来源：Genome Mining of Deep-Sea Cold Seep-Derived Fungus Reveals a Laccase-Fasciclin System Modulating Regioselective Naphthopyranone Dimerization.（Int J Mol Sci）| 编译：DNA Lab Space
导读
深海冷泉作为极端海洋生境，孕育了代谢通路独特的微生物资源。本研究从深海冷泉来源的爪哇青霉OUCF108中挖掘到两个高度同源的萘并吡喃酮生物合成基因簇pig1和pig2，通过比较转录组学与靶向基因敲除证实pig2为功能性基因簇，并在米曲霉中完整重构了其生物合成途径。研究还发现一个全新的漆酶-Fasciclin蛋白系统能够调控萘并吡喃酮二聚体的区域选择性，并鉴定到对多重耐药病原菌白色念珠菌具有中等抗真菌活性的新化合物。
研究背景
深海冷泉以高压、低温、永久黑暗和低氧为特征，严苛环境驱动微生物演化出独特的代谢途径，常产生结构新颖、活性显著的次级代谢产物。基因组测序揭示真菌含有大量生物合成基因簇，但多数为功能未知的孤儿基因簇。萘并吡喃酮是一类结构多样的真菌聚酮化合物，具有抗菌、细胞毒和抗癌等多种药理活性，主要分布于曲霉属、镰刀菌属、青霉属等丝状真菌中。尽管陆生来源萘并吡喃酮的生物合成已有较多研究，海洋真菌中负责其产生的生物合成机制此前未见报道。本研究以深海冷泉沉积物来源的爪哇青霉OUCF108为对象，系统挖掘其基因组中的萘并吡喃酮生物合成基因簇，并解析了完整生物合成途径。
研究方法
4.1 通用实验流程
一维和二维NMR谱图在Bruker Avance III 400、500和600 MHz波谱仪上采集，化学位移以δ（ppm）表示，参照残留溶剂峰（DMSO-d6中δH 2.50和δC 39.52）。高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）数据在Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL质谱仪上记录。HPLC分析在配备二极管阵列检测器（DAD）的Agilent 1260 Infinity II系统上进行，使用YMC Triart C18色谱柱（5 μm，4.6 × 250 mm）。柱色谱使用硅胶和ODS（40 μm，120 Å）。
【数据】NMR波谱仪：Bruker Avance III 400/500/600 MHz；质谱仪：Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL；HPLC系统：Agilent 1260 Infinity II；色谱柱：YMC Triart C18（5 μm，4.6 × 250 mm）
4.2 生物信息学分析
序列相似性网络（SSN）分析使用EFI-EST网络服务器完成，SSN可视化使用Cytoscape v3.10.4软件。真菌生物合成基因簇预测使用antiSMASH真菌版v7.0。
【数据】SSN分析工具：EFI-EST；可视化软件：Cytoscape v3.10.4；BGC预测工具：antiSMASH fungal v7.0
4.3 菌株、培养基与培养条件
深海来源真菌爪哇青霉OUCF108保存于−80°C甘油管中。米曲霉NSAR1由东京大学Ikuro Abe教授惠赠，作为异源表达宿主。大肠杆菌DH5α用于常规质粒构建，大肠杆菌BL21(DE3)用于重组蛋白表达。大肠杆菌在LB培养基中37°C培养；真菌菌株通常在30°C培养。爪哇青霉OUCF108在FLM3培养基中发酵生产代谢产物；米曲霉菌株在DPY培养基中培养用于转化。抗生素使用浓度：大肠杆菌用氨苄青霉素（100 μg mL⁻¹）或卡那霉素（50 μg mL⁻¹）；爪哇青霉用G418（400 μg mL⁻¹）和博来霉素（100 μg mL⁻¹）；米曲霉用吡啶硫胺素（0.25 μg mL⁻¹）。
【数据】培养温度：大肠杆菌37°C、真菌30°C；氨苄青霉素100 μg mL⁻¹；卡那霉素50 μg mL⁻¹；G418 400 μg mL⁻¹；博来霉素100 μg mL⁻¹；吡啶硫胺素0.25 μg mL⁻¹
