来源：In vitro and in silico study of the endosulfan degradation by Bacillus subtilis sp. strain UAMC.（Biodegradation）| 编译：DNA Lab Space
导读
硫丹是一种持久性有机氯农药，其环境残留与生物富集风险长期备受关注。本研究以分离自阿根廷拉普拉塔地区的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis sp.）菌株UAMC为对象，通过33天降解实验发现该菌株对α-硫丹降解率达97.6%、对β-硫丹为69.45%，且未检出毒性更强的硫丹硫酸酯代谢物。结合全基因组注释与分子对接模拟，研究提出了一条由多种酶协同催化的水解型硫丹降解途径，为农药生物修复提供了新的菌株资源与机制见解。
研究背景
农药在提升农业产量、保障粮食安全方面功不可没，但大量使用也带来严重的环境污染问题。硫丹属于环二烯类杀虫剂，因对咖啡果小蠹、稻绿蝽等害虫防效优异而被广泛使用。商业硫丹是α-和β-两种立体异构体按7:3比例混合而成。进入环境后，硫丹可通过水解、光解和生物降解等途径分解。硫丹及其代谢物具有内分泌干扰毒性，其环境归趋与降解机制一直是研究热点。微生物降解被认为是去除硫丹残留最具潜力的策略之一，而阐明降解途径与关键酶系则是推动实际应用的基础。
研究方法
接种物制备
枯草芽孢杆菌UAMC菌株分离自阿根廷拉普拉塔地区的“Cinturón hortícola platense”（南纬34°51′23.897″，西经58°16′19.198″），此前的研究已有报道。菌株在含200 mL Luria–Bertani培养基的500 mL锥形瓶中培养，加入2 mL甘油保存的菌液。初始添加5 mg/L硫丹，于30°C、150 rpm条件下培养72小时。此后每72小时提高一次硫丹浓度，直至达到20 mg/L。菌株驯化完成后，以10,000 rpm离心10分钟收集菌体，沉淀用20 mL无菌蒸馏水重悬。该洗涤步骤在相同条件下重复三次，以去除细胞表面残留的培养基和硫丹。最终菌悬液作为后续降解实验的接种物。
【数据】培养基：Luria–Bertani；驯化起始浓度：5 mg/L硫丹；驯化终浓度：20 mg/L硫丹；离心：10,000 rpm，10 min；洗涤：无菌蒸馏水重悬，重复3次；温度：30°C；转速：150 rpm；每阶段时间：72 h
降解实验
降解实验设两个重复，使用125 mL锥形瓶，工作体积30 mL，包含27 mL无机盐培养基和3 mL（10% v/v）高密度细菌接种物。无机盐培养基成分（g/L）：Na₂HPO₄ 5.97，CaCl₂·H₂O 0.01，KH₂PO₄ 2.27，(NH₄)₂SO₄ 0.99，FeSO₄·7H₂O 0.025，MgSO₄·7H₂O 0.5。接种物为生长至对数晚期的UAMC成熟培养物，以保证初始代谢活性。硫丹（Sigma-Aldrich，α与β异构体比例7:3，纯度99.9%）终浓度20 mg/L。培养条件为30°C、150 rpm持续振荡约33天。培养瓶以Mininert®阀密封，可定期采集顶空气体样品。实验设置两类阴性对照：生物内源对照——无机盐培养基接种细菌但不添加硫丹及其他外源碳源/能源，用于测定基础细胞呼吸；非生物对照——不接种微生物但添加20 mg/L硫丹，用于评估实验条件下的非生物（化学或物理）降解。
【数据】培养基成分：Na₂HPO₄ 5.97 g/L、CaCl₂·H₂O 0.01 g/L、KH₂PO₄ 2.27 g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.99 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.025 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L；接种量：10% v/v；硫丹浓度：20 mg/L；温度：30°C；转速：150 rpm；时间：约33天；重复数：2
