密码子优化的hmaS与mdlB通过KpnI、HindIII、XbaI和BamHI限制性位点克隆至pET-lac质粒，获得pET-lac-hmaS-hmaS-mdlB。将表达盒PLlacO1-hmaS插入pET-lac-hmaS-hmaS-mdlB的AvrII位点，生成pET-lac-hmaS-hmaS-mdlB-lac-hmaS。
dpgA基因从斯图策假单胞菌（P. stutzeri ST-201）基因组扩增，通过KpnI和BamHI位点克隆至pCS27载体，置于Plpp0.6启动子控制下，获得质粒pCS-Plpp0.6-dpgA。将表达盒PLlacO1-pheAfbr、PLlacO1-aroGfbr和PLlacO1-pheAfbr-aroGfbr分别插入pCS-Plpp0.6-dpgA质粒的BcuI和SacI位点之间，构建质粒pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr、pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-aroGfbr和pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr-aroGfbr。随后，源自大肠杆菌MG1655的ppsA、pck基因以及talB-tktA表达模块分别通过同源重组插入pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr，构建质粒pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr-ppsA、pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr-pck和pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr-talB-tktA。同样地，将pck基因和talB-tktA表达盒依次导入pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr-ppsA，生成质粒pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr-ppsA-pck和pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr-ppsA-pck-talB-tktA。随后，将pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr-ppsA-pck-talB-tktA中的Plpp0.6启动子替换为Plpp0.2、PLlacO1、Plpp1.0和Plpp4.0启动子，构建相应启动子变体质粒。NADPH再生相关基因maeB、zwf、pntAB、nadK和ppnK分别克隆至pSA74载体，构建pSA-lac-maeB、pSA-lac-zwf、pSA-lac-pntAB、pSA-lac-nadK和pSA-lac-ppnK。
【数据】限制性位点：KpnI、HindIII、XbaI、BamHI、AvrII、BcuI、SacI；基因来源：hmaS（A. orientalis）、mdlB（P. putida ATCC 12633）、dpgA（P. stutzeri ST-201）、ppsA/pck/talB/tktA/maeB/zwf/pntAB/nadK（E. coli MG1655）、ppnK（C. glutamicum）
2.4 发酵条件（原文节选未完整呈现，以下为已提供部分的忠实翻译）
摇瓶发酵在M9Y培养基中进行，30°C、220 rpm振荡培养。补料分批发酵在3-L生物反应器中进行。具体发酵参数原文节选未完整呈现。
研究结果
3.1 构建D-PHG合成初始菌株
大肠杆菌含有多种能将α-酮酸转化为L-氨基酸的内源氨基转移酶。研究首先考察了这些内源酶是否会干扰D-PHG的特异性生物合成。将空载体pET-lac导入E. coli BW25113获得菌株XYJ06。外源添加2 g/L PGA作为底物，发酵72小时后检测到0.44 g/L L-PHG，剩余1.53 g/L PGA（图2A），表明大肠杆菌内源氨基转移酶确实能将前体PGA转化为副产物L-PHG。由于PGA与L-苯丙氨酸前体PPA结构相似，参与芳香族氨基酸代谢的内源氨基转移酶可能将PGA作为非天然底物。因此，选择aspC、tyrB和ilvE作为主要敲除靶点，消除PGA到L-PHG的竞争性转氨反应。
为验证该假设并消除L-PHG生成，从E. coli BW25113中敲除内源α-氨基转移酶基因aspC、ilvE和tyrB，获得菌株XYJ01。将空载体pET-lac导入XYJ01获得菌株XYJ07。补充2 g/L PGA发酵72小时后，未检测到L-PHG生成，也未观察到PGA消耗（图2B），证明敲除内源氨基转移酶基因tyrB、ilvE和aspC有效消除了PGA生成L-PHG的副反应。因此，选择菌株XYJ01进行后续D-PHG生物合成研究。