4.4 爪哇青霉OUCF108的遗传转化
原生质体制备和PEG介导的爪哇青霉OUCF108转化参照修改后的方案进行。孢子接种于50 mL PDB培养基中，30°C、220 rpm培养14–16小时。收集的菌丝体用FastPrep-24 5G仪器机械破碎（6500 rpm，30秒），在新鲜PDB中再生（30°C、220 rpm、3小时），然后用含1%蜗牛酶、1%溶壁酶和1%纤维素酶（来自黑曲霉）的1.2 M MgSO₄溶液在30°C、130 rpm酶解2.5小时。原生质体通过过滤和 trapping buffer 离心纯化。基因敲除时，从基因组DNA扩增ku70或pigA2两侧约1.2 kb的同源臂，通过融合PCR连接到博来霉素（ble）或G418（neo）抗性 cassette 上。构建体转化原生质体后，在含相应抗生素的再生培养基上筛选转化子，并通过诊断PCR验证。
【数据】PDB培养：30°C、220 rpm、14–16 h；机械破碎：6500 rpm、30 s；再生：30°C、220 rpm、3 h；酶解：1%蜗牛酶+1%溶壁酶+1%纤维素酶、1.2 M MgSO₄、30°C、130 rpm、2.5 h；同源臂长度：约1.2 kb
4.5 真菌表达质粒构建
pig2基因簇的基因（pigA2、pigH2、pigN2、pigF2、pigG2、pigI2、pigC2和pigM2）从爪哇青霉OUCF108基因组DNA扩增，引物列于表S4。每个片段用Seamless Assembly Cloning Kit克隆到线性化的pTAex3或pUSA载体中。多基因表达质粒通过将amyB启动子（PamyB）–目标基因–amyB终止子（TamyB）表达 cassette 依次连接到pUSA、pAdeA或pPTRI目的载体的限制性位点构建。所有构建体经DNA测序验证。
【数据】克隆试剂盒：Seamless Assembly Cloning Kit；载体：pTAex3、pUSA、pAdeA、pPTRI；启动子：amyB
4.6 米曲霉NSAR1中的异源表达
米曲霉NSAR1的转化采用原生质体-PEG法。菌丝体在含1%蜗牛酶、1%溶壁酶、1%纤维素酶和7.9%（NH₄）₂SO₄的0.58%马来酸溶液中酶解。转化子在缺乏特定营养素（精氨酸、甲硫氨酸或腺嘌呤）或含吡啶硫胺素（0.25 μg mL⁻¹）的极限培养基上筛选，取决于选择标记。
【数据】酶解液：1%蜗牛酶+1%溶壁酶+1%纤维素酶+7.9%（NH₄）₂SO₄+0.58%马来酸；筛选：营养缺陷或吡啶硫胺素0.25 μg mL⁻¹
4.7 化合物的分析、分离与纯化
代谢物分析时，米曲霉转化子在DPY固体培养基上30°C培养3天；爪哇青霉菌株在FLM3液体培养基中30°C培养7天。培养物用乙酸乙酯萃取，浓缩后用甲醇溶解，HPLC分析采用线性梯度5%至100% B/A、35分钟（A：H₂O + 0.05% TFA；B：MeCN + 0.05% TFA；流速：1.0 mL min⁻¹）。
化合物分离时进行大规模发酵（米曲霉1 L DPY；爪哇青霉5 L FLM3）。粗提物经硅胶和ODS柱色谱分级，随后用半制备HPLC（YMC-Pack ODS-A；流速：2.0 mL min⁻¹）纯化得到化合物1–5。
【数据】米曲霉培养：DPY固体、30°C、3天；爪哇青霉培养：FLM3液体、30°C、7天；HPLC梯度：5%→100% B/A、35 min、1.0 mL min⁻¹；大规模发酵：米曲霉1 L DPY、爪哇青霉5 L FLM3；半制备HPLC流速：2.0 mL min⁻¹
4.8 ECD测量与计算细节
化合物4的实验ECD光谱在JASCO J-1500圆二色光谱仪上于甲醇中记录。计算分析时，对化合物4的(4S)和(4R)异构体用Crest v2.12在GFNFF理论水平进行构象搜索，随后在GFN2-xTB水平预优化，用4 kcal/mol能量窗口去除高能构象。每个选定构象的几何优化和频率计算使用ORCA v5.0.3在B3LYP/6-31G(d,p)理论水平进行，采用CPCM极化导体计算模型（甲醇溶剂）。优化构象的理论ECD光谱用含时密度泛函理论（TDDFT）方法在B3LYP/6-31G(d,p)水平计算。最终计算ECD光谱用Multiwfn v3.8软件生成并绘图，应用洛伦兹带形，半带宽（sigma）为1 eV。计算光谱经缩放后与实验数据直接比较。