体内分析方法
二氧化碳定量。 CO₂生成量作为UAMC代谢活性的间接指标。每周三次（间隔48至72小时）采集顶空样品100 μL，使用配备热导检测器的气相色谱仪（GOW-MAC Series 550，美国）分析，色谱柱为Altech Concentric CTR1柱，氦气为载气，方法同前所述。
【数据】样品量：100 μL；采样频率：每周3次（间隔48–72 h）；仪器：GOW-MAC Series 550 GC-TCD；色谱柱：Altech Concentric CTR1；载气：氦气
生物量定量。 采用干重法测定生物量。培养瓶内容物经尼龙膜（0.45 mm）过滤，以二氯甲烷洗涤，然后干燥至恒重。
【数据】滤膜孔径：0.45 mm；洗涤溶剂：二氯甲烷；干燥方式：恒重
残留硫丹定量与代谢物鉴定
液液萃取。 过滤后的液相用33 mL二氯甲烷磁力搅拌萃取10分钟。有机相分离、过滤后，加入正己烷，于35°C和50°C下旋转蒸发浓缩至10 mL，步骤同前所述。
【数据】萃取溶剂：二氯甲烷33 mL；搅拌时间：10 min；浓缩温度：35°C和50°C；浓缩终体积：10 mL
残留硫丹定量与代谢物鉴定。 浓缩萃取液采用EPA 8270D方法，通过气相色谱-质谱联用仪（Agilent 6890 N，MSD 5975B，美国）分析，配备SGE 5 MS毛细管柱。程序升温：初始温度90°C，以5°C/min速率升至250°C。载气为氦气。检测器温度220°C，进样口温度250°C。代谢物检测采用全扫描模式，质荷比（m/z）范围50–450，电离能量70 eV。化合物鉴定通过比对NIST05质谱库完成。
【数据】色谱柱：SGE 5 MS毛细管柱；升温程序：90°C→250°C，5°C/min；检测器温度：220°C；进样口温度：250°C；扫描范围：m/z 50–450；电离能：70 eV；质谱库：NIST05
计算方法
基因组测序。 UAMC基因组此前已完成测序并发表。纯菌株在标准条件下培养，提取基因组DNA并进行质量控制。全基因组测序采用Illumina MiSeq v2系统（Micro run，300 cycles）。原始读段使用KBase生物信息学平台处理与组装。基因组注释鉴定出与异生物质降解、氧化应激和水解酶活性相关的潜在序列。该注释基因组作为本研究所有生物信息学比较和分子对接模拟的参考框架。
【数据】测序平台：Illumina MiSeq v2（Micro run，300 cycles）；组装平台：KBase；注释内容：异生物质降解、氧化应激、水解酶活性相关序列
酶数据集。 候选酶的3D结构从蛋白质数据银行（PDB）获取，列于补充信息表1S。候选酶包括：枯草芽孢杆菌内生孢子外壳蛋白、铜绿假单胞菌芳基硫酸酯酶、海栖热袍菌甲基转移酶、枯草芽孢杆菌水解酶、枯草芽孢杆菌肽聚糖结合蛋白、恶臭假单胞菌异生物质氧化还原酶、肺炎克雷伯菌黄素蛋白单加氧酶、枯草芽孢杆菌CotA漆酶、枯草芽孢杆菌硝基还原酶、枯草芽孢杆菌磷酸酶、枯草芽孢杆菌细胞色素P450和枯草芽孢杆菌过氧合酶，PDB编号分别为1GSK、1HDH、3BQ5、3C7E、3D30、3L65、3RP8、3ZDW、32SN、4ETI、7WYG、8HKD。这些酶主要因其与水解、氧化和脱卤反应的功能相关性而被选入，这些反应可能参与有机氯、有机磷和氨基甲酸酯类农药的降解。部分具有催化混杂性的酶也被纳入，以代表枯草芽孢杆菌更广泛的代谢灵活性——催化混杂性指酶除其进化选择的主要功能外，还能催化次级或“非天然”反应的能力。此外，为确保生物学相关性，所有酶序列通过BLASTp与注释的UAMC基因组比对验证，确保所选结构在遗传和功能上与UAMC的代谢潜力一致。
【数据】酶数量：12种；PDB编号：1GSK、1HDH、3BQ5、3C7E、3D30、3L65、3RP8、3ZDW、32SN、4ETI、7WYG、8HKD；比对工具：BLASTp
