来源：Journal of Biological Chemistry | 编译：DNA Lab Space
导读
PDCD2是从酵母到人类都必需的保守蛋白，作为40S核糖体蛋白uS5的专属分子伴侣，其功能缺失会损害核糖体生物发生。癌细胞需要大量核糖体维持蛋白质合成，干扰PDCD2-uS5互作因此成为潜在抗癌策略。本研究通过亲和纯化与结构建模，定位了uS5第21-50位氨基酸为PDCD2结合所必需，并发现保守FxxGFG基序中的苯丙氨酸通过疏水作用稳定复合物。研究团队进一步开发了基于NanoBiT互补的活细胞生物传感器，并筛选出可抑制互作、损害癌细胞活力的11氨基酸肽段。
研究背景
PDCD2（程序性细胞死亡蛋白2）在物种间高度保守，专职充当40S核糖体蛋白uS5的分子伴侣。癌细胞依赖大量核糖体维持高水平的蛋白质合成，因此靶向PDCD2与uS5的互作界面被视为抑制核糖体生物发生、进而遏制肿瘤生长的可行策略。此前基于AlphaFold Multimer的计算建模提示uS5的N端区域对PDCD2识别至关重要，酵母中同源蛋白Tsr4与uS5的互作也依赖N端序列。然而，人源PDCD2-uS5复合物的精确结合决定簇尚未明确，更缺乏可在活细胞中监测该互作并筛选抑制剂的灵敏工具。
研究方法
细胞培养
人MOLT-4、HEK293T、HeLa和U2OS细胞系均购自ATCC。贴壁细胞系在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Wisent #319-005 CL）中培养，添加10%胎牛血清（Corning #35-077-CV）、1%青霉素-链霉素（Wisent #450-202 EL）和1%非必需氨基酸（Wisent #321-011 EL），于37°C、5% CO₂条件下培养。MOLT-4悬浮细胞在RPMI1640培养基（Wisent #350-200-CL）中培养，补加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1%非必需氨基酸，培养条件同上。U2OS-Flag-PDCD2和HeLa-uS5-YFP稳定诱导细胞系此前已有报道，转基因表达使用终浓度1000 ng/ml的多西环素诱导。除NanoBiT生物传感器构建体外的所有转染均使用Lipofectamine 2000（Invitrogen #11668019），按制造商说明书操作。siRNA转染终浓度为20 nM。NanoBiT构建体的转染使用PolyJet试剂（SignaGen #SL100688），按制造商说明进行：质粒DNA与PolyJet在无血清DMEM中以1:3比例稀释（3 μl PolyJet：1 μg DNA），混匀后室温孵育15 min，随后将转染混合液滴加至培养物表面。
质粒构建与定点突变
uS5-YFP质粒此前已有描述。为构建uS5截短变体，以uS5-YFP为模板，使用针对目标区域侧翼设计的引物进行PCR扩增。PCR产物纯化后，利用Gibson Assembly试剂盒（NEB #E2621G）克隆至pEGFP-N1载体，置于CMV启动子控制下，与C端GFP标签融合。定点突变采用含目标突变的引物（突变位于引物5′端或中间），以野生型质粒为模板进行PCR，产物纯化后经KLD（NEB #M0554）或Quick Change处理。Flag-PDCD2和PDCD2-GFP质粒此前已有报道。所有构建体经Sanger测序验证（Université Laval测序平台）。本研究使用引物数量较多，引物序列可向作者索取。
蛋白分析与抗体
