来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
一锅法CRISPR诊断面临根本性矛盾：等温扩增需要靶标持续积累，而CRISPR激活却不可逆地消耗这些底物。本研究通过引物热力学设计，将反应顺序直接编码进DNA引物中，无需物理分离或外部控制即可实现扩增与CRISPR激活的自主排序。该策略同时通过引物引入PAM序列，突破了对天然靶标序列的依赖，实现了30分钟内阿托摩尔级灵敏度和单核苷酸分辨能力，并在微流控芯片上完成了临床样本验证。
研究背景
全集成分子诊断旨在单一反应环境中完成核酸扩增、分子识别与信号转导。然而，实现这种集成需要多个生化过程在同一反应器内按特定时间顺序进行。当反应顺序依赖物理分离、分阶段操作或人工干预时，系统性能尚可维持；但当竞争性反应无内在排序地同时进行时，系统级不稳定性便会出现，损害灵敏度、可重复性和可预测性。这一问题在CRISPR诊断中尤为突出——Cas12a通过将序列特异性靶标识别与附带核酸酶活性偶联，实现了高灵敏核酸检测，但与等温扩增联用时，扩增需要靶标DNA持续积累，而CRISPR激活通过顺式和反式切割不可逆地消耗这些靶标，形成紧密耦合的竞争网络。以往的解决方案——光笼crRNA、温度开关等——虽能实现时间分离，但缺乏内在机制来优先保证扩增而非CRISPR激活。本研究提出的策略不是通过参数调节或削弱CRISPR活性，而是在竞争性扩增途径之间引入明确的能量层级，使反应排序成为分子热力学的内在结果。
研究方法
伦理声明
甲型流感和SARS-CoV-2临床样本由威尔斯亲王医院提供，并获得香港中文大学临床研究伦理委员会批准（CREC-2021-0188）。本研究中使用的人类基因组拭子样本来自香港科技大学招募的志愿者，研究方案经该校人类与文物研究伦理委员会批准（HREP-2026-0148）。所有参与者在样本采集前均签署知情同意书。参与者个人信息严格保密，所有数据匿名处理。样本以去标识化方式获取，未收集任何人口统计学信息。参与者未获得任何补偿。
材料
Lachnospiraceae细菌Cas12a（LbCas12a）蛋白购自Tolo Biotech（上海）。RNA和DNA寡核苷酸以及合成DNA模板由GENEWIZ（苏州）提供。丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液购自Bio-Rad。SYBR Green核酸凝胶染料和SYTO 82橙色荧光核酸染料购自Thermo Fisher Scientific（香港）。DEPC处理水购自Sangon Biotech（上海）。DNA等温快速扩增试剂盒、RNA等温快速扩增试剂盒和快速核酸释放试剂购自Amp-future（常州）。RNase抑制剂和NEBuffer 2.1购自New England Biolabs。蛋白酶K、磁珠病毒DNA/RNA试剂盒和磁珠通用基因组DNA试剂盒购自天根（北京）。一步法RT-qPCR预混液和Universal Blue qPCR SYBR Green预混液购自YEASEN（上海）。蔗糖和甘露醇购自Macklin（上海）。
RPA和实时RPA反应、凝胶分析及测序
RPA反应在50 µL反应体系中进行，包含29.5 µL无引物再水化缓冲液、1 µL正向引物（10 µM）、1 µL FPP引物（10 µM）、2 µL反向引物（10 µM）、4 µL模板、2.5 µL MgOAc（280 mM）和1 µL无DNase/RNase水。反应在37°C孵育60分钟。
为终止扩增，向完成反应中加入蛋白酶K并在室温孵育30分钟。随后反应在95°C热灭活10分钟。所得产物通过10%变性PAGE进行凝胶可视化分析，或提交Sanger测序（GENEWIZ）。
实时RPA反应按上述方法组装，额外添加1 µM SYTO 82染料，在37°C孵育期间连续记录荧光。
TEMPO系统
一锅法RPA-Cas12a反应以20 µL终体积组装，具体配方见补充表2。简要而言，25 nM LbCas12a和50 nM crRNA预混并在室温孵育5分钟以形成核糖核蛋白复合物。反应混合物包含400 nM报告分子、各125 nM的FP和FPP引物、250 nM BP引物、NEB Buffer 2.1、RPA试剂盒提供的再水化缓冲液以及无核酸酶水。每反应加入4 µL模板。最后加入MgOAc（280 mM）启动扩增，总反应体积为20 µL。所有反应轻柔混匀，在标准一锅法扩增条件下孵育。使用qPCR系统（Bio-Rad）以1分钟间隔监测荧光信号（485 nm激发，535 nm发射）。