酶制备。 获取的酶使用UCSF Chimera 1.18软件进行制备，包括去除水分子、添加氢原子、去除受体结构中的非目标配体。
【数据】软件：UCSF Chimera 1.18；处理步骤：去水、加氢、去配体
分子对接
为提出假定的硫丹降解途径，本研究设计了如图1所示的整体研究框架。分子对接的具体参数与流程详见原文方法部分——包括受体与配体的准备、对接软件与评分函数的选择等。对接分析针对硫丹及其代谢物与候选酶之间的相互作用展开，以评估各酶对硫丹及其中间产物的催化潜力。
【数据】原文未详述对接软件具体版本与评分函数细节
代谢物制备
硫丹及其代谢物（硫丹二醇、硫丹醚、硫丹羟醚、硫丹内酯）的三维结构用于对接分析。配体结构的生成与优化方式遵循标准计算流程，具体参数以原文补充材料为准。
【数据】配体种类：硫丹、硫丹二醇、硫丹醚、硫丹羟醚、硫丹内酯
研究结果
枯草芽孢杆菌UAMC对硫丹的降解与生物量生成
UAMC的降解活性在33天内持续评估，结果如图2A所示。每个处理均设有对应的内源对照（无碳源）和非生物对照（无细菌培养）。降解动力学显示约4天（100小时）的快速适应期，这与菌株对培养基的适应相关。此后CO₂释放呈指数增长，表明菌株对降解产物的活跃代谢与矿化。代谢活性峰值出现在对数中期，约12天（300小时），随后随底物耗尽而趋于平稳。最大CO₂产量达12.15 ± 3.98 mg，持续产率0.576 ± 0.168 mg/天，维持近21天。
其他农药降解菌体系中也观察到类似动力学特征，如草甘膦、莠去津和毒死蜱的降解菌，支持UAMC表达可诱导代谢途径同化硫丹的假说。内源对照中检测到少量CO₂，生物量几乎恒定，表明UAMC在碳限制条件下通过进入代谢维持的静止状态保持基础代谢活性。这种调节代谢速率、在贫营养环境中存活的能力是芽孢杆菌属的已知特征。
α-硫丹和β-硫丹的降解曲线（图2B）显示，培养前10天生物降解逐渐增加。实验初始硫丹总浓度为20 mg/L，其中α-硫丹14 mg/L、β-硫丹6 mg/L。时间分析显示，第1天总降解率达3% ± 0.01，第10天升至39.40% ± 0.56，表明UAMC对异生物质的逐步适应。随培养继续，异构体间差异愈发明显：α-硫丹降解率达97.60% ± 1.15，β-硫丹为69.45% ± 5.75。这凸显了分子稳定性和空间可及性等理化因素对微生物敏感性的潜在影响。计算得α-硫丹降解速率为0.16 mg/L/天，β-硫丹为0.135 mg/L/天，高于此前报道的真菌和细菌菌株。例如，淡紫紫孢霉和鞘氨醇杆菌对α-硫丹的降解速率分别仅为0.06 mg/L/天和0.089 mg/L/天，且培养时间长达40天。与芽孢杆菌属其他菌株相比，Bacillus sp. PRB77在土壤中的降解速率仅0.042 mg/kg/天，且依赖外加葡萄糖作为碳源。相比之下，UAMC表现出更高的代谢独立性。部分革兰氏阴性菌如铜绿假单胞菌的降解速率可达26.4 mg/L/天或8.85 mg/L/天，但这些研究使用100 mg/L的初始硫丹浓度，远高于本研究的20 mg/L——底物浓度越高，每日质量去除量往往越大。α-与β-硫丹降解效率的差异提示微生物酶系统存在立体选择性行为。非生物对照回收率72.67% ± 17.76，即27.3%的农药损失可能归因于挥发、光解或吸附等非生物过程，这些损失已在净生物降解计算中扣除。实验条件下净生物量浓度为30.833 ± 0.001 mg/L，表明UAMC将硫丹矿化并将其碳同化为细胞组分。
【数据】适应期：约4天（100 h）；代谢峰值：约12天（300 h）；最大CO₂产量：12.15 ± 3.98 mg；CO₂产率：0.576 ± 0.168 mg/天；初始浓度：总硫丹20 mg/L（α-14 mg/L，β-6 mg/L）；第1天降解率：3% ± 0.01；第10天降解率：39.40% ± 0.56；α-硫丹降解率：97.60% ± 1.15；β-硫丹降解率：69.45% ± 5.75；α-硫丹速率：0.16 mg/L/天；β-硫丹速率：0.135 mg/L/天；非生物对照回收率：72.67% ± 17.76；净生物量：30.833 ± 0.001 mg/L
