甜瓜CmVQ23异源表达正向调控拟南芥对黄萎病菌抗性

来源：Heterologous Expression of the Melon CmVQ23 Positively Regulates Resistance to Verticillium dahliae in Arabidopsis.（Plants (Basel)）| 编译：DNA Lab Space

📎 相关工具：蛋白可溶性优化分析

导读

黄萎病由土传真菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起，严重威胁甜瓜等经济作物生产。本研究通过QTL定位候选基因筛选，鉴定并功能验证了甜瓜VQ基序蛋白CmVQ23在抗黄萎病中的正调控作用。在拟南芥中异源过表达CmVQ23显著降低病害指数、限制真菌增殖，同时激活ROS/HR介导的细胞死亡、抗氧化酶系统、苯丙烷代谢途径及SA/JA-ET激素信号协同响应。该研究为甜瓜抗黄萎病育种提供了新的基因资源。

研究背景

大丽轮枝菌是一种土传植物病原真菌，可侵染棉花、番茄、甜瓜等多种经济作物，造成严重的维管束枯萎病害和全球范围内的产量损失。与棉花、番茄等作物在抗性资源鉴定方面已取得较大进展不同，甜瓜黄萎病抗性的遗传基础仍 largely 未被探索。已鉴定的抗性基因稀缺，阻碍了持久抗性品种的选育，因此发现并功能验证新的抗性相关位点成为甜瓜可持续生产的迫切需求。

转录重编程是植物免疫激活的基石，这一过程由转录因子及其调控辅因子紧密协调。含VQ（缬氨酸-谷氨酰胺）基序的蛋白构成一个植物特有的转录调控因子家族，主要通过与WRKY转录因子物理互作来调节其DNA结合活性和转录输出。在拟南芥中，SIB1和SIB2作为WRKY33的共激活因子增强对坏死型真菌的防御；在水稻中，OsWRKY10-OsVQ8模块通过MAPK介导的磷酸化调控二萜类植保素生物合成。然而，甜瓜中VQ蛋白在免疫中的功能尚未见报道。

研究方法

4.1 植物材料与生长条件

以拟南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0生态型为野生型对照。种子表面消毒程序：先将种子浸入75%乙醇处理5分钟，随后用2%次氯酸钠溶液温和振荡处理10分钟，再用无菌蒸馏水冲洗5次。消毒后的种子在4°C黑暗条件下春化3天，随后播种于含1%（w/v）蔗糖和0.7%（w/v）琼脂的1/2 Murashige and Skoog（1/2 MS）培养基上。7日龄幼苗移栽至蛭石、泥炭藓和堆肥-表土混合物按1:1:1（v/v）比例配制的土壤中。除非另有说明，平板幼苗和土培植株均在长日照光周期（16小时光照/8小时黑暗，125 µmol m⁻² s⁻¹）、昼夜温度分别为21°C和19°C的条件下培养。

【数据】消毒：75%乙醇5min + 2%次氯酸钠10min；春化：4°C黑暗3天；培养基：1/2 MS + 1%蔗糖 + 0.7%琼脂；光周期：16h光/8h暗，125 µmol m⁻² s⁻¹；温度：21°C/19°C（昼/夜）

4.2 CmVQ23的亚细胞定位

以抗病亲本MR1的cDNA为模板，使用含重组同源臂的基因特异性引物（表S1）扩增CmVQ23基因。PCR产物通过同源重组插入双元载体pCAMBIA1301-35S-EGFP，构建由CaMV 35S启动子驱动的C端EGFP融合表达载体。每个构建体分别转化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株。

亚细胞定位实验中，选取5-6叶期的本氏烟（Nicotiana benthamiana）植株，将含有各构建体或空载体（阴性对照）的农杆菌菌液渗透注射至叶片背面。注射后，植株在弱光条件下孵育2天。随后从注射区域切取叶盘，置于激光扫描共聚焦显微镜下观察。eGFP在488 nm激发、510 nm处收集发射光；叶绿体自发荧光在645 nm激发波长下检测。每个样品均采集图像。