蛋白提取时，6孔板细胞以1 ml冰预冷PBS收集，1500 rpm离心3 min（4°C）沉淀。沉淀重悬于100 μl裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl、0.1% Triton X-100、10%甘油、2 mM MgCl₂），补加Complete蛋白酶抑制剂混合物（Roche #11873580001），冰上孵育15 min。裂解液13,000 rpm离心10 min（4°C），上清用于蛋白分析。免疫共沉淀实验中，约90 μl裂解液与25 μl GFP-trap磁珠（ProteinTech）或anti-FLAG M2亲和凝胶（Millipore #A2220）孵育。磁珠先用1 ml裂解缓冲液预洗3次（每次1 min），重悬于补加蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。裂解液与磁珠在4°C旋转孵育2 h，随后磁珠沉淀，用1 ml含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液洗涤5次（每次1 min）。蛋白在25 μl 1× SDS上样缓冲液（63 mM Tris-HCl pH 6.8、10%甘油、2%十二烷基硫酸钠、0.1 M DTT、溴酚蓝）中洗脱。Western blot分析中，蛋白经SDS-PAGE分离后转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭，与一抗孵育：PDCD2（Abcam #ab133324）、uS5（Santa Cruz Biotechnology #sc-130399）、Tubulin（Sigma #T5168）、Actb（Sigma #A5441）、GFP（Roche #11814460001）、Flag（Sigma #F1804）。二抗使用偶联IRDye 800CW的驴抗兔抗体（Li-Cor #926-32213）和偶联Alexa Fluor 680的山羊抗小鼠抗体（Life Technologies #A-21057），在Odyssey Classic（LI-COR）上显像。条带强度以Odyssey Software V3.0（LI-COR）定量。
荧光与共聚焦显微镜
PDCD2定位实验：条件性表达Flag-PDCD2的U2OS-FT细胞在6孔板盖玻片上培养，转染野生型或突变型uS5²¹⁻⁵⁰-GFP，随后用多西环素诱导Flag-PDCD2表达24 h。uS5²¹⁻⁵⁰-GFP定位实验：U2OS-FT细胞转染野生型或突变型uS5²¹⁻⁵⁰-GFP 24 h。肽段摄取可视化：HeLa细胞在含野生型或突变型FITC标记肽段的培养基中于盖玻片上培养。盖玻片在4%多聚甲醛中室温固定15 min，冰预冷乙醇（75%）通透10 min，以保留可检测的天然GFP荧光。DAPI（Sigma #D9542）和抗Fibrillarin抗体（Cell Signalling #2639）分别标记细胞核和核仁。Flag-PDCD2以抗Flag抗体（Sigma #F1804）染色，Flag和Fibrillarin均使用Alexa Fluor 568偶联二抗（Invitrogen #A11019和#A21069）显色。显微镜分析在Zeiss LSM880或Zeiss LSM700上进行。代表性显微图像以8个z切面堆栈拍摄，间隔1.5 μm，使用ZEN2.6软件去卷积，并以ImageJ定制插件堆叠。核质比和核仁/核比使用CellProfiler 4.1.3软件测量，方法同前。
uS5-PDCD2生物传感器实验