样本制备
HIV RNA模拟样本。 将0.5 µL HIV RNA掺入49.5 µL人血清中制备HIV RNA标准品，然后使用TIANamp Virus DNA/RNA Kit（天根，北京）进行核酸提取。纯化RNA用作TEMPO一锅法检测及RT-qPCR基准测试的模板。
甲型流感和SARS-CoV-2临床原始样本在香港威尔斯亲王医院获取并灭活。临床样本使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN，Hilden，德国）进行纯RNA提取预处理。
人类基因组样本。 在香港科技大学招募了二十名志愿者。从每位参与者采集口腔拭子并分成两份。一份使用磁珠通用基因组DNA试剂盒处理获得纯化基因组DNA，用作一锅法TEMPO基因分型的输入，并在靶标RPA扩增后进行Sanger测序。第二份使用商业快速核酸释放试剂（Amp-future，常州）进行快速裂解，直接用于基于微流控芯片的检测。简要而言，将拭子样本浸入含1 mL裂解缓冲液的离心管中彻底涡旋，室温孵育5分钟。短暂离心5秒后，取10 μL上清液作为直接扩增的模板。
HIV RNA模拟样本的RT-qPCR验证
使用Hifair Advanced一步法RT-qPCR SYBR Green Kit（Yeasen）验证HIV RNA模拟样本。每个25 μL反应体系包含12.5 μL 2× Hifair Advanced SYBR Green缓冲液、1 μL正向引物（10 μM）、1 μL反向引物（10 μM）、1 μL Hifair Advanced UH酶混合液、4 μL RNA模板，以及无核酸酶DEPC处理水补足至终体积。RT-qPCR程序为：50°C逆转录6分钟，95°C预变性5分钟，随后进行40个循环的扩增（95°C变性15秒，60°C退火/延伸30秒）。
微流控诊断芯片的设计与制造
微流控诊断芯片使用SolidWorks 2020设计，集成多个反应腔室和流体通路以进行平行SNP检测，腔室体积设计为容纳20–25 μL反应。芯片采用被动Tesla型阀结构以防止反应过程中液体回流造成的污染。芯片采用两层结构：CNC加工的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）层包含微流控通道，非荧光粘性密封膜（Microseal B，Bio-Rad）作为底层。通气口用防水透气膨胀聚四氟乙烯（ePTFE）膜（直径3.5 mm）密封，允许气体交换同时防止液体泄漏和外部污染。最终设计由商业微加工服务商（深圳汇利兴精密制造有限公司，中国）使用CNC微加工从PMMA制造。
芯片上的试剂加载和冻干
可冻干的一锅法RPA-Cas12a反应混合物按补充表3所示配方制备。制备20 μL可冻干一锅法RPA-Cas12a反应混合物，包含在DEPC处理水中重构的RPA试剂、各125 nM正向引物FP和FPP、250 nM反向引物BP、50 nM Cas12a、100 nM crRNA和800 nM ssDNA报告分子，并补充5%（w/w）蔗糖和2%（w/w）甘露醇作为冻干保护剂。将反应混合物分装到反应腔室中（每腔室约25 μL）。芯片通过在液氮蒸汽上方约1 cm处放置2分钟进行速冻，随后在黑暗中冻干12小时。恢复至室温后，贴附底部密封膜和顶部通气膜完成装置组装。
统计学与可重复性
使用GraphPad Prism软件进行统计分析。
研究结果
热力学编码的反应排序实现自主一锅法CRISPR协调
以往研究尝试使用光笼crRNA或温度开关等外部门控元件来时间分离扩增与CRISPR激活。这些方法虽有效，但缺乏内在机制来优先保证扩增而非CRISPR激活，导致对共享靶标分子的竞争失控。在这种条件下，过早的CRISPR参与不可避免地抑制扩增效率并使信号产生不稳定。本研究认为，强制反应排序不需要参数调节或削弱CRISPR活性，而需要在竞争性扩增途径之间引入明确的能量层级，使反应排序成为分子热力学的内在结果。