【数据】载体：pCAMBIA1301-35S-EGFP；农杆菌菌株：GV3101；宿主：5-6叶期本氏烟；孵育：弱光2天；激发波长：eGFP 488nm/叶绿体645nm

4.3 农杆菌介导的拟南芥遗传转化

遗传转化使用双元载体pCAMBIA3301。质粒在大肠杆菌DH5α中扩增，植物转化采用农杆菌GV3101菌株。CmVQ23基因克隆至pCAMBIA3301载体的SacI和PstI限制性酶切位点之间。序列验证后，重组质粒转化至农杆菌GV3101。拟南芥通过花浸法（floral dip method）进行转化。转基因植株用基因特异性引物（表S1）进行PCR筛选以确认转基因整合，阳性株系用于后续分析。

为鉴定甜瓜基因MELO3C009755的拟南芥直系同源基因，使用BLASTP（NCBI，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）进行序列比对，参考基因组为甜瓜（DHL92）v4版本（葫芦科基因组数据库，http://cucurbitgenomics.org/）。针对拟南芥TAIR10蛋白数据库的搜索鉴定出AT3G56710为最接近的同源基因。根据TAIR数据库，AT3G56710编码SIB1（Sigma因子结合蛋白1），也称为AtVQ23（或VQ23）。基于这一直系同源关系，将甜瓜基因MELO3C009755更名为CmVQ23以体现其与AtVQ23的同源性。为进一步验证这一命名，在甜瓜中进行了VQ基序蛋白的全基因组系统鉴定，并与所有拟南芥VQ蛋白一起构建了系统发育树。系统发育分析确认CmVQ23与AT3G56710（AtVQ23/SIB1）聚类于同一进化支，支持其紧密的直系同源关系（图S1）。

【数据】转化载体：pCAMBIA3301；酶切位点：SacI和PstI；宿主菌：E. coli DH5α / A. tumefaciens GV3101；转化方法：花浸法；同源基因：AT3G56710（AtVQ23/SIB1）

4.4 RNA分离与qPCR分析

使用Plant Total RNA Isolation Kit Plus（Vazyme Biotech Co., Ltd., 南京，中国）从叶片中提取总RNA，按制造商说明书操作。制备三个独立生物学样品。使用Master Premix RT Easy™（Tiangen Biotech Co., Ltd., 北京，中国）合成第一链cDNA，按制造商说明书操作。qRT-PCR在ABI QuantStudio 3系统（abm, Waltham, MA, USA）上进行，20 μL反应体系包含：10 μL Real Time PCR Easy™-SYBR Green I（Yugong Biotech Co., Ltd., 南京，中国）、2 μL cDNA模板、正向/反向引物各0.5 μL、7 μL无核酸酶水。热循环程序：95°C初始变性3分钟，随后40个循环的95°C 15秒和60°C 1分钟。以AtActin为内参基因，相对基因表达量采用比较2⁻ΔΔCt法计算。所有qPCR引物列于表S1。

【数据】试剂盒：Vazyme Plant Total RNA Isolation Kit Plus；qPCR仪：ABI QuantStudio 3；反应体系：20 μL（SYBR Green I 10μL + cDNA 2μL + 引物各0.5μL + 水7μL）；程序：95°C 3min；40×（95°C 15s，60°C 1min）；内参：AtActin；定量方法：2⁻ΔΔCt

4.5 大丽轮枝菌活化与真菌接种

大丽轮枝菌VD991菌株在PDA培养基上划线活化，28°C培养4天。随后，含菌丝的琼脂块转移至PDA液体培养基中，28°C、200 rpm旋转摇床培养4-6天。活化后的真菌培养物经三层无菌纱布过滤以去除菌丝碎片。使用血球计数板测定孢子浓度，并用无菌蒸馏水调整至1 × 10⁷菌落形成单位（cfu）/mL。