NanoBiT生物传感器质粒由GenScript合成。为开发NanoBiT-based uS5-PDCD2互作生物传感器，uS5和PDCD2基因编码序列经密码子优化，克隆至pcDNA3.1(+)载体CMV启动子下游，N端融合3xFlag标签，同时将SmBiT或LgBiT蛋白序列融合于N端或C端，C端另融合10xHis标签。考虑标签位置和组合，共设计8个质粒（uS5和PDCD2各4个）。为筛选最佳uS5-PDCD2组合，质粒共转染HEK293T细胞。转染36 h后，细胞以冰预冷PBS洗涤，重悬于裂解缓冲液（Invitrogen #FNN0021），冰上孵育10 min后转移至1.5 ml离心管，13,000 rpm离心（4°C）去除不溶物。收集上清，每孔50 μl裂解液加入96孔不透明白板进行生物发光读数。腔肠素（CTZ，NanoLight #303）以终浓度3.6 μM加入各孔。活细胞实验：转染36 h后，96孔板细胞在含CTZ的新鲜培养基中孵育30 min，以温PBS洗涤一次，加入50 μl含CTZ的温PBS。生物发光在Biotek Synergy酶标仪上读取，积分时间500 msec，增益220。
固相肽合成
uS5衍生肽段在Symphony X多肽合成仪（Gyros Protein Technologies）上采用标准Fmoc固相肽合成法合成。合成在0.04 mmol规模进行，使用TentaGel S RAM树脂（载量：0.23 mmol/g）。偶联反应使用5当量Fmoc保护氨基酸、5当量HATU和20当量N-甲基吗啉（溶于DMF）。Fmoc脱保护使用20%哌啶/DMF溶液。肽链延伸完成后，用三氟乙酸裂解树脂并同时脱除侧链保护基。
研究结果
uS5第21至50位残基是与人类PDCD2互作所必需且充分的区域
研究团队基于AlphaFold Multimer的计算建模预测了PDCD2-uS5复合物结构，提示uS5的N端区域对PDCD2识别很重要。该预测与生化数据一致——酿酒酵母uS5的N端前100个氨基酸是与酵母PDCD2同源物Tsr4互作所必需的。为直接检验人PDCD2-uS5复合物的预测模型，团队使用一组表达uS5不同结构域（C端融合GFP标签）的质粒进行免疫共沉淀实验（图1A）。根据酵母uS5-Tsr4复合物数据及人PDCD2-uS5的AlphaFold Multimer预测，设计了包含第1-50、1-102和51-102位氨基酸的构建体。质粒转染HEK293T细胞后，总提取物进行anti-GFP纯化，通过免疫印迹分析内源PDCD2的共纯化情况。对照实验中，全长uS5-GFP有效共纯化内源PDCD2（图1B，泳道8），而单独GFP不能共纯化PDCD2（图1B，泳道9）。结果显示，uS5第1-50和1-102位残基共纯化内源PDCD2的水平与全长uS5相当（泳道10-11对比泳道8）；而uS5第51-102位残基无法与PDCD2形成稳定复合物（图1B，泳道12）。这表明uS5前50个氨基酸对PDCD2识别至关重要。
随后以uS5¹⁻⁵⁰为基础进行10氨基酸截短，构建表达uS5第1-40、1-30、1-20和1-10位残基的质粒（图1A）。如图1C所示，uS5第1-30、1-20和1-10位残基的亲和纯化中均未检测到PDCD2（泳道11-13）。虽然uS5¹⁻⁴⁰可共纯化内源PDCD2，但共纯化水平较uS5¹⁻⁵⁰降低（图1D，泳道13对比泳道11）。团队因此认为uS5第40-50位残基虽非关键，但对与PDCD2的稳定结合很重要。由于uS5前30个氨基酸不足以促进稳定的uS5-PDCD2互作，且基于AlphaFold建模，uS5 N端无序区第21-50位残基在与PDCD2结合后表现出最大的结构变化，团队在uS5全长背景下删除了第21-50位残基（图1A）。如图1D所示，uS5中第21-50位残基的缺失完全消除了其共纯化内源PDCD2的能力（泳道12），而全长uS5保留该能力（泳道9）。相反，将uS5第21-50位残基融合至GFP足以促进稳定的uS5-PDCD2复合物形成（图1D，泳道14）。综上，亲和纯化实验证明uS5第21-50位残基是与人类PDCD2互作所必需且充分的条件。
