来源：Mechanistic and Structural Analysis of Aflatoxin B1 Degradation by Bacillus safensis Multicopper Oxidase.（Foods）| 编译：DNA Lab Space
导读
黄曲霉毒素B1（AFB1）是食品和饲料安全领域最具威胁的真菌毒素之一。本研究从 Bacillus safensis 中鉴定并表征了一种新型多铜氧化酶 BsaMCO，该酶在37°C下24小时内可实现超过78%的AFB1降解率。通过LC-MS、分子对接、100 ns全原子分子动力学模拟及HepG2细胞毒性评估，研究系统揭示了BsaMCO的降解机制、结构基础与安全性，为AFB1脱毒提供了兼具机制解析和应用潜力的生物催化剂。
研究背景
黄曲霉毒素（AFTs）主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，广泛污染全球食品和饲料。其中AFB1毒性最强，具有肝毒性、遗传毒性和致癌性。AFB1化学性质稳定，难以从食品基质中去除。欧盟法规(EU) 2023/915及美国FDA均设定了严格的限量标准（人类食品总黄曲霉毒素超过20 μg/kg即视为掺假）。现有物理化学脱毒方法（臭氧、氨化、紫外照射）受基质效应限制，效果不稳定。生物酶法脱毒因条件温和、底物特异性高而备受关注，但传统全细胞筛选策略受细胞壁通透性等因素制约。本研究采用反向酶学策略，从 Bacillus safensis 中发掘AFB1降解酶并系统解析其机制。
研究方法
2.1 化学试剂
AFB1购自青岛普瑞邦生物工程有限公司。细胞实验用AFB1母液以二甲基亚砜（DMSO）配制，避光保存，使用前以细胞培养基稀释至工作浓度；所有孔（含溶剂对照）中DMSO终浓度保持恒定且低于0.05%（v/v）。非细胞实验（如体外降解反应和分析检测）中，AFB1母液以甲醇配制，并根据需要以磷酸盐缓冲液（PBS）或相应反应缓冲液稀释。
细胞培养用DMEM培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，胎牛血清（FBS）购自北京亿奥邦生物技术研究有限公司，青霉素-链霉素溶液购自Biosharp（合肥）。Annexin V-APC/PI凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物。Calcein-AM和碘化丙啶（PI）购自MedChemExpress（MCE）。其余化学品均为分析纯。
【数据】DMSO终浓度：<0.05% (v/v)；AFB1来源：青岛普瑞邦；凋亡试剂盒：凯基生物
2.2 酶的制备、表达与纯化
BsaMCO编码序列从 Bacillus safensis 基因组DNA扩增，利用BamHI和XhoI限制性位点克隆至pET-28a-SUMO载体（Novagen）。重组质粒在大肠杆菌DH5α中扩增，经菌落PCR和酶切验证后转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达。转化子在含卡那霉素（50 μg/mL，Solarbio）的LB琼脂平板上筛选。
重组表达时，挑取单个BL21(DE3)菌落接种至含卡那霉素（50 μg/mL）的LB培养基中，37°C振荡培养至OD600 ≈ 0.6。加入IPTG（Solarbio）至终浓度0.5 mmol/L诱导蛋白表达，25°C振荡培养10小时。4°C离心收集菌体，重悬于含1 mmol/L PMSF（Sangon）的预冷PBS中，冰浴间歇超声破碎。裂解液离心（12,000 rpm，30 min，4°C）澄清，收集可溶组分进行亲和纯化。
纯化时，上清液上样至经PBS预平衡的Ni Sepharose™ 6 Fast Flow树脂（Cytiva），4°C孵育使His标签融合蛋白充分结合。去除流穿液后，依次以PBS和含10 mM咪唑的PBS洗涤去除非特异性结合蛋白。随后直接将SUMO蛋白酶（Smart-Lifesciences）加入树脂，在推荐条件下进行柱上酶切。酶切后以梯度咪唑（50、100、150、200、250和300 mM）分步洗脱目标蛋白，每个浓度收集5 mL组分。各组分经SDS–PAGE分析，合并含BsaMCO的组分用于后续实验。除非另有说明，所有操作均在4°C或冰上进行以保持酶活性。