接种采用根部灌浇法（root drench method）。每株拟南芥接受15 mL孢子悬浮液，分两次注射：首次向根部周围土壤注射10 mL，次日再注射5 mL。为保持湿度，植株用塑料薄膜覆盖。实验设三个独立生物学重复，每个重复至少10株。

【数据】活化：PDA培养基28°C 4天；液体培养：PDA液体28°C 200rpm 4-6天；孢子浓度：1×10⁷ cfu/mL；接种量：15mL/株（10mL+5mL）；生物学重复：3次，≥10株/重复

4.6 病害评估

病害严重程度根据病叶百分率和病情指数进行评估。病叶百分率按病叶数除以检查总叶数再乘以100%计算。病情指数方面，每株植物的严重程度分为6个等级（0至4级），标准如下：0级，健康生长，无萎黄、枯萎或病斑；1级，少于25%叶片出现黄化、枯萎或病斑；2级，25-50%叶片出现黄化、枯萎或病斑；3级，50-75%叶片出现黄化、枯萎或病斑，少数叶片干枯；4级，超过75%叶片枯萎或脱落或整株死亡。病情指数按（各级株数乘以级值之和）除以（检查总株数乘以4）计算，结果以百分比表示。

【数据】分级标准：0-4级（0级无症状；1级<25%叶片发病；2级25-50%；3级50-75%；4级>75%或整株死亡）；病情指数公式：Σ（各级株数×级值）/（总株数×4）×100%

4.7 生理生化指标测定

过氧化氢（H₂O₂）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、木质素和多酚氧化酶（PPO）的含量使用商业检测试剂盒按制造商说明书测定（北京索莱宝科技有限公司，北京，中国）。

【数据】检测指标：H₂O₂、POD、SOD、CAT、PAL、木质素、PPO；试剂盒：北京索莱宝

4.8 光合能力测定

叶绿素荧光参数使用IMAGING-PAM叶绿素荧光仪（Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany）测定。选取不同株系4周龄植株的第3和第4片完全展开成熟叶，在胁迫处理前后进行测量。记录以下参数：光系统II最大光化学效率（Fv/Fm）、光系统II实际光化学效率（Y(II)）、非调节性能量耗散的量子产额（Y(NO)）和非光化学淬灭（NPQ）。

【数据】仪器：IMAGING-PAM（Heinz Walz GmbH）；材料：4周龄植株第3-4片完全展开叶；参数：Fv/Fm、Y(II)、Y(NO)、NPQ

4.9 茎段真菌再分离实验

在接种大丽轮枝菌VD991后15天（dpi），从各株系采集茎段，切成约1 cm小段。茎段用75%乙醇表面消毒1分钟，无菌蒸馏水冲洗3次，在无菌滤纸上吸干。随后将茎段置于PDA培养基上，15天后观察真菌生长情况并拍照记录。

【数据】取样时间：15 dpi；茎段长度：约1 cm；消毒：75%乙醇1min + 无菌水洗3次；培养：PDA培养基15天

研究结果

2.1 CmVQ23定位于细胞核

作为含VQ基序的蛋白，CmVQ23被推测作为转录辅因子发挥作用，这一角色通常需要核定位。为验证这一假设，首先在本氏烟叶片中通过瞬时表达实验检测了CmVQ23的亚细胞分布。将CmVQ23全长编码序列与eGFP融合，置于pCAMBIA1301载体中组成型35S启动子控制之下。所得构建体通过农杆菌浸润在本氏烟叶片中瞬时表达，在浸润后48小时检查下表皮细胞的荧光信号。在浸润表达游离eGFP的对照载体叶片中，荧光均匀分布于细胞质、质膜和细胞核，表明游离eGFP的非特异性定位。相比之下，CmVQ23-eGFP融合蛋白表现出强烈的核信号，细胞质中几乎检测不到荧光，表明其特异性核定位（图1）。这一核定位与其作为转录辅因子的预测角色一致，因为VQ蛋白通常通过与转录因子互作在细胞核中发挥调控功能。综上，这些结果表明CmVQ23定位于细胞核，支持其可能作为参与甜瓜抗黄萎病免疫应答的转录辅因子的假说。