充足的前体供应对高效D-PHG生物合成至关重要。在菌株XYJ01中敲除丙酮酸激酶基因pykA和pykF，减少PEP向丙酮酸的消耗，增加胞内PEP可用性。此外，敲除预苯酸脱氢酶基因tyrA，阻断预苯酸（PRE）向4-羟基苯丙酮酸（HPPA）的转化；去除双功能转录调控因子基因tyrR，解除对莽草酸途径关键基因（如aroG和aroL）的反馈抑制。为进一步增强莽草酸途径碳通量，将编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶的aroGfbr（D146N）基因，以及编码3-脱氢奎尼酸合酶的aroB和编码3-脱氢奎尼酸脱水酶的aroD，通过基因组整合导入菌株XYJ01的ilvG位点，获得菌株XYJ02。此前研究中，ilvG、yeeL、yciQ和ylbE等假基因位点已被系统评估并确认为大肠杆菌中适合稳定高效基因表达的染色体整合位点。这些位点能够在不影响细胞生长的情况下可靠表达整合基因，因此本研究选择这些位点引入不同途径酶。
此前研究表明，在高拷贝数质粒上串联表达三拷贝A. orientalis来源的hmaS可显著增强PPA向S-扁桃酸（S-MA）的转化。恶臭假单胞菌来源的SMDH酶依赖FMN催化S-MA转化为PGA，避免了过氧化氢的生成。斯图策假单胞菌ST-201来源的D-PhgAT能高效催化PGA转化为D-PHG，转化率高达93%。在此基础上，构建了质粒pET-lac-hmaS-hmaS-mdlB-lac-hmaS和pCS-Plpp0.6-dpgA用于D-PHG生物合成。将两质粒共转化至菌株XYJ02获得菌株XYJ08。发酵72小时后，菌株XYJ08产生2.79 g/L D-PHG（图2C）。同时观察到前体PGA积累极少（0.23 g/L），表明前体供应不足和D-PhgAT催化效率相对较低是D-PHG生产的关键瓶颈。
【数据】副产物L-PHG：0.44 g/L（XYJ06，2 g/L PGA，72 h）；剩余PGA：1.53 g/L（XYJ06）；L-PHG：0 g/L（XYJ07）；D-PHG产量：2.79 g/L（XYJ08，72 h）；PGA残留：0.23 g/L；D-PhgAT转化率：93%
3.2 碳代谢流重定向实现D-PHG过生产
首先尝试过表达莽草酸途径关键基因以改善前体供应。将抗反馈抑制的aroGfbr和pheAfbr分别在菌株XYJ08中过表达，获得菌株XYJ09和XYJ10（图3A），分别产生2.76 g/L和3.15 g/L D-PHG（图3B）。在菌株XYJ08中共过表达aroGfbr和pheAfbr获得菌株XYJ11（图3A），D-PHG产量降至2.88 g/L（图3B）。因此，选择菌株XYJ10作为后续工程改造的亲本菌株。
随后，通过改造PEP供应来提升D-PHG合成。在中心碳代谢中，磷酸烯醇式丙酮酸合酶PpsA可将丙酮酸转化回PEP。将ppsA基因导入质粒pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr生成pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr-ppsA，与pET-lac-hmaS-hmaS-mdlB-lac-hmaS共转化至菌株XYJ02获得菌株XYJ12。D-PHG产量提升至4.34 g/L（图3C）。此外，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶Pck可从草酰乙酸再生PEP。将pck基因克隆至pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr生成pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr-pck，与pET-lac-hmaS-hmaS-mdlB-lac-hmaS共转化至菌株XYJ02获得菌株XYJ13，产量为4.17 g/L D-PHG（图3C）。最后，共表达ppsA和pck构建质粒pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr-ppsA-pck，与pET-lac-hmaS-hmaS-mdlB-lac-hmaS共转化至菌株XYJ02获得菌株XYJ14。菌株XYJ14的D-PHG产量进一步增至4.41 g/L，比对照菌株XYJ10高40%（图3C）。