【数据】ECD光谱仪：JASCO J-1500；溶剂：MeOH；构象搜索：Crest v2.12/GFNFF；预优化：GFN2-xTB；能量窗口：4 kcal/mol；DFT计算：ORCA v5.0.3、B3LYP/6-31G(d,p)、CPCM(MeOH)；ECD计算：TDDFT/B3LYP/6-31G(d,p)；绘图：Multiwfn v3.8、半带宽1 eV
4.9 蛋白表达与体外酶活测定
重组表达PigN2时，将pET28a-PigN2质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)。培养物在含卡那霉素（50 μg mL⁻¹）的LB培养基中37°C培养至OD600 = 0.6，加入0.1 mM IPTG诱导，16°C过夜培养。His₆标签的PigN2用Ni-NTA亲和层析纯化。体外甲基转移酶测定中，反应体系（100 μL）含100 mM Tris-HCl（pH 8.0）、200 μM SAM、100 μM nor-toralactone（2）和10 μM纯化的PigN2，30°C孵育4小时后加甲醇终止反应并HPLC分析。
漆酶PigF2和fasciclin样蛋白PigG2的表征采用无细胞裂解液系统。相关米曲霉转化子的菌丝体在液氮中冷冻、研磨成粉末，重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），离心（12,000× g，20分钟，4°C）。向上清液中加入(R)-semivioxanthin（1，0.1 mM），30°C孵育4小时。产物用乙酸乙酯萃取，HPLC-MS分析。
【数据】PigN2表达：LB+卡那霉素50 μg mL⁻¹、37°C至OD600=0.6、0.1 mM IPTG诱导、16°C过夜；甲基转移酶反应：100 mM Tris-HCl pH 8.0、200 μM SAM、100 μM底物2、10 μM PigN2、30°C、4 h；漆酶反应：50 mM Tris-HCl pH 8.0、0.1 mM底物1、30°C、4 h、离心12,000× g 20 min 4°C
4.10 抗菌活性测定
（原文此节内容未完整提供）
研究结果
2.1 基因组挖掘揭示爪哇青霉OUCF108中两个同源的萘并吡喃酮PKS基因簇
真菌菌株OUCF108分离自深海冷泉沉积物，基于ITS序列鉴定为爪哇青霉（与模式菌株同源性99.86%）。全基因组测序后经antiSMASH生物信息学分析检测到59个推定BGC，其中32个被归类为聚酮合酶（PKS）基因簇，凸显了该深海分离株非凡的生物合成能力。其中，两个高度同源的PKS位点引起了研究者的注意：pig1（Cluster 2.2，48.3 kb）和pig2（Cluster 39.1，49.1 kb，图1A）。为评估这两个基因簇与已知萘并吡喃酮BGC的进化关系，研究者构建了包含pig1、pig2以及公共数据库中已知萘并吡喃酮BGC（包括vioxanthin和aurofulusarin途径）翻译开放阅读框（ORF）的全局序列相似性网络（SSN）（图1B）。
SSN分析揭示了一个保守的核心生物合成逻辑与辅助功能分化并存的模式。核心NR-PKS酶PigA1（来自pig1）和PigA2（来自pig2）共享67%的氨基酸序列同一性，与数据库中已确立的萘并吡喃酮合成PKS紧密聚类，证实了其作为萘并吡喃酮骨架生成酶的功能。同样，两个基因簇中的若干关键修饰酶，包括推定的O-甲基转移酶（PigH1和PigN2）、多铜氧化酶/漆酶（PigO1和PigF2）和黄素依赖性单加氧酶（PigL1和PigI2），也与已知BGC中的对应酶表现出高度同源性。核心生物合成机制高度保守的同时，SSN分析通过揭示此前表征的萘并吡喃酮BGC中不常见的独特辅助基因，凸显了这些深海来源基因簇的序列水平差异。具体而言，编码糖基转移酶（PigB1）、咪唑甘油磷酸脱水酶（PigD1）、单加氧酶（PigG1）和糖苷水解酶（PigC2）的孤立节点提示萘并吡喃酮生物合成中可能存在尚未探索的修饰步骤，如潜在的糖基化。此外，pig2的特征在于存在一个含fasciclin结构域的蛋白（PigG2）和一个短链脱氢酶（PigH2）。这些结构差异表明pig2可能拥有更多样化的催化功能，特别是在氧化二聚化方面。
