来源：Biotechnol Biofuels Bioprod | 编译：DNA Lab Space
导读
全球塑料污染与高含水率食品废物的双重治理困境，促使研究者探索"以废治废"的生物制造路径。本研究以预处理食品废水（FWW）为底物，利用恶臭假单胞菌KT2440通过两阶段迭代策略合成中链聚羟基脂肪酸酯（mcl-PHA）。合成底物测试获最高PHA产率0.70 g PHA/g VSS，实际底物测试在F/M=5时达最优产率0.33 g PHA/g VSS。研究确立了F/M比值与PHA单体组成的关联规律，为废弃物流向生物塑料的规模化转化提供了操作窗口。
研究背景
全球塑料废物危机持续升级，工业加工产生的高含水率食品废物又难以通过传统填埋或焚烧处理。各国因此寻求可持续替代方案与综合减废策略。本研究聚焦双重挑战：以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）为生产菌株，以食品废水（FWW）为底物，通过迭代优化工艺生产中链聚羟基脂肪酸酯（mcl-PHA）——一种可生物降解、性能接近传统塑料的聚酯材料。该策略将废物转化为可降解塑料资源，同时回应食品废物管理与石油基塑料依赖两项议题。
研究方法
底物制备
1. 合成底物配制
采用分析纯乙醇、乙酸和丁酸作为FWW主要组分的代表性模型化合物。上述化学品购自Duksan Pure Chemical Co.（韩国安山）。
2. 预处理可溶性食品废水（P-FWW）制备
FWW取自韩国光州一家污水处理厂。该设施接收混合食品加工废水和食物垃圾回收出水，其进水特征为发酵来源的可溶性产物，而非单一产品特异性废水。采集后，FWW经1 mm筛网过滤去除较大颗粒。过滤后的FWW转入硼硅酸盐玻璃瓶，装填量不超过瓶体积的70%，随后加入NaOH调节pH至7.5。之后于121 °C高压灭菌15 min。在4 °C冷却至少6 h后，生物质经10,000 rpm离心10 min。可溶性部分用0.45 μm膜过滤器真空抽滤分离，确保完全去除油分和微生物污染。所得可溶性底物（P-FWW）储存于4 °C备用。
详细实验设计
以可溶性P-FWW为底物的恶臭假单胞菌PHA生物合成分两阶段迭代优化（图1）。初步阶段，向恶臭假单胞菌供给模拟FWW组成的合成底物。为验证FWW中哪些主要可溶性产物最有效用于PHA生物合成，考察了三种合成底物配比。A/B/E混合物（以COD计：78%乙醇、13%乙酸、9%丁酸）选为与实测P-FWW可溶性组成最接近的配比（表1）。E条件（100%乙醇）单独考察乙醇的作用；A/B条件（60%乙酸/40%丁酸）在不含乙醇条件下提供挥发性脂肪酸（VFAs），用于检验无醇时PHA产量与组成。该测试的食物-微生物比（F/M）在所有变体中统一设定为5 g COD/g VSS·day。
表1 FWW预处理前后的特征
| 参数 | 单位 | 原FWW | P-FWW | 备注 |
|------|------|--------|-------|------|
| pH | - | 3.7 ± 0.3 | 7.5 ± 0.0 | 常规参数 |
| COD | g/L | 161.9 ± 45.8 | 109.8 ± 3.7 | |
| sCOD | | 94.6 ± 9.6 | 107.1 ± 6.0 | |
| 乙醇 | g COD当量/L | 26.5 ± 1.5 | 34.8 ± 0.0 | 主要产物 |
| 乙酸 | | 4.1 ± 0.6 | 5.9 ± 0.5 | |
| 丁酸 | | 0.8 ± 0.1 | 4.2 ± 0.0 | |
| 丙酸 | g COD当量/L | 0.1 ± 0.0 | 0.5 ± 0.0 | 次要产物 |
| 戊酸 | | 0.4 ± 0.2 | 0.8 ± 0.1 | |
最终阶段，以P-FWW为底物，实验围绕不同F/M比展开，以评估FWW用于PHA合成的能力与极限。研究评估了六个F/M比，范围为5至100 g COD/g VSS·day。
所有试验均在好氧批式环境中进行，使用硼硅酸盐玻璃瓶，工作体积100 mL。经配备0.2 μm滤膜的空气泵持续向瓶内通入灭菌空气。每个条件设三次重复，于30 °C、150 rpm振荡培养24 h。
微生物与培养基
恶臭假单胞菌KT2440菌株购自韩国能源研究所（KIER，韩国光州）。挑取单菌落接种于装有Luria–Bertani（LB）培养基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 5 g/L）的锥形瓶中，于30 °C、150 rpm振荡过夜培养。待细胞数量增加后，取1%（v/v）过夜培养物接入1 L LB培养基，在相同条件下继续培养20 h。成熟细胞用作生物塑料合成的接种物。
分析方法
采用配备HP-Innowax毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，安捷伦科技，美国）和火焰离子化检测器的气相色谱仪（ACME 6100，YoungIn Chromass，韩国安养）测定乙醇及挥发性脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸）浓度。柱温箱程序：95 °C保持2 min，以10 °C/min升至140 °C保持2 min，再以40 °C/min升至240 °C保持5 min。进样口温度240 °C，分流比10:1，流速1.0 mL/min，载气为氦气。