【数据】卡那霉素：50 μg/mL；诱导剂IPTG：0.5 mmol/L；诱导条件：25°C，10 h；裂解离心：12,000 rpm，30 min，4°C；PMSF：1 mmol/L；咪唑梯度：10–300 mM；收集体积：5 mL/组分
2.3 体外AFB1降解实验
体外AFB1降解使用纯化的无标签BsaMCO进行。所有实验中酶浓度为5 µg/mL。非细胞实验中，AFB1以甲醇溶解后加入反应体系至终浓度2.5 μg/mL。反应通过向PBS反应缓冲液中加入酶液启动，37°C避光静置孵育24小时。设置仅毒素对照（AFB1不加酶）和仅酶对照（酶不加AFB1），以排除非酶损失和基质干扰。
孵育结束后，加入等体积LC级甲醇终止反应，12,000 rpm离心30分钟去除蛋白和颗粒物。上清液经PTFE滤膜过滤后进行色谱分析。残留AFB1以HPLC-UV按峰面积定量。色谱分离采用ZORBAX SB-C18柱（4.6 × 150 mm，5 μm，Agilent），流动相为50%甲醇水溶液，流速1 mL/min，检测波长365 nm。方法验证：线性范围0.1–50 μg/mL（R² > 0.998），检出限（LOD）0.03 μg/mL，定量限（LOQ）0.1 μg/mL，回收率95–105%。日内和日间精密度RSD均低于5%。
降解率计算公式：降解率(%) = (对照 − 处理)/对照 × 100%。
【数据】酶浓度：5 µg/mL；AFB1浓度：2.5 μg/mL；孵育：37°C，24 h，避光；离心：12,000 rpm，30 min；HPLC条件：SB-C18柱，50%甲醇，1 mL/min，365 nm；线性范围：0.1–50 μg/mL；LOD：0.03 μg/mL；LOQ：0.1 μg/mL；回收率：95–105%
2.4 降解条件优化
采用单因素法优化降解条件。标准反应体系为：AFB1 2.5 μg/mL（非细胞实验以甲醇母液配制），纯化无标签BsaMCO，PBS反应缓冲液，避光静置孵育24小时。每个条件均设置匹配的仅毒素对照和仅酶对照。残留AFB1以HPLC-UV定量。
底物浓度：AFB1终浓度分别设为2.5、5、10、15和20 μg/mL，其余条件不变。
温度：在4–90°C范围内评估温度影响，孵育24小时。
pH：将反应缓冲液调至pH 2–12，孵育24小时。
金属离子：分别向标准反应体系加入终浓度1 mmol/L的Fe²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、NH₄⁺、Na⁺和K⁺。不加离子的反应作为对照。
电子受体：分别向标准反应体系补充SA、PQQ、PMS、ABTS、NAD⁺、NADP⁺、FAD和DCPIP，避光孵育24小时后HPLC-UV定量。
所有优化实验孵育结束后，加入等体积LC级甲醇终止反应，12,000 rpm离心30分钟，经0.22 μm有机滤膜过滤后进行色谱分析。
【数据】底物浓度梯度：2.5–20 μg/mL；温度范围：4–90°C；pH范围：2–12；金属离子浓度：1 mmol/L；电子受体：SA、PQQ、PMS、ABTS、NAD⁺、NADP⁺、FAD、DCPIP；过滤：0.22 μm
2.5 LC–MS定性分析方法
定性分析采用LC–MS，对标准条件（40 μg/mL AFB1，37°C，24 h）下制备的AFB1对照和BsaMCO处理组反应混合物进行分析。样品淬灭和澄清步骤同2.3和2.4节。澄清上清液于4°C避光短期保存，使用Thermo Scientific Q Exactive高分辨LC–MS系统分析。色谱分离采用InertSustain C18柱（2.1 × 50 mm，1.9 μm；Shimadzu），流速0.2 mL/min。流动相A为含0.1%甲酸的水，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈。梯度程序为……
【数据】AFB1浓度：40 μg/mL；孵育：37°C，24 h；流速：0.2 mL/min；色谱柱：InertSustain C18 (2.1 × 50 mm, 1.9 μm)；流动相：0.1%甲酸水/0.1%甲酸乙腈
研究结果
3.1 BsaMCO基因的克隆与原核验证
BsaMCO编码序列成功扩增，获得预期大小的PCR产物。凝胶电泳显示扩增片段大小符合预期，阴性对照无对应条带（图1A）。菌落PCR和酶切分析证实重组质粒构建成功（图1B、C）。上述分析共同确认BsaMCO编码序列在表达载体中插入方向和位置正确，为后续重组表达和纯化奠定了基础。