为进一步在分子水平表征CmVQ23，检查了其基因结构和预测蛋白序列中保守功能基序的存在。通过比较编码序列（CDS）与甜瓜DHL92 v4基因组中相应基因组序列，分析了CmVQ23的基因组组织。如图S2A所示，CmVQ23不含内含子，这一特征与高等植物中大多数VQ蛋白编码基因一致。CmVQ23全长蛋白由143个氨基酸残基组成，包含多个与其作为转录辅因子功能相关的保守结构特征（图S2B）。

首先，通过NCBI CD-Search鉴定出典型的VQ基序（第39-64位残基），包含保守核心序列VQEL（第56-60位残基），确认CmVQ23属于VQ蛋白家族。其次，在第20-41位残基预测到双分型核定位信号（NLS）（得分为8），与其在瞬时表达实验中观察到的核定位一致。第三，使用ELM（真核线性基序）资源鉴定出两个推定的钙调蛋白（CaM）结合IQ基序（第38-53位和第101-116位残基），以及一个额外的CaM结合位点（第116-131位残基），提示CmVQ23可能在免疫激活过程中响应钙信号。第四，使用ScanProsite在第80-90位和第134-143位残基预测到潜在的MAPK对接位点，暗示CmVQ23可能受MAPK磷酸化介导的调控，这一机制在多个VQ蛋白中已有报道。综上，这些结构特征使CmVQ23成为配备多个功能结构域的VQ蛋白，可能有助于其在植物防御中的转录调控、钙感应和MAPK介导的信号转导中发挥作用。

【数据】定位：细胞核（CmVQ23-eGFP）；观察时间：浸润后48h；蛋白长度：143个氨基酸；VQ基序：第39-64位（核心序列VQEL第56-60位）；NLS：第20-41位（得分8）；CaM结合IQ基序：第38-53位和第101-116位；额外CaM结合位点：第116-131位；MAPK对接位点：第80-90位和第134-143位；内含子：无

2.2 CmVQ23转基因拟南芥株系的创制与鉴定

为研究CmVQ23的生物学功能，通过农杆菌介导的转化方法，在组成型35S启动子控制下生成了过表达该甜瓜基因的稳定转基因拟南芥株系。纯合T3株系通过qRT-PCR筛选确认，CmVQ23转录水平使用基因特异性引物（表S1）通过qRT-PCR定量。在6个独立转基因株系（OE1-OE6）中，3个株系OE4、OE5和OE6表现出显著较高的表达水平，其中OE5在以AtACTIN为内参基因标准化后积累量最高。野生型（WT）Col-0植株未检测到转基因表达，符合预期（图2B）。这3个高表达株系被选用于后续所有功能实验。

【数据】转基因株系：OE1-OE6；高表达株系：OE4、OE5、OE6（OE5最高）；内参：AtACTIN；WT无转基因表达

2.3 CmVQ23过表达增强拟南芥对黄萎病的抗性

为评估CmVQ23是否有助于黄萎病抗性，采用根部灌浇法将大丽轮枝菌VD991菌株接种WT、3个过表达株系（OE4、OE5和OE6）以及一个先前已表征的突变体株系（SALK_127478）。根据WT植株在接种后15天（dpi）观察到的叶片枯萎表型，建立了0至4级的五级病害严重度分级标准（图3D）。病害进展监测20天，计算各基因型的病情指数和病叶比例。

在20 dpi时，所有3个过表达株系均表现出显著低于WT的病情指数和病叶比例（图3A-C）。大多数转基因植株处于0-1级严重度，仅有轻微萎黄或无明显症状。形成鲜明对比的是，突变体株系表现出显著更高的病情指数，大多数植株出现对应3-4级的严重枯萎和坏死（图3A,E）。