uS5²¹⁻⁵⁰中保守的FxxGFG基序与PDCD2的疏水核心区域对形成稳定uS5-PDCD2复合物至关重要
研究团队注意到多细胞生物uS5真核特异性N端延伸中存在保守的FxxGFG基序，而出芽酵母和裂殖酵母中为更基础的GFG基序。有趣的是，人uS5的FxxGFG基序中两个苯丙氨酸残基（F25和F29）似乎埋藏在PDCD2的口袋状疏水核心区域内（图2A-C）。使用预测的uS5-PDCD2模型进行氨基酸接触分析发现，F25和F29以及R38和R68是uS5中与PDCD2距离最近（预测接触数在4.0 Å以下）的最活跃残基。具体而言，uS5的F25和F29被一对疏水层包围，形成"疏水三明治"构型，而uS5的R38和R68参与盐桥，可能在PDCD2分子识别中发挥关键作用。
为评估uS5 F25和F29残基对PDCD2结合的功能意义，团队构建了一系列uS5变体，将F25和/或F29替换为丙氨酸或酪氨酸。共纯化实验显示，当F25或F29被替换时，uS5沉淀中内源PDCD2水平下降（图2D，泳道15-18；定量见图2E）。值得注意的是，F25和F29同时替换为丙氨酸的uS5 AAR变体，其PDCD2富集水平的下降程度大于F25A和F29A单突变体（图2D，泳道20对比泳道17-18；图2E），提示这两个保守苯丙氨酸残基在PDCD2互作中具有叠加作用。与氨基酸接触分析预测一致，uS5 R68也显著促进稳定uS5-PDCD2复合物的形成（图2D，泳道19；图2E）。当uS5 R68与F25或F29同时替换（分别为AFA或FAA变体）时，uS5与PDCD2之间的结合被完全消除（图2D，泳道21-22；图2E）。在uS5最小结构域（uS5²¹⁻⁵⁰）背景下分析F25和F29单突变体时，F25或F29单替换为酪氨酸或丙氨酸均导致与内源PDCD2互作的完全丧失（图2F，泳道12-13和15-16；定量见图2G）。事实上，除F29Y外，F25Y、F25A和F29A变体在uS5最小结构域背景下均表现出蛋白水平降低（图2F，泳道3-8；图2H），提示这些变体的蛋白稳定性下降。此外，团队针对预测构成疏水口袋（uS5的F25和F29芳香族侧链插入其中）的PDCD2氨基酸构建了突变体，将脯氨酸-111（P111）、异亮氨酸-196（I196）和酪氨酸-258（Y258）替换为较小的极性残基丝氨酸。PDCD2构建体转染HEK293T细胞后，总提取物进行anti-GFP纯化，通过免疫印迹分析内源uS5的共纯化。如图2I所示，PDCD2 Y258S变体与uS5互作缺陷（泳道11；图2J），而PDCD2 P111S变体的相对uS5结合降低3倍（泳道9-10对比；图2J）。相比之下，PDCD2 I196S变体对uS5-PDCD2复合物形成无显著影响（图2I，泳道12；图2J）。综合图2数据表明，uS5保守FxxGFG基序中的苯丙氨酸残基通过与构成PDCD2疏水口袋的残基相互作用，对形成稳定的uS5-PDCD2复合物至关重要。
过量的uS5²¹⁻⁵⁰抑制uS5-PDCD2复合物形成并影响PDCD2亚细胞定位
在确定uS5²¹⁻⁵⁰是与PDCD2互作所必需且充分的条件后，团队检验了uS5²¹⁻⁵⁰竞争PDCD2-uS5互作的潜力。为此，在稳定表达Flag标记PDCD2的人细胞中过表达uS5²¹⁻⁵⁰-GFP，分析Flag-PDCD2共纯化的内源uS5水平。如图3A所示，过量uS5最小结构域显著降低了Flag-PDCD2共纯化的内源uS5水平，与单独过表达GFP的细胞相比（泳道1-2对比；定量见图3B）。为评估该竞争的专一性，团队还过表达了F29Y替换的uS5²¹⁻⁵⁰-GFP版本，该版本不结合PDCD2但表达水平与野生型uS5²¹⁻⁵⁰相当。