【数据】PCR产物：预期大小；阴性对照：无条带
3.2 酶筛选、表达与纯化
为从芽孢杆菌属中筛选潜在的AFB1降解酶，首先测试了数株实验室分离的芽孢杆菌菌株转化AFB1的能力。其中 Bacillus safensis 活性最高，其胞内组分（细胞裂解上清液）在37°C、200 rpm孵育24小时后可降解约48%的2.5 μg/mL AFB1。该结果表明 Bacillus safensis 具有内在的AFB1转化能力，值得进一步鉴定其关键酶。
BsaMCO候选酶通过将 Bacillus safensis 全基因组预测氨基酸序列与已报道的AFB1降解酶CotA氨基酸序列比对而确定。多铜氧化酶家族蛋白被锁定为最有希望的候选酶，与CotA具有61%的一致性、广泛的比对覆盖率和期望值0.0（图2A）。分子对接进一步提示AFB1可容纳于BsaMCO的预测结合口袋中，结合能为−7.8 kcal/mol，关键互作残基包括Arg251和Leu182（图2B）。
重组BsaMCO随后在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并按2.2节方法纯化。SDS–PAGE分析显示约30 kDa处有明显条带，目标蛋白主要富集于100 mM咪唑洗脱组分中（图2C）。纯化酶用于后续体外AFB1降解实验及结构和机制分析。
【数据】Bacillus safensis胞内组分降解率：约48%（2.5 μg/mL AFB1，37°C，200 rpm，24 h）；序列一致性：61%；结合能：−7.8 kcal/mol；蛋白条带：约30 kDa；主要洗脱组分：100 mM咪唑
3.3 不同条件对BsaMCO降解AFB1的影响
系统评估了反应时间、底物负荷、温度、pH、金属离子、电子受体和溶剂兼容性对BsaMCO介导AFB1降解的影响（图3）。AFB1降解随时间增加，24小时达到约78%的平台期，表明该孵育时间足以实现接近最大活性（图3A）。底物负荷分析显示在2.5–20 μg/mL AFB1范围内均具有稳健活性，但高浓度下端效率下降，提示酶活性位点部分饱和（图3B）。
温度和pH对BsaMCO活性影响显著。酶在45–60°C和微碱性条件（pH 8–9）下活性最高，而极端温度（<25°C或>80°C）和强酸强碱条件显著削弱降解能力（图3C、D）。尽管BsaMCO在45–60°C下活性最高，所有后续实验仍在37°C下进行，以保持生理相关性并确保与HepG2细胞评估兼容。二价铁（Fe²⁺）增强AFB1降解，其他测试离子影响中等或可忽略（图3E）。SA、PQQ和PMS等电子受体提高活性，而FAD和DCPIP影响甚微（图3F）。常见溶剂基本兼容，乙酸乙酯和DMSO影响最小，正己烷中等程度降低降解率（图3G）。
综上，这些结果界定了BsaMCO的稳健操作窗口，突显其宽泛的温度和pH耐受性、高底物特异性以及对辅因子和金属离子的敏感性。这些发现为在体外和饲料应用中最大化AFB1降解提供了实用指导。
【数据】最大降解率：约78%（24 h）；最适温度：45–60°C；最适pH：8–9；底物范围：2.5–20 μg/mL；Fe²⁺：增强降解；SA/PQQ/PMS：提高活性；FAD/DCPIP：影响小；正己烷：中等抑制
3.4 LC–MS产物鉴定
采用正离子ESI模式全扫描LC–MS分析BsaMCO对AFB1的酶促降解产物。含2.5 µg/mL AFB1的BsaMCO处理反应混合物在37°C孵育24小时后淬灭并澄清。LC–MS谱图检测到m/z 347.1714的主要离子峰，以及包括m/z 299.055信号在内的数个次要特征峰（图4）。基于前体离子信号、保留行为和预期元素组成，这些特征峰被初步归属为AFB1转化产物（表1）。由于本研究未进行MS/MS碎裂分析，也未使用真实参考标准品，这些归属应视为暂定而非结构确证。特别是m/z 347.1714处的主要特征峰应解读为推定的AFG2a类或G2a型产物，而非明确鉴定的黄曲霉毒素G2a。
【数据】主要产物峰：m/z 347.1714；次要峰：m/z 299.055；孵育：37°C，24 h；AFB1浓度：2.5 µg/mL
3.5 BsaMCO–AFB1复合物的结构与动态表征