为进一步证实这些表型观察结果，进行了真菌再分离实验。在15 dpi时从接种植株切取茎段，表面消毒后置于PDA培养基上。培养15天后，过表达株系的外植体仅出现少量或无真菌长出，而突变体株系的外植体支持大量菌丝增殖，真菌生长区域明显宽于过表达株系（图3F）。此外，使用大丽轮枝菌特异性引物（表S1）通过qPCR定量了感染幼苗中的真菌生物量。过表达株系携带的真菌DNA水平显著低于WT，而突变体株系积累的真菌生物量最高（图3G）。综上，这些结果表明CmVQ23的异源过表达显著增强了拟南芥对大丽轮枝菌VD991菌株的抗性。

【数据】接种方法：根部灌浇；评估时间点：20 dpi；病情指数：OE株系显著低于WT，突变体显著高于WT；真菌再分离：15 dpi取样，PDA培养15天；真菌生物量：qPCR定量，OE株系显著低于WT，突变体最高

2.4 CmVQ23组成型过表达损害拟南芥营养生长

在正常生长条件下对转基因株系进行表型监测时，意外观察到与CmVQ23过表达相关的营养发育一致性改变。播种后28天，OE4、OE5和OE6的株高较WT显著降低，且生长抑制在后期发育阶段（14、21和28天）愈加明显（图2A,C）。此外，这些转基因株系的开花时间较WT延迟，表明营养生长向生殖生长转变受到干扰（图2A）。

根系发育也受到CmVQ23过表达的影响。在垂直1/2 MS培养基上生长时，OE株系在萌发后7天的主根长度显著短于WT，而突变体株系与WT无显著差异（图2D,E）。过表达株系的整体根系结构分支较少，但未进行定量评估。

相比之下，突变体株系在测定的任何地上部或根部参数上与WT均无显著差异，表明观察到的生长表型特异性地与CmVQ23过表达相关，而非遗传背景变异所致。这些观察结果表明，该防御相关VQ基因的组成型表达会带来可检测的生长代价。

【数据】株高：28天时OE4/OE5/OE6显著低于WT；抽薹：OE株系延迟；主根长：萌发后7天OE株系显著短于WT；突变体：与WT无显著差异

2.5 CmVQ23促进ROS积累和超敏反应介导的细胞死亡

（原文节选此处截断，以下基于摘要与图注信息整合翻译）

接种大丽轮枝菌后，CmVQ23过表达株系表现出活性氧（ROS）积累增加和超敏反应（HR）介导的细胞死亡。DAB染色显示，在接种后12小时（hpi），过表达株系叶片中H₂O₂积累增强（图4A）。台盼蓝染色显示，过表达株系在感染位点出现大量蓝染，表明死亡细胞数量较多，反映了HR介导的程序性细胞死亡；突变体株系死亡细胞明显较少，WT处于中间水平（图4B）。

【数据】DAB染色：12 hpi检测H₂O₂；台盼蓝染色：12 hpi，染色40min；OE株系蓝染显著增强（细胞死亡多），突变体最少，WT居中

2.6 CmVQ23过表达增强抗氧化酶活性并增加木质素沉积

接种大丽轮枝菌后，测定了转基因和WT拟南芥中CAT、POD、SOD活性以及H₂O₂、PPO、PAL和木质素含量。结果显示，过表达株系在感染条件下表现出显著升高的抗氧化酶活性和木质素沉积（图5）。

【数据】检测指标：CAT、POD、SOD、H₂O₂、PPO、PAL、木质素；OE株系显著高于WT（具体数值原文未详述）

2.7 CmVQ23过表达缓解黄萎病胁迫下光合效率的抑制

在15 dpi时，记录了各株系的叶绿素荧光参数。突变体株系表现出显著降低的Fv/Fm、Y(NPQ)和Y(II)，以及升高的Y(NO)，表明病原菌攻击下发生严重的光抑制和增强的热耗散。相比之下，3个过表达株系（OE4-OE6）均表现出升高的Fv/Fm和Y(II)以及降低的Y(NPQ)，证明CmVQ23过表达保护了PSII光化学效率并减轻了能量耗散，从而有助于提高拟南芥对黄萎病的抗性（图6）。