基于互补的NanoBiT生物传感器用于分析uS5-PDCD2互作
团队开发了一种基于NanoBiT互补的生物传感器系统。NanoBiT荧光素酶被分为两个互补片段LgBiT和SmBiT，分别融合到目标蛋白uS5和PDCD2上。当两个蛋白互作时，片段重新组装形成有活性的NanoLuc荧光素酶，在底物存在下产生生物发光。在HEK293T细胞中共转染相应构建体48 h后，检测到显著的相对生物发光信号，PD-1/PD-L1互作作为阳性对照（图4B）。活细胞实验同样检测到生物发光信号（图4C）。利用该生物传感器，团队验证了SmBiT-uS5与LgBiT-PDCD2组合的特异性——野生型SmBiT-uS5与LgBiT-PDCD2共转染产生强信号，而F25A/F29A突变体信号显著降低（图4D）。体外混合实验也证实了该系统的可行性（图4E）。基于此传感器，团队建立了肽段竞争实验：将含SmBiT-uS5的细胞提取物与含LgBiT-PDCD2（预先与不同浓度uS5衍生肽段孵育）的提取物混合，野生型肽段以剂量依赖方式抑制生物发光重建，而突变型肽段无此效果（图4F）。团队进一步测试了uS5衍生肽段的截短版本（图4G），发现11个氨基酸长度的肽段（对应uS5第22-32位）保留了抑制活性（图4H）。
uS5衍生肽段抑制癌细胞生长
团队合成了含细胞穿透肽（CPP）的uS5衍生肽段，命名为CPP-uS5（22-32），N端标记FITC荧光基团（图5A）。荧光显微镜显示，HeLa细胞与20 μM野生型或突变型CPP-uS5（22-32）肽段孵育24 h后，两种肽段均可进入细胞（图5B）。剂量-反应分析显示，野生型肽段处理HeLa细胞24 h后以剂量依赖方式降低细胞活力，而F25A/F29A突变型肽段效果显著减弱（图5C）。在MOLT-4白血病细胞中观察到类似趋势（图5D）。通过非线性回归拟合剂量-反应曲线，野生型肽段对HeLa细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）值显著低于突变型肽段（图5E）。
讨论与解读
本研究阐明了人40S核糖体蛋白uS5被其专属分子伴侣PDCD2特异性识别的分子基础。团队在uS5真核特异性N端延伸区域内定位了一个最小的PDCD2互作区（第21-50位氨基酸），并证明该区域内保守的苯丙氨酸残基是分子识别的关键决定因素。结构建模与突变分析支持以下机制：F25和F29插入PDCD2的疏水口袋以稳定复合物形成。在全长uS5中，这些残基对PDCD2结合具有叠加贡献，而在分离的最小结构域中每个苯丙氨酸都是必需的，表明天然背景下额外的接触增强了复合物稳定性。综合数据支持F25和F29作为锚定残基促进PDCD2对新生uS5的共翻译捕获。N端元件的识别似乎是核糖体蛋白专属分子伴侣系统的保守特征——酵母PDCD2同源物Tsr4也结合uS5的最N端，其他几种专属分子伴侣同样结合其核糖体蛋白底物的N端区域。这种定位方式可在翻译过程中早期捕获新生多肽，限制聚集或降解。
编译者解读
本研究从蛋白互作界面解析到功能性抑制剂开发形成了完整链条，方法学上具有示范意义。NanoBiT互补生物传感器的引入尤为亮眼——它能够在活细胞和细胞提取物中实时监测uS5-PDCD2互作，为后续高通量筛选提供了灵敏工具。从应用角度看，11氨基酸肽段能穿透细胞并抑制癌细胞活力，为拟肽类抑制剂开发提供了先导化合物。值得注意的是，该策略靶向核糖体蛋白-分子伴侣界面而非核糖体本身，理论上可选择性干扰癌细胞过度活跃的核糖体生物发生，同时保留正常细胞的基础功能。未来若能在动物模型中验证其体内活性和肿瘤选择性，该策略有望拓展为一种新型抗癌治疗模态。局限在于肽段的体内稳定性和递送效率仍需优化。
DOI: 10.1016/j.jbc.2026.111415