来源：Biomineralization of Glucose Oxidase from Aspergillus niger in ZIF-zni for Enhanced Biocatalytic Performance.（Bioengineering (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
酶固定化是提升工业酶稳定性的关键策略。本研究首次将黑曲霉葡萄糖氧化酶（GOx）通过生物矿化封装入ZIF-zni框架，系统考察了锌离子浓度和Zn:Im比对固定化性能的影响。优化后的GOx@ZIF-zni生物复合材料比活性达2051 IU g⁻¹，是此前GOx@ZIF-8体系（874 IU g⁻¹）的两倍以上，且在65°C处理一小时后仍保留高达50%的活性。该研究表明，框架拓扑结构和合成条件对酶@MOF生物复合材料的催化性能与稳定性具有决定性作用。
研究背景
葡萄糖氧化酶（GOx，EC 1.1.3.4）是葡萄糖-甲醇-胆碱（GMC）氧化还原酶家族的重要黄素蛋白，由两个通过氢键和疏水作用结合的均一亚基构成，每个亚基含一个黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和底物结合域。该酶催化β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸内酯，以分子氧为电子受体释放H₂O₂。GOx广泛应用于食品化学、医药化学、精细化工、燃料工业及环境污染控制等领域，但其游离酶在有机溶剂、高温和非最适pH等工业条件下稳定性不足。
生物矿化已成为酶固定化的高效策略。沸石咪唑酯框架（ZIFs）作为金属-有机框架（MOFs）的重要亚类，因其结构可调性和化学稳定性而备受关注。ZIF-8已被广泛研究，但其更致密、热力学更稳定的类似物ZIF-zni却鲜受关注。已有文献报道漆酶可通过Zn²⁺和咪唑（Im）在zni拓扑结构的ZIFs中实现生物矿化固定。本研究报道了黑曲霉GOx在ZIF-zni框架中的生物矿化，并系统考察了锌和咪唑浓度对固定化性能的影响。
研究方法
2.1 材料
黑曲霉葡萄糖氧化酶（GOx）、辣根过氧化物酶（HRP）和咪唑（Im）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）；2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）购自AppliChem（德国达姆施塔特）。高碘酸钠（NaIO₄）购自VWR Chemicals（比利时鲁汶）。D-葡萄糖一水合物和二水合乙酸锌（Zn(O₂CCH₃)₂·2H₂O）购自Lachner（捷克涅拉托维采）。十二烷基硫酸钠（SDS）购自Serva（德国海德堡）。所有试剂均为分析纯，所有溶液均用蒸馏水配制。
2.2 仿生矿化
将天然葡萄糖氧化酶储备液和Zn(OOCCH₃)₂·2H₂O储备液混合搅拌一分钟。搅拌一分钟后，将反应混合物加入咪唑溶液中，混合30分钟。该过程中，酶的最终浓度为0.35 mg/mL。乙酸锌的最终浓度分别为10、20和60 mM。咪唑溶液的最终浓度分别为乙酸锌溶液浓度的10、20、50和100倍。搅拌后，悬浮液在室温下静置12小时。随后，反应混合物以6000 rpm离心10分钟。离心后收集上清液，所有沉淀用蒸馏水洗涤三次。洗涤后的沉淀在10% w/v SDS溶液中孵育30分钟。之后，悬浮液再次离心，弃去上清液，沉淀依次用0.1 M醋酸钠缓冲液（pH = 5.5）洗涤两次、96% w/v乙醇洗涤两次、蒸馏水洗涤一次。
2.3 材料微观结构和晶体结构分析
使用ThermoFisher Scientific Apreo 2C（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）扫描电子显微镜（SEM）在10,000×放大倍数和1 kV加速电压下分析颗粒形貌和尺寸。测量前未对样品进行导电镀层处理。材料晶体结构研究使用Rigaku Smartlab（日本东京）X射线衍射仪，采用Bragg-Brentano几何构型，1D检测器模式，粉末样品。样品在连续扫描模式下记录，扫描速率为5 °C/min，2θ范围为5–50°。