#### 3.5.1 AlphaFold3预测结构与理化特征
采用AlphaFold3预测BsaMCO三维结构，获得适合下游底物分析的高置信度模型。模型评估指标显示优异可靠性：预测模板建模评分（pTM）为0.96，界面pTM（ipTM）为0.77，fraction_disordered为0.0，排名评分为0.81。该酶由三个类cupredoxin结构域组成，具有高度保守的铜结合位点，包括催化所必需的T1单核中心和T2/T3三核簇。
BsaMCO–AFB1复合物的初步分析揭示了T1铜位点附近一个清晰定义的底物结合口袋，以疏水环境为主并巧妙分布极性残基，提示AFB1可被有利地容纳。整体表面拓扑、静电势和溶剂可及体积表明该结合腔在空间和化学性质上与底物兼容。这些特征为后续详细动力学模拟前的底物识别、取向和定位提供了见解（图5）。
【数据】pTM：0.96；ipTM：0.77；fraction_disordered：0.0；ranking score：0.81
#### 3.5.2 BsaMCO–AFB1复合物的分子动力学评估
为评估BsaMCO–AFB1复合物的动态行为和局部稳定性，进行了100 ns全原子分子动力学模拟。复合物整体构象与初始对接结构基本一致，而结合口袋发生细微重排以适应底物，符合诱导契合机制。疏水腔略微加深，AFB1在口袋内调整位置，形成更有利的相互作用网络。分子接触的详细检查揭示了Gly323与AFB1之间持续存在的氢键，将配体锚定在口袋内并稳定其取向以利于潜在催化氧化。这些观察突出了BsaMCO能够迅速采用热力学稳定的构象并将底物牢固固定，为其酶活性提供了结构基础（图6）。
【数据】模拟时长：100 ns；关键残基：Gly323；氢键：持续存在
#### 3.5.3 分子动力学模拟与热力学平衡
通过100 ns全原子MD模拟评估了BsaMCO–AFB1复合物的动态行为和热力学稳定性。初始40 ns期间，系统经历构象松弛、侧链重排和溶剂重组，符合结合口袋调整以适应AFB1的诱导契合机制。此后系统达到平衡，蛋白骨架（Cα、C、N原子）RMSD稳定在0.202 ± 0.009 nm，分离蛋白RMSD平均为0.153 ± 0.008 nm，配体RMSD为0.036 ± 0.008 nm（图7A），表明……
【数据】模拟时长：100 ns；平衡期：40 ns后；蛋白骨架RMSD：0.202 ± 0.009 nm；分离蛋白RMSD：0.153 ± 0.008 nm；配体RMSD：0.036 ± 0.008 nm
讨论与解读
近年来，利用微生物或其特异性酶降解真菌毒素已成为最具前景的工业脱毒策略之一，因其反应条件温和、底物特异性高，且能将毒素转化为低毒或无毒衍生物。然而，以往研究多聚焦于全细胞降解表型，这种表型驱动筛选易受细胞壁通透性、酶分泌效率和胞内代谢协调性制约，导致假阴性结果。本研究采用反向酶学策略，从环境适应性菌株 Bacillus safensis Z-1中鉴定并异源表达了一种新型多铜氧化酶BsaMCO。尽管野生型菌株的全细胞降解活性有限，其胞内粗酶提取物和纯化重组酶却表现出显著的AFB1降解能力——37°C下24小时内降解率超过78%，且无需任何外源介体。既往研究表明，细菌MCO通常具有宽泛的pH耐受范围和良好的热稳定性，适合饲料制粒等高温加工场景。然而，许多经典细菌漆酶或MCO（如大肠杆菌CueO和某些野生型CotA酶）对AFB1的直接降解效率很低……
编译者解读：本研究采用"反向酶学"策略，从全细胞表型不佳的菌株中通过基因组比对发掘关键酶，这一思路值得合成生物学借鉴——它打破了"先有表型再找基因"的传统路径，而是以已知酶序列为锚点直接从基因组中"钓取"同源酶。BsaMCO在无需外源介体的条件下实现78%降解率，且对温度、pH的宽泛耐受性使其具备饲料加工场景的应用潜力。不过，LC–MS产物鉴定尚停留在推定阶段，缺乏MS/MS和标准品确证；HepG2实验虽证明毒性降低，但体内安全性数据仍属空白。未来若能在产物结构确证、酶工程改造（如提高催化效率）及真实饲料基质验证方面推进，该酶有望成为AFB1脱毒的工具酶。
参考来源
Xiong D, Yang J, Li P, Yang S, Long M. Mechanistic and Structural Analysis of Aflatoxin B1 Degradation by Bacillus safensis Multicopper Oxidase. Foods. PMID: 42073338.
PMID: 42073338