【数据】突变体：Fv/Fm↓、Y(NPQ)↓、Y(II)↓、Y(NO)↑；OE株系：Fv/Fm↑、Y(II)↑、Y(NPQ)↓；测量时间：15 dpi；仪器：PAM荧光仪；生物学重复：3次（n=3/基因型）

2.8 CmVQ23过表达上调防御相关基因

在mock和接种大丽轮枝菌条件下，检测了SA响应基因（AtPR1、AtPR2、AtPR5和AtPAD4）和JA/ET响应基因（AtPDF1.2和AtVSP2）在WT、突变体和过表达株系中的相对转录水平。3周龄幼苗接种大丽轮枝菌VD991菌株，在3 dpi时采集莲座叶进行qRT-PCR分析。表达值以AtACTIN为内参标准化，并相对于WT mock样品展示。在mock条件下，各基因型间基因表达无显著差异。接种大丽轮枝菌后，过表达株系所有检测防御基因的转录水平均显著高于WT，而突变体表达显著降低（图7）。

【数据】检测基因：AtPR1、AtPR2、AtPR5、AtPAD4（SA响应）、AtPDF1.2、AtVSP2（JA/ET响应）；接种时间：3 dpi取样；内参：AtACTIN；mock条件下无差异；感染后OE株系显著高于WT，突变体显著降低

讨论与解读

本研究通过拟南芥异源过表达策略，功能鉴定了甜瓜VQ基序蛋白CmVQ23作为大丽轮枝菌抗性的正调控因子。CmVQ23通过多层面防御响应赋予增强的抗性，包括ROS触发的超敏细胞死亡、氧化还原稳态维持、苯丙烷途径激活、光合保护以及SA和JA/ET信号间的协同串扰。这是甜瓜中首个经功能鉴定的参与抗病性的VQ蛋白。

与其他VQ蛋白的比较揭示了保守和谱系特异性的特征。CmVQ23的正调控功能与拟南芥SIB1/SIB2（通过WRKY33激活camalexin生物合成抗坏死型真菌）、水稻OsVQ8（与OsWRKY10协同调控二萜类植保素产生）以及番茄SlVQ15的正调控作用一致。然而，CmVQ23同时激活SA和JA/ET两条信号通路的特点，区别于仅激活单一信号通路的VQ蛋白，这可能反映了甜瓜对维管束病原菌的独特防御策略。

值得注意的是，CmVQ23组成型过表达伴随生长代价——株高降低、抽薹延迟、主根变短。这种防御-生长权衡在抗病基因研究中并不罕见，但在实际育种应用中需要权衡利弊。未来可考虑病原菌诱导型启动子驱动CmVQ23表达，以规避生长抑制。

编译者解读：该研究采用"QTL定位候选基因+异源表达验证"的策略，在模式植物拟南芥中快速完成了甜瓜抗病基因的功能鉴定，方法学上具有可复制性。CmVQ23同时激活SA和JA/ET通路的特性使其区别于多数仅偏向单一通路的VQ蛋白，这一发现对理解维管束病原菌防御的激素协同机制具有价值。研究局限在于：甜瓜自身的稳定转化验证尚缺，且组成型过表达带来的生长代价限制了其直接应用潜力。从合成生物学角度看，利用病原菌诱导型启动子或组织特异性启动子驱动CmVQ23，有望在保持抗病性的同时规避生长抑制，是该基因走向作物改良应用的关键下一步。

参考来源

Yu P, Lu S, Zhou J, Wang X, Ning X. Heterologous Expression of the Melon CmVQ23 Positively Regulates Resistance to Verticillium dahliae in Arabidopsis. Plants (Basel). PMID: 42588787

PMID: 42588787