【数据】BGC数量：59个推定BGC，32个PKS基因簇；pig1大小：48.3 kb；pig2大小：49.1 kb；PigA1/PigA2氨基酸序列同一性：67%；ITS同源性：99.86%
2.2 比较转录组学和靶向基因敲除确定pig2为萘并吡喃酮生物合成的必需基因簇
单个基因组中同时存在两个同源的萘并吡喃酮BGC，引出了两个基因簇是否都对代谢产物生产有所贡献的问题。为解答这一问题，研究者在支持萘并吡喃酮生物合成的标准发酵条件下进行了比较转录组学分析。RNA-seq数据显示，pig2的核心基因，包括pigA2（NR-PKS）、pigN2（O-甲基转移酶）和pigF2（漆酶），在所有测试条件下均高表达（FPKM > 600），而pig1中相应的直系同源基因（pigA1、pigH1、pigO1）表达水平极低（FPKM < 10）（图2A）。这些数据表明pig1在所检测条件下转录沉默，而pig2被活跃转录。
为建立pig2与萘并吡喃酮产生之间的直接因果联系，研究者为爪哇青霉OUCF108开发了一套遗传操作系统。首先构建了NHEJ缺陷菌株（Δku70）以提高同源重组效率。随后，在Δku70背景下通过同源替换敲除了核心PKS基因pigA2。ΔpigA2突变体培养物提取物的HPLC分析显示(R)-semivioxanthin（1）的产生完全消失，而野生型菌株以1为主要代谢产物积累（图2B）。ΔpigA2突变体中未观察到萘并吡喃酮的补偿性产生，证实即使途径失活，pig1也无法替代pig2的功能。这些结果证实在所测试条件下，pig2是负责萘并吡喃酮生物合成的必需BGC，pig1无法补偿pigA2的缺失。
【数据】pig2核心基因表达：FPKM > 600；pig1直系同源基因表达：FPKM < 10；ΔpigA2突变体：化合物1产生完全消失
2.3 pig1和pig2 BGC在米曲霉NSAR1中的异源表达
为进一步验证两个基因簇的功能状态并实现逐步途径解析，研究者在成熟真菌宿主米曲霉NSAR1中对pig1和pig2进行了异源表达。
首先将pig2核心PKS基因pigA2单独导入米曲霉NSAR1。HPLC分析转化子培养物提取物发现一个空载体对照中不存在的新代谢物峰2（图3B）。这一结果证实PigA2是一个庚酮合酶，催化一个乙酰-CoA起始单位与六个丙二酰-CoA延伸单位的迭代缩合，随后进行区域选择性环化和芳构化，生成萘并吡喃酮骨架。为鉴定下游修饰步骤，研究者随后将pigA2与短链脱氢酶基因pigH2和O-甲基转移酶基因pigN2共表达。所得转化子（AO-pigA2H2N2）产生了一个新的主峰（1），经HR-ESI-MS与标准品比较鉴定为(R)-semivioxanthin（图3B）。该结果表明PigH2和PigN2共同足以将2转化为(R)-semivioxanthin（1），确立了它们在semivioxanthin生物合成途径中的作用。为阐明PigH2和PigN2各自的贡献，研究者进行了独立的共表达实验。pigA2与pigH2单独共表达时（AO-pigA2H2），除2外还观察到两个新的代谢物峰3和4（图3B）。pigA2与pigN2单独共表达时（AO-pigA2N2），检测到一个新峰5（图3B）。这些结果表明PigH2和PigN2在骨架2上催化不同的修饰，两种酶的共同作用将中间体导向(R)-semivioxanthin（1）。