为实现这一目标，研究引入了两个具有明确热力学不对称性的正向引物（图1A，补充图1）：完全互补引物（FP，ΔGFP-Template ≈ −37.20 kcal/mol）驱动无PAM扩增子的高效扩增，而故意错配的引物（FPP，ΔGFPP-Template ≈ −30.71 kcal/mol）编码PAM但产生更高的杂交自由能代价。这种能量不平衡必然将扩增分为两个动力学上不同的阶段。在低模板丰度下，只有高亲和力的FP途径在热力学上可及，导致无法激活Cas12a的原始扩增子快速积累（图1B）。随着扩增进行和模板浓度增加，根据热力学关系ΔGeff = ΔG° − RT ln([Template]) + C（其中C为系统特异性常数），FPP结合的有效自由能垒逐渐降低，使第二个扩增阶段得以进行，安装含PAM的扩增子。因此，CRISPR激活表现为阈值门控行为，而非外部触发事件。
结果显示，两个正向引物之间明确的自由能差产生了两个动力学有序的等温重组酶聚合酶扩增（RPA）阶段。使用引物对FP/BP或FPP/BP（BP为反向引物）的RPA反应各自产生单一预期大小的扩增子，而同时含有两个正向引物的反应产生两个不同产物，对应于原始和FPP延伸扩增子（补充图2A）。测序数据验证FPP引物引入了工程化PAM而不影响原始产物（补充图2B）。实时动力学进一步表明，高亲和力FP引物驱动扩增早期阶段，而受结合强度降低惩罚的FPP引物则更慢地参与。在高模板输入下，速率差异缩小，与质量作用效应克服热力学惩罚一致（补充图3）。额外实验验证只有含PAM的双链DNA能高效激活Cas12a（补充图4）。
与这一机制一致，仅含FP的反应产生强健扩增但无可检测的CRISPR信号，而仅由FPP驱动的反应因扩增与靶标消耗同时进行而表现出微弱且不稳定的荧光。相比之下，同时含有两种引物的反应可重复地显示出延迟但强烈的CRISPR激活，反映了由引物热力学而非经验参数平衡编码的自主反应排序（图1C）。重要的是，持续的FP驱动扩增不断补充模板，即使在CRISPR激活后也能防止靶标耗竭，产生稳定的一锅法动力学。此外，系统对这一动态过程中的潜在Mg²⁺波动基本不敏感，在19–21 mM Mg²⁺范围内观察到高度相似的动力学，仅在15 mM时反应性能有适度降低（补充图5）。基于这一原理，研究建立了Thermodynamically Encoded Molecular Programming for One-pot diagnostics（TEMPO），并将其集成到微流控平台（图1D）中，用于快速病原体检测和SNP分析。
【数据】FP引物ΔG：约−37.20 kcal/mol；FPP引物ΔG：约−30.71 kcal/mol；模板输入：1 fM；Mg²⁺范围：19–21 mM（15 mM时性能适度降低）；n = 3技术重复
定量建模确立反应排序为可预测的设计结果
为概念化这一行为并将内在反应排序与经验调节区分开来，研究构建了描述引物竞争、扩增和PAM依赖性Cas12a激活的定量反应网络模型（补充注1）。该模型包含耦合的常微分方程，将引物杂交动力学、链延伸和CRISPR介导切割编码为质量作用和Michaelis-Menten过程。
引物竞争与热力学门控。 研究将引物结合建模为双分子缔合过程。工程化热力学开关的核心是携带错配的引物FPP，其降低的杂交自由能直接编码为更慢的动力学速率常数：
d[FPP·D]/dt = k₆[FPP][D] − k₆ᵉˣᵗ[FPP·D]
与完全互补的FP形成对比：
d[FP·D]/dt = k₁[FP][D] − k₁ᵉˣᵗ[FP·D]
模型中的质量作用动力学捕获了FPP结合的热力学惩罚如何转化为时间延迟。在低模板浓度下，FPP·D复合物的形成速率可忽略不计，扩增主要由FP途径主导。随着原始扩增子积累，模板池的化学势增加，有效降低了FPP结合的自由能垒，使含PAM扩增子得以产生。这种浓度依赖性转变在数学上等价于阈值门控——CRISPR激活仅在模板浓度超过临界阈值时启动，该阈值由FPP的杂交自由能决定。
该模型建立了一个可预测的引物设计框架：FPP的ΔΔG惩罚直接设定CRISPR激活的时间阈值，而FP与FPP之间的自由能差决定两个扩增阶段之间的时间间隔。模型预测与实验观察高度一致，验证了热力学编码反应排序作为可设计系统属性的可行性。
【数据】模型类型：常微分方程；动力学格式：质量作用与Michaelis-Menten；FPP结合惩罚：通过ΔΔG编码；阈值行为：由FPP杂交自由能决定