代谢物鉴定
降解实验中鉴定出的转化产物汇总于表1。气相色谱-质谱联用分析揭示五种代谢物，保留时间（RT）范围10.37至27.35分钟。各代谢物的质谱图见补充材料图1S至5S。鉴定的化合物包括：保留时间10.37分钟的薁类化合物（2,2,3,4,5,6,7-八氢-1,4-二甲基-7，C₁₅H₂₄，CAS号22567-17-5，匹配度90%）；保留时间19.84分钟的1,2-苯二甲酸双（2-甲基丙基）酯等。GC–MS分析确认了硫丹醚、硫丹二醇和硫丹内酯等代谢物的生成，但未检出毒性更强的硫丹硫酸酯，提示降解途径以水解为主导机制。
【数据】代谢物数量：5种；保留时间范围：10.37–27.35 min；检出代谢物：硫丹醚、硫丹二醇、硫丹内酯等；未检出：硫丹硫酸酯
分子对接分析
分子对接模拟揭示了硫丹及其代谢物与候选酶之间的相互作用模式。图3展示了四种代表性对接结果：A为硫丹结合于酶3C7E活性位点；B为硫丹二醇在酶3ZDW催化口袋中的相互作用；C为硫丹醚与酶7WYG活性位点的结合；D为硫丹羟醚在酶1GSK活性位点的相互作用。以BIOVIA Discovery Studio可视化特定残基和键合类型，酶结合位点以白色实心表面表示。对接结果与降解实验相互印证——水解酶（如3C7E）、细胞色素P450氧化还原酶（如7WYG）和CotA漆酶（如3ZDW）等酶具备识别和转化硫丹所需的结构可塑性，尽管这些酶并非为降解硫丹而进化而来。
【数据】对接酶：3C7E（水解酶）、3ZDW（CotA漆酶）、7WYG（细胞色素P450）、1GSK（内生孢子外壳蛋白）；可视化软件：BIOVIA Discovery Studio
假定的硫丹降解途径
综合体外降解实验、代谢物鉴定与分子对接结果，本研究提出了枯草芽孢杆菌UAMC降解硫丹的假定途径（图4）。该途径涉及多种酶的协同作用，通过水解、氧化等反应步骤，将硫丹逐步转化为硫丹二醇、硫丹醚、硫丹羟醚和硫丹内酯等中间产物，最终实现矿化。与产生硫丹硫酸酯的氧化途径不同，该水解主导的路径避免了高毒代谢物的积累。
【数据】途径类型：水解主导；关键中间产物：硫丹二醇、硫丹醚、硫丹羟醚、硫丹内酯；最终产物：CO₂与生物量
讨论与解读
本研究证实了枯草芽孢杆菌UAMC对硫丹的有效矿化能力。GC–MS分析确认生成了硫丹醚、硫丹二醇和硫丹内酯等代谢物，且未出现毒性更高的硫丹硫酸酯，提示水解机制主导降解过程。基因组比对与分子对接模拟表明，该降解过程并非由单一酶驱动，而是多种酶协同作用——3C7E、3ZDW、7WYG和1GSK等酶利用其催化混杂性和结构可塑性，依次转化硫丹中间产物。实验验证与机制解析的相互印证，凸显了UAMC在生物修复中的应用潜力。需要注意的是，所提出的降解途径仍属预测模型，通过异源表达和酶学测定确认酶功能、以及开展转录组分析，是未来研究的重要方向。
编译者解读： 该研究的亮点在于将降解实验与计算模拟有机结合——用GC–MS锁定代谢产物、以分子对接筛选关键酶，避免了单纯报告降解率的“黑箱”式研究。未检出硫丹硫酸酯这一发现具有实际价值，意味着该菌株可能规避高毒中间产物的积累。降解速率虽不及部分假单胞菌，但UAMC无需外加碳源即可工作，降低了实际修复成本。局限在于降解周期较长（33天），且降解途径仍属预测性质，后续需通过酶学实验加以验证。
参考来源
Casanova A, Hernández S, Esquivel-Hernández DA, Revah S, Ortíz I. In vitro and in silico study of the endosulfan degradation by Bacillus subtilis sp. strain UAMC. Biodegradation. PMID: 42151472. DOI: 10.1007/s10532-026-10312-y.
PMID: 42151472