生物信息学分析揭示该基因簇编码一个漆酶（PigF2）和一个含fasciclin结构域的蛋白（PigG2），两者都可能参与二聚化过程。此前的报道已证明漆酶通常需要含fasciclin结构域的伴侣蛋白来高效催化氧化二聚化反应。为解析PigF2和PigG2各自的催化功能和协同机制，研究者首先将漆酶基因pigF2导入AO-pigA2H2N2背景中，检验PigF2单独是否足以催化二聚化。转化子AO-pigA2H2N2F2积累的新峰经HR-ESI-MS测定分子量与萘并吡喃酮同源二聚体一致（图3B）。这些数据表明PigF2催化(R)-semivioxanthin（1）的氧化二聚化。随后，为探索PigG2的调控作用，研究者将pigF2和pigG2共导入。所得转化子AO-pigA2H2N2F2G2产生了一组与AO-pigA2H2N2F2不同的二聚体峰（图3B），表明PigG2改变了漆酶介导偶联反应的区域选择性。值得注意的是，在AO-pigA2H2N2F2G2提取物中，除替代的区域异构二聚体7和8（MW = 546）外，还检测到两个额外的次要峰9和10。LC-MS分析显示9和10的分子量为548，提示它们是二聚体物种的加氢产物。导入其余推定编码糖苷水解酶PigC2、黄素依赖性单加氧酶PigI2和丝氨酸水解酶PigM2的基因后，未产生任何新产物。
为独立评估pig1的功能，研究者还进行了pig1的异源表达实验（原文此部分内容未完整提供）。
【数据】AO-pigA2：产生新峰2；AO-pigA2H2N2：产生主峰1（(R)-semivioxanthin）；AO-pigA2H2：产生峰3和4；AO-pigA2N2：产生峰5；AO-pigA2H2N2F2：产生同源二聚体峰；AO-pigA2H2N2F2G2：产生替代区域异构二聚体7和8（MW=546）及次要峰9和10（MW=548）
2.4 化合物的结构鉴定
（原文此部分内容未完整提供，但图4展示了化合物1–5的结构及化合物4的关键2D NMR相关）
2.5 PigN2与PigF2/G2的体外生化表征
（原文此部分内容未完整提供）
2.6 提出的生物合成途径
（原文此部分内容未完整提供）
讨论与解读
爪哇青霉OUCF108基因组中两个高度同源的萘并吡喃酮BGC共存，为研究重复生物合成位点的进化动态提供了难得的机会。通过整合比较转录组学、靶向基因敲除和异源途径重构，研究者证实pig2是负责(R)-semivioxanthin（1）及其二聚体衍生物生物合成的主要活性基因簇，而pig1表达水平极低且在胞内功能惰性。值得注意的是，pig1中的核心NR-PKS PigA1保留了完整的催化能力，能够组装与其pig2对应物PigA2相同的庚酮骨架nor-toralactone（2）。然而，pig1内的下游修饰酶在异源宿主中未能将2转化为任何进一步产物。这些数据表明pig1是一个进化上的假基因簇——突变积累已废除其辅助修饰功能，而核心骨架合成能力仍然完整。这种基因组冗余后不对称功能衰退的模式与重复BGC经历分化选择的模型一致：活性拷贝（pig2）在纯化选择下维持，冗余拷贝（pig1）则向假基因化漂移。这一模式强调了在将生物合成功能归属于旁系同源基因簇时实验验证的重要性。
【编译者解读】该研究展示了深海真菌作为新型天然产物来源的巨大潜力。方法学上，比较转录组学与异源重构的联合策略高效区分了同源基因簇的功能分工，值得借鉴。漆酶-Fasciclin系统对二聚化区域选择性的调控机制尤为有趣——这种蛋白伴侣改变产物区域化学的范式，为合成生物学中精准控制C–C偶联反应提供了新思路。新化合物4对多重耐药白色念珠菌的活性（MIC = 12.5 μg mL⁻¹）虽属中等，但C-4羟基构效关系的揭示为后续结构优化指明了方向。局限在于pig1的完整功能验证和更多二聚体产物的生物活性评价仍有待深入。
参考来源
Li H, Li Z, Sun J, Yang X, Xing K. Genome Mining of Deep-Sea Cold Seep-Derived Fungus Reveals a Laccase-Fasciclin System Modulating Regioselective Naphthopyranone Dimerization. Int J Mol Sci. PMID: 42196141.
PMID: 42196141