2.4 BET分析
氮气物理吸附测量在NOVAtouch LX2（安东帕，奥地利格拉茨）上进行，温度为77 K。气体吸附实验前，材料在130°C真空条件下干燥脱气3小时。Brunauer-Emmett-Teller（BET）比表面积根据P/P₀范围为0.015至0.07的氮气吸附等温线计算。总孔体积根据P/P₀ = 0.95处的氮气吸附等温线计算。
2.5 活性测定
以ABTS为底物测定活性，方法如前所述[23]。活性测定反应混合物含1 mM ABTS、1 U/mL HRP和0.25 M D-葡萄糖，溶于0.1 M醋酸钠缓冲液（pH = 5.5）。通过监测405 nm处吸光度变化测定活性，氧化态ABTS的消光系数为36.8 mM⁻¹ cm⁻¹。在这些测定中，1 U活性定义为在25°C下每分钟转化1 µmol D-葡萄糖所需的酶量。
固定化性能参数（Y_A、Y_P、P_loading、比活性和有效因子η）按第3.2节所述并基于先前报道的方法计算。
2.6 pH活性和稳定性测定
以ABTS为底物测定活性。pH活性测定反应混合物含1 mM ABTS、1 U/mL HRP和0.25 M D-葡萄糖，溶于0.05 M醋酸钠-磷酸盐-甘氨酸缓冲液（pH = 3.5–8.5）。稳定性评估时，生物复合材料在缓冲液中孵育30分钟，然后按前述方法在0.1 M醋酸钠缓冲液（pH 5.5）中测定活性。
2.7 热稳定性测定
所有样品的热稳定性通过在65°C水中孵育1小时测定，比活性按前述方法测定。样品的残余活性定义为65°C孵育前后比活性的比值。
【数据】酶浓度：0.35 mg/mL；锌浓度：10/20/60 mM；Zn:Im比：1:10/1:20/1:50/1:100；室温静置：12h；离心：6000 rpm，10min；SDS洗涤：10% w/v，30min；缓冲液洗涤：0.1 M醋酸钠（pH 5.5）×2次，96%乙醇×2次，蒸馏水×1次；SEM：10000×，1kV；PXRD：5°C/min，2θ 5–50°；BET脱气：130°C真空3h；BET计算范围：P/P₀ 0.015–0.07；总孔体积计算：P/P₀=0.95；活性测定波长：405nm；消光系数：36.8 mM⁻¹cm⁻¹；活性测定温度：25°C；pH缓冲液范围：pH 3.5–8.5；热稳定性：65°C，1h
研究结果
我们前期的研究已证明，将葡萄糖氧化酶固定在ZIF-8中可提供温和的固定化条件，并增强对温度和去污剂的稳定性[23]。然而，文献报道某些酶（如漆酶）可被固定在具有不同于ZIF-8的sod拓扑结构和孔隙率的其他ZIFs中。有报道称漆酶可通过Zn²⁺和咪唑（Im）在zni拓扑结构的ZIFs中实现生物矿化固定[24]。自1980年首次报道以来，已发展出多种ZIF-zni的合成方法[25]。此外，Liang等人证明锌与2-甲基咪唑的比例可能影响蛋白质ZIF-8生物复合材料中生物大分子的分布和结构[26]。因此，为优化GOx的固定化，我们进行了实验，考察改变生物矿化中使用的配体以及改变Zn:Im比对生物复合材料结构和活性的影响。所有实验中葡萄糖氧化酶的最终浓度为0.35 mg/mL。锌(II)离子的最终浓度分别为10、20和60 mM。Zn:Im比分别为10、20、50和100。与之前的实验一样，将锌水溶液与蛋白质溶液混合，然后将混合物加入咪唑中。这种组分添加顺序源于锌离子通过静电相互作用与蛋白质表面结合。随后，加入咪唑溶液后，咪唑与锌之间形成配位共价键。
3.1 结构表征
合成后，生物复合材料用蒸馏水洗涤，并使用粉末X射线衍射（PXRD）、SEM和BET方法表征以确定其拓扑结构。PXRD分析确认样品采用zni拓扑结构，其衍射图谱与模拟的ZIF-zni一致（图1）。
两个实验样品均显示zni拓扑结构的特征反射，在约15.2°（2θ）处有主峰，对应（110）晶面，与从已报道的ZIF-zni CIF结构获得的模拟图谱高度一致[25]。这些反射的保持证实了ZIF-zni相的形成，并表明酶封装过程未改变晶体框架。与ZIF-zni相比，GOx@ZIF-zni生物复合材料表现出略微降低的峰强度和轻微峰展宽，这与生物矿化过程中酶分子掺入框架导致结晶度小幅下降一致。