可溶性化学需氧量（sCOD）及生物质/挥发性悬浮固体（VSS）浓度按标准方法[16]测定。可溶性指标（含VFAs和sCOD）测定前，样品经Sartorius Minisart® 0.2 μm滤膜（德国哥廷根）过滤。所有测定均设三次重复。
PHA定量与分析
采用改良自前期研究[17]的方法进行生物质分离与PHA分析。为准确估算不同培养条件下恶臭假单胞菌KT2440的PHA含量，用1%（v/v）甲醛终止生物质活性。10,000 rpm离心10 min后弃去上清液，所得生物质沉淀经蒸馏水洗涤后再次离心。洗涤后的沉淀于85 °C烘箱干燥一整天。取15 mg沉淀样品，加入2 mL氯仿和2 mL酸化甲醇（1:1比例，甲醇中含3% v/v H₂SO₄）的混合液，其中含100 mg/L苯甲酸钠作为内标。
四种参考溶液配制如下：50 mg聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸)用于检测scl-PHA（以聚(3-羟基丁酸酯)（PHB）和聚(3-羟基戊酸酯)（PHV）为代表）；20 μL 3-羟基己酸甲酯；5 mg (±)-3-羟基辛酸；6 mg (±)-3-羟基癸酸，用于鉴定mcl-PHA，即聚(3-羟基己酸酯)（PHHx）、聚(3-羟基辛酸酯)（P3HO）和聚(3-羟基癸酸酯)（P3HD）。每种溶液溶于15 mL氯仿。所有标准品购自Millipore Sigma（Sigma-Aldrich）。样品与标准品在密封10 mL玻璃小瓶中于100 °C消化3.5 h，然后冷却至室温。后续步骤包括样品与蒸馏水混合、离心、经0.2 μm滤膜过滤以分离氯仿相[18, 19]。
甲醇解PHA样品分析采用GC–FID，检测器温度300 °C，进样口温度250 °C。载气为氦气，分流进样比1:15。柱温箱起始50 °C保持5 min，然后以20 °C/min升至250 °C，再保持10 min。PHA单体定量依据标准曲线。单体浓度依据上述参考标准品制备的五点外标校准曲线定量（所有单体R² > 0.99）。各峰身份通过与认证标准品的保留时间比对确认[17, 20]。
PHA产率计算为GC–FID定量的胞内PHA总质量（g）与24 h批式试验结束时测得的总生物质挥发性悬浮固体（VSS，g）之比，表示为g PHA/g VSS。VSS按标准方法测定，代表包括PHA颗粒在内的总生物质[17, 21]。
PHA颗粒提取与表征
PHA颗粒提取采用改良自前期研究的方法[22, 23]。生物质经10,000 rpm离心10 min。所得沉淀用磷酸盐缓冲液（PBS）以10,000 rpm离心10 min清洗，去除表面污染物。随后生物质与等体积10%次氯酸钠溶液混合，于37 °C、120 rpm振荡孵育1.5 h。之后生物质用PBS冲洗，与等体积氯仿混合，置于密封容器中消化。
研究结果
合成底物测试中，最高PHA产率达0.70 ± 0.05 g PHA/g VSS，其中聚(3-羟基癸酸酯)占PHA组成的大部分（77.5 ± 2.6%），其次为聚(3-羟基辛酸酯)（15.6 ± 8.8%）。这些测试凸显了乙醇作为mcl-PHA生物合成重要贡献者的潜力。
实际底物测试中，以预处理可溶性FWW（P-FWW）为底物，F/M比为5时获得最优PHA产率0.33 ± 0.02 g PHA/g VSS。较低的F/M水平（5–25）主要产生短链PHA（scl-PHA），以聚(3-羟基丁酸酯)为主要形式；较高的F/M水平（50–100）则有利于mcl-PHA，特别是聚(3-羟基癸酸酯)。
讨论与解读
本研究证实，FWW可作为PHA生产的可持续底物得到有效资源化利用，将工业废物流转化为有价值的生物聚合物资源。通过确立投料策略（F/M比）与PHA组成之间的关键关系，为规模化优化微生物合成提供了实用指南。这些发现同时回应了食品废物管理与减少石油基塑料依赖的双重需求，符合循环经济原则，将FWW生产PHA定位为可持续生物制造的一条可行路径。
【编译者解读】该研究的亮点在于"以真实废物流验证合成底物结论"的两阶段设计——先用模型底物锁定乙醇的关键作用，再在真实P-FWW中通过F/M梯度调控聚合物链长，逻辑闭环完整。F/M比从5升至100时PHA从scl转向mcl的转变，为工业上按需定制生物塑料性能提供了直接操作旋钮。局限在于批式试验规模较小，且实际底物产率（0.33 g/g VSS）较合成底物（0.70 g/g VSS）明显偏低，连续流工艺与底物抑制问题值得后续深挖。
参考来源
Aghasa A, Katakojwala R, Lee E, Juntupally S, Lee HS. Biosynthesis of medium-chain length polyhydroxyalkanoates from pre-treated food wastewater. Biotechnol Biofuels Bioprod. PMID: 42265808. DOI: 10.1186/s13068-026-02780-4.
PMID: 42265808