引物工程调控反应动力学与CRISPR信号输出
为验证引物热力学设计的可编程性，研究系统性地改变了FPP引物的长度、PAM序列和crRNA重叠区域。
FPP引物长度调控。 通过截短FPP引物改变其与模板的杂交自由能（−ΔG FPP-Template），从而调节含PAM次级扩增的速率。所有反应使用固定的1 fM模板输入。结果显示，引物长度作为可编程手柄，能够精细调节CRISPR激活的时间。较短的FPP引物（更低的−ΔG）导致更延迟的CRISPR信号，而全长FPP引物则产生较早的激活。这一趋势在来源于HIV基因组和人类基因组的两个DNA靶标中均得到一致验证（图2B、C）。
PAM序列变体。 FPP引物可编码不同的PAM序列以调节CRISPR信号输出。使用HIV基因组来源的DNA靶标1评估了五种PAM变体（TTG、TTT、TAT、TAG和AAG），使用人类基因组来源的DNA靶标2评估了五种PAM变体（TTT、ATT、TCT、ACT和ATA）。不同PAM变体产生不同的CRISPR激活动力学，表明PAM序列的选择可作为额外的调节维度（图2E、F）。
crRNA重叠工程。 FPP引物修饰可在CRISPR识别位点引入有效错配。通过在PAM下游定义位置引入单核苷酸错配（MUT-n表示在PAM后n个碱基处引入单核苷酸错配），系统性地改变了Cas12a的识别效率。结果显示，错配位置对CRISPR激活动力学有显著影响，为SNP区分提供了额外的设计自由度（图2H、I）。
【数据】模板输入：1 fM；PAM变体（靶标1）：TTG、TTT、TAT、TAG、AAG；PAM变体（靶标2）：TTT、ATT、TCT、ACT、ATA；n = 3技术重复
靶向位点重定位与PAM切换实现等位基因区分
靶向位点重定位。 通过引物工程将靶向位点重新定位。设计了两个位于靶序列不同位置的正向选择性引物（FPP1和FPP2），针对rs199476104靶标（1 fM）进行检测。在存在或不存在FPP1和FPP2的条件下，实时荧光扩增曲线显示，完整的TEMPO反应系统（FP/FPP/BP）产生延迟但强烈的CRISPR信号，而无FPP增强的反应（FP/BP）仅产生扩增而无CRISPR激活。非模板对照（NTC）无信号。这一结果表明，靶向位点的选择不影响TEMPO系统的反应排序能力（图3B、C）。
PAM切换策略。 FPP结合区域内的错配可重新分配PAM序列，实现等位基因依赖性Cas12a激活。使用rs671靶标SNP/WT基因型（1 fM输入），比较了经典PAM（TTT）和次优PAM变体（ATT）的Cas12a切割结果。结果显示，通过FPP错配工程实现的PAM切换能够区分SNP和野生型等位基因，次优PAM变体产生等位基因依赖性信号差异（图3E、F）。
单碱基插入增强等位基因区分。 在FPP中次优PAM编码位置下游引入单碱基插入，故意改变crRNA-靶标阅读框，在种子区域产生明确的单碱基错配。针对rs1229984靶标SNP基因型（1 fM输入），比较了无插入突变和有插入突变的两种设计。结果显示，插入突变设计显著增强了等位基因区分能力（图3H、I）。
【数据】靶标：rs199476104、rs671、rs1229984；模板输入：1 fM；PAM变体：TTT（经典）、ATT（次优）；n = 3技术重复
TEMPO在病原体检测中的临床验证
简化诊断工作流程。 临床标本（血清或拭子）经过快速RNA提取后，通过TEMPO和金标准RT-qPCR平行评估。这一简化流程旨在实现样本进-结果出的即时检测（图4A）。
灵敏度评估。 使用不同浓度的HIV来源DNA（10,000 aM、1000 aM、100 aM、10 aM、1 aM和0.1 aM）评估TEMPO的灵敏度。结果显示，低至1 aM浓度仍可观察到强荧光信号，蓝光下具有清晰的目视荧光。非模板对照（NTC）无信号。未配对双尾t检验分析统计显著性，ns表示不显著（图4B）。
模拟临床样本验证。 在具有不同RT-qPCR Ct值的提取HIV RNA模拟样本上评估TEMPO平台的荧光强度。结果显示TEMPO信号与RT-qPCR Ct值具有良好的对应关系。未配对双尾t检验显示极显著差异（****P < 0.0001）（图4C）。