SEM成像显示晶体具有均匀、紧密堆积的棱柱形貌，表面光滑，边缘锐利（图2）。
SEM分析（图2）显示，ZIF-zni和GOx@ZIF-zni样品均具有zni拓扑结构特征的棱柱状晶体形貌。然而，GOx@ZIF-zni颗粒略小，且与ZIF-zni相比表现出表面不规则性，表明合成过程中葡萄糖氧化酶的掺入影响了晶体生长动力学，导致晶体表面部分粗糙化。这些观察结果与PXRD结果一致，后者也表明酶封装后结晶度略有下降。
ZIF-zni和GOx@ZIF-zni的N₂吸附-脱附等温线（77 K）显示典型的I型行为，证实两种材料均为微孔材料（图3A）。
GOx@ZIF-zni的BET比表面积测定为5.32 m²/g。相比之下，ZIF-zni无法获得物理上有意义的BET拟合，因为在适用的相对压力范围内氮气吸附极低，使得BET模型失去物理意义。GOx@ZIF-zni观察到的比表面积归因于酶诱导的结构异质性，包括颗粒间空隙和缺陷相关的表面贡献，而非固有的框架孔隙率。
尽管ZIF-zni通常被认为是致密且几乎无孔的框架，但GOx@ZIF-zni生物复合材料的总孔体积（0.0225 mL/g）略高于ZIF-zni（0.0109 mL/g）。这一增加可归因于仿生矿化过程中诱导的结构修饰，其中葡萄糖氧化酶的存在影响成核和晶体生长，导致颗粒间空隙和结构缺陷的形成。
BJH孔径分布（图3B）进一步支持了这一观察，表明GOx@ZIF-zni中介孔特征的贡献更为显著。虽然两种样品均保持主要为微孔的特征，但BJH分析揭示了由颗粒间空隙和缺陷相关结构产生的额外织构介孔性。两种样品之间的孔径分布存在明显差异。ZIF-zni在更宽的直径范围内表现出更宽泛和分散的分布，而GOx@ZIF-zni在小孔径区域（约1–2 nm）表现出更显著的贡献。这表明酶的掺入不仅阻塞了孔系统，还改变了结晶途径，促进了额外小织构孔和缺陷相关空隙的形成。这些结构修饰可能通过缺陷介导途径促进底物扩散，与洗涤掉表面吸附酶分子后生物复合材料仍保持催化活性的现象一致。
织构差异与SEM观察结果（图2）一致，后者显示GOx@ZIF-zni含有更高比例的破碎和不规则棱柱颗粒，而纯ZIF-zni则具有清晰定义的晶体。这种形态破坏表明堆积较不紧密、微观结构更开放，解释了尽管掺入了酶，孔体积增加和织构可及性改善的原因。
总体而言，BET、BJH和SEM的综合分析表明，酶掺入ZIF-zni框架改变了晶体生长和形貌，形成了结构异质性材料，具有增强的底物可及性，有利于生物催化应用。
3.2 动力学固定化性能参数
测定了生物复合材料经水和10%（w/v）SDS洗涤后的酶活性和热稳定性。由于GOx@ZIF-zni生物复合材料代表异质结构，可用多种参数表征，因此需要对固定化酶的主要特征进行全面评估[27]。与我们之前的工作一样，我们使用了文献中描述的若干关键固定化参数来表征生物复合材料。活性平衡（Y_A）定义为固定化酶活性与用于固定化的酶活性之比（固定化酶活性（U）/投入酶活性（U）×100%）。蛋白质平衡（Y_P）表示总固定化蛋白质量与生物矿化过程中所用蛋白质量之比（固定化蛋白质质量（g）/所用蛋白质质量（g）×100%）[28]。蛋白质负载量（P_loading）表示单位质量生物复合材料中固定化蛋白质（酶）的质量，以mg/g表示（生物复合材料中固定化蛋白质质量（mg）/生物复合材料质量（g））[29]。生物复合材料的比活性定义为每质量固体生物复合材料中活性酶的量（生物复合材料酶活性（U）/生物复合材料质量（g）），而结合酶的比活性定义为每毫克固定化酶的活性（生物复合材料比活性（U/g）/生物复合材料中固定化酶质量（mg/g））[27]。有效因子（η）是结合酶比活性与游离可溶酶比活性之比（结合酶比活性（U/mg酶）/游离酶比活性（U/mg游离酶）×100%）[30]。这些参数为评估固定化性能提供了全面的框架。
GOx@ZIF-zni生物复合材料仅用水洗涤后的比活性如图4所示。
GOx@ZIF-zni生物复合材料经蒸馏水和10% SDS洗涤后的比活性如图5所示。