接下来，通过改造E4P供应进一步提升D-PHG产量。在磷酸戊糖途径中，转酮醇酶TktA和转醛醇酶TalB参与E4P的生成。将talB-tktA表达盒克隆至pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr生成pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr-talB-tktA，与pET-lac-hmaS-hmaS-mdlB-lac-hmaS共转化至菌株XYJ02获得菌株XYJ15，产量为4.14 g/L D-PHG（图3C）。最后，共表达ppsA、pck和talB-tktA构建质粒pCS-Plpp0.6-dpgA-lac-pheAfbr-ppsA-pck-talB-tktA，与pET-lac-hmaS-hmaS-mdlB-lac-hmaS共转化至菌株XYJ02获得菌株XYJ16。该菌株的D-PHG产量达到最高水平。
【数据】D-PHG产量：XYJ09（aroGfbr）：2.76 g/L；XYJ10（pheAfbr）：3.15 g/L；XYJ11（pheAfbr+aroGfbr）：2.88 g/L；XYJ12（ppsA）：4.34 g/L；XYJ13（pck）：4.17 g/L；XYJ14（ppsA+pck）：4.41 g/L（比对照高40%）；XYJ15（talB-tktA）：4.14 g/L
3.3 强化氨基转移酶表达与氨基供体供应
（原文节选未完整呈现此节全部内容，以下基于已提供信息忠实翻译）
通过使用不同强度的启动子优化D-PhgAT的表达水平。菌株XYJ16携带Plpp0.6启动子，XYJ17携带Plpp0.2启动子，XYJ18携带Plac启动子，XYJ19携带Plpp1.0启动子，XYJ20携带Plpp4.0启动子（图4A）。
外源添加3 g/L谷氨酰胺后，菌株XYJ18的D-PHG产量发生变化。此外，通过基因组整合gdhA基因增加胞内氨基供体供应，获得菌株XYJ21，其D-PHG产量进一步提升。
【数据】启动子强度测试：Plpp0.6、Plpp0.2、Plac、Plpp1.0、Plpp4.0；谷氨酰胺添加量：3 g/L
3.4 增强胞内NADPH供应强化D-PHG合成
（原文节选未完整呈现此节全部内容，以下基于已提供信息忠实翻译）
在菌株XYJ22至XYJ26中分别过表达参与NADPH再生的基因maeB、zwf、pntAB、nadK和ppnK（图5A）。其中，菌株XYJ26携带pSA-lac-ppnK。基因组整合nadK获得菌株XYJ27，进一步基因组整合pntAB获得菌株XYJ28，D-PHG产量得到进一步提升。
【数据】NADPH再生基因：maeB、zwf、pntAB、nadK、ppnK；基因组整合：nadK（XYJ27）、pntAB（XYJ28）
3.5 3-L生物反应器补料分批发酵
使用菌株XYJ27在3-L生物反应器中进行补料分批发酵。D-PHG最终产量达到9.83 g/L，代表了目前以葡萄糖为底物从头合成D-PHG的最高报道产量。
【数据】发酵规模：3-L补料分批；D-PHG终产量：9.83 g/L；生物重复：2次
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程策略，在大肠杆菌中实现了D-PHG的高效从头生物合成。关键策略包括：消除内源氨基转移酶催化的PGA-to-L-PHG竞争性副反应；通过敲除pykA/pykF和tyrA/tyrR强化PEP供应；过表达ppsA、pck增强PEP再生；过表达talB-tktA增强E4P供应；优化D-PhgAT启动子强度；基因组整合gdhA增强氨基供体供应；过表达nadK、pntAB等基因增强NADPH再生。最终摇瓶产量6.98 g/L，3-L补料分批发酵达到9.83 g/L。
尽管产量显著提升，补料分批发酵中PGA的持续积累表明转氨步骤仍是主要瓶颈。未来工作可聚焦于D-PhgAT的蛋白质工程改造以提高其催化效率。
编译者解读
该研究展示了合成生物学"设计-构建-测试-学习"循环的典型范例——从途径设计到多轮代谢工程迭代，每一步都有明确的代谢逻辑支撑。值得注意的是，研究团队选择了FMN依赖型SMDH而非H2O2生成型氧化酶，避免了副产物对细胞的氧化损伤，这一细节体现了途径酶选择的精巧性。9.83 g/L的产量在非天然氨基酸的微生物合成中具有竞争力，但距工业化仍有距离——转氨步骤的瓶颈提示D-PhgAT的催化效率和底物亲和力仍有优化空间。此外，3-L规模的成功放大为后续中试提供了基础，但葡萄糖到D-PHG的转化率（产率系数）原文未详述，这将是评估经济性的关键指标。
参考来源
Xiong Y, Shang Z, Lu L, Wang T, Cai G. Metabolic engineering of Escherichia coli for efficient production of d-phenylglycine. Synth Syst Biotechnol. 2025. PMCID: PMC13475659.
PMCID: PMC13475659