临床样本检测。 在30分钟时间点测量TEMPO的终点荧光输出，对10份甲型流感和22份SARS-CoV-2临床样本进行验证，对应RT-qPCR结果显示在下方（绿点：阳性；空圈：阴性）。红色虚线代表阳性检测阈值。TEMPO检测结果与RT-qPCR结果高度一致，表明该系统在临床样本中具有可靠的检测性能（图4D、E）。
【数据】HIV DNA浓度范围：0.1–10,000 aM；检测限：1 aM；甲型流感样本：10份；SARS-CoV-2样本：22份；检测时间：30 min；统计检验：未配对双尾t检验（****P < 0.0001）；n = 3技术重复
SNP基因分型芯片的临床验证
SNP基因分型工作流程。 使用TEMPO进行SNP基因分型的工作流程为：采集拭子样本，室温裂解约5分钟。粗裂解液直接应用于SNP芯片，在37°C下进行30分钟的一锅法RPA-Cas12a反应。随后使用智能手机界面记录和解释荧光信号（图5A）。
等位基因依赖性动力学。 代表性扩增轨迹显示rs199476104的等位基因依赖性动力学。使用1 fM标准模板输入，在一锅法反应中生成对应于野生型、杂合子和突变型基因型的明显不同曲线（图5B）。
临床样本基因分型。 热图总结了20份临床样本在三个SNP位点（rs1229984、rs671和rs199476104）的TEMPO基因分型结果。每个单元格中编码的判别因子（DF）定量捕获SNP和野生型等位基因之间的相对荧光对比，实现明确的基因型分配。基因型判定基于DF阈值：DF值0–0.5分类为野生型，0.5–2.0为杂合子，>2为SNP（图5C）。
切割率验证。 以样本20为代表示例测量切割率。观察到的切割模式与预期等位基因状态匹配，并与每个柱上方提供的Sanger测序迹线高度一致（图5D）。
芯片展示。 SNP芯片图像以香港两元硬币作为尺寸参考，包括组装后的微流控芯片和样本20在30分钟反应后的代表性终点荧光模式，突出显示等位基因依赖性信号差异（图5E）。
智能手机界面。 用于实时数据采集、可视化和自动化SNP报告的智能手机界面（图5F）。
【数据】反应温度：37°C；反应时间：30 min；模板输入：1 fM；临床样本：20份；SNP位点：3个（rs1229984、rs671、rs199476104）；DF阈值：0–0.5野生型、0.5–2.0杂合子、>2 SNP；裂解时间：约5 min；n = 3技术重复
讨论与解读
一锅法CRISPR诊断的实用部署长期受限于在同一反应环境中协调核酸扩增与CRISPR介导信号转导的困难。大多数现有系统中，这些过程竞争共享中间体，导致动力学不稳定、靶标过早消耗和信号产生不一致。以往的解决方案——经验参数调节、物理分隔或外部时间控制——仅部分缓解了这些冲突，往往以牺牲稳健性、通用性或操作简便性为代价。从工程角度看，这些限制揭示了一个基本问题：一锅法CRISPR诊断中的反应顺序很少被设计，而是间接强加的。
本研究引入热力学编码的反应排序作为分子工程策略，代表了一锅法CRISPR诊断的概念转变。TEMPO不是通过减弱相互作用或外部阶段控制来减轻干扰，而是将反应排序直接编码到分子自由能景观中，将反应顺序从操作挑战转变为可编程的系统属性。这一框架同时解决了SNP基因分型的一个主要障碍：对前间隔序列邻近基序（PAM）的依赖。通过引物编码PAM，TEMPO将CRISPR识别从天然靶标序列的限制中解放出来，同时保留了单核苷酸区分能力。
编译者解读
TEMPO的核心创新在于将热力学设计原则注入分子诊断——用自由能差替代经验参数调节，使反应排序成为系统内在属性而非外部控制结果。这一思路在合成生物学中具有广泛借鉴意义：任何涉及多步酶促反应的级联系统，都可以通过底物结合自由能的编程实现自主时序控制。1 aM级别的灵敏度与30分钟的检测时间展示了实际应用潜力，但冻干试剂的长期稳定性、多靶标并行检测的通量扩展以及不同临床场景下的基质效应，仍是临床转化中需要面对的问题。PAM编码策略对靶标序列的解放，则为更广泛的基因分型和病原体检测场景打开了空间。
参考来源
Wu X, Li Y, Cao Y, Zhao Z, Lu H. Thermodynamically programmed one-pot CRISPR platform for point-of-care SNP genotyping. Nat Commun. PMID: 42414323.
PMID: 42414323