在10 mM Zn²⁺和Zn:Im比为1:10条件下合成的GOx@ZIF-zni生物复合材料表现出最高的比活性，达到2051 IU g⁻¹，这超过我们此前研究中GOx@ZIF-8所获得活性（874 IU g⁻¹）的两倍。值得注意的是，即使经过10% SDS的严苛洗涤，该生物复合材料仍保留了显著的催化活性，表明酶被牢固地封装在ZIF-zni框架内，而非仅仅表面吸附。
由20 mM Zn²⁺和Zn:Im比为1:50制备、仅用蒸馏水洗涤的GOx@ZIF-zni生物复合材料，其活性对pH的依赖性如图6所示。
仅用蒸馏水洗涤的GOx@ZIF-zni生物复合材料在65°C孵育一小时后的残余活性如图7所示。
仅用蒸馏水和10%（w/v）SDS洗涤的GOx@ZIF-zni生物复合材料在65°C孵育一小时后的残余活性如图8所示。
热稳定性实验表明，GOx@ZIF-zni生物复合材料在65°C孵育一小时后仍保留高达50%的活性，显示出优异的抗热变性能力。这种热稳定性增强可归因于ZIF-zni框架对酶的物理约束和保护作用，限制了高温下酶的变性展开。
【数据】最佳合成条件：10 mM Zn²⁺，Zn:Im = 1:10；最高比活性：2051 IU g⁻¹；对比值：GOx@ZIF-8为874 IU g⁻¹；GOx@ZIF-zni BET比表面积：5.32 m²/g；GOx@ZIF-zni总孔体积：0.0225 mL/g；ZIF-zni总孔体积：0.0109 mL/g；PXRD主峰：约15.2°（2θ），对应（110）晶面；N₂吸附温度：77 K；65°C孵育1h后残余活性：高达50%；BJH介孔范围：1–10 nm；GOx@ZIF-zni小孔贡献区：约1–2 nm
讨论与解读
本研究结果表明，合成混合物的组成和框架拓扑结构在决定酶@MOF生物复合材料的催化性能方面都起着至关重要的作用。与我们此前关于GOx@ZIF-8的研究（方钠石拓扑提供了相对开放和多孔的结构）相比，本研究聚焦于ZIF-zni——一种更致密、热力学更稳定的框架。
尽管ZIF-zni名义上无孔，但GOx@ZIF-zni生物复合材料表现出比GOx@ZIF-8更高的比活性。这一看似矛盾的现象表明，催化性能并非仅由固有框架孔隙率决定，而是由结构缺陷、颗粒间空隙和仿生矿化过程中产生的局部微环境效应的组合所共同决定。SEM和BET分析支持这一解释，表明生物复合材料中存在结构不规则性和额外的可及体积，这可能促进了底物扩散。因此，GOx@ZIF-zni比不含酶的ZIF-zni表现出略高的N₂吸附量。鉴于zni拓扑结构固有的致密无孔特性，这一增加不能归因于更大固有孔的形成，而应归因于仿生矿化过程中产生的缺陷和颗粒间空隙。这一观察为所提出的负责催化活性的扩散途径提供了直接的实验支持。
SDS抗性实验进一步证实了酶的稳定封装。ZIF-zni框架不仅能保护酶免受表面活性剂的变性作用，还能在高温下维持酶的活性构象。这些发现共同表明，ZIF-zni是酶固定化的极具前景的载体，框架拓扑结构和合成条件在决定酶@MOF生物复合材料的催化性能和稳定性方面起着关键作用。
编译者解读：本研究巧妙利用了ZIF-zni"名义无孔却性能更优"的反直觉现象，揭示了酶@MOF生物复合材料中缺陷工程和颗粒间空隙对催化性能的关键贡献。从合成生物学应用角度看，这一发现拓展了酶固定化载体的选择范围——不必执着于高比表面积框架，致密框架配合生物矿化诱导的结构缺陷同样能实现优异的催化表现。2051 IU g⁻¹的比活性是GOx@ZIF-8体系的两倍以上，且SDS和高温耐受性显著提升，这对工业应用中酶制剂的回收利用和长期稳定性具有重要意义。局限在于，ZIF-zni合成中较高的咪唑用量可能增加规模化生产成本，且缺陷结构的可控性有待进一步探索。
参考来源
Stanišić M, Crnoglavac Popović M, Knežević N, Radenković M, Bajac B. Biomineralization of Glucose Oxidase from Aspergillus niger in ZIF-zni for Enhanced Biocatalytic Performance. Bioengineering (Basel). PMID: 42072259.
PMID: 42072259