来源：J Exp Bot | 编译：DNA Lab Space
导读
植物合成生物学研究常受限于异源蛋白表达平台的效率。本研究建立了一种基于拟南芥悬浮细胞的植物细胞包（PCP）渗透转化系统，无需特殊设备即可实现瞬时与稳定转化，两周内可生产100克转基因细胞，并能从单一构建体表达至少六个基因。研究还系统表征了12个组成型启动子，筛选出多个适合植物表达的古菌NifB蛋白变体，并成功构建表达固氮酶成熟因子NifB模块的稳定细胞系。
研究背景
植物细胞悬浮培养为异源蛋白生产提供了有价值的系统，相比整株植物具有多项优势：生长速度快、培养方案简单、细胞群体更均匀从而降低生物复杂性。悬浮培养的均质性有利于实验可重复性和规模化，这对需要精确控制基因表达的合成生物学应用至关重要。此外，所有细胞与培养基直接接触，可快速均匀地接触外源化合物，如表达诱导剂、信号分子或营养物质。这些特征使植物悬浮培养成为加速植物合成生物学设计-构建-测试循环的有力平台。
多种植物已被用于细胞悬浮表达系统，其中烟草、水稻和胡萝卜使用最广泛。拟南芥虽然使用较少，但作为研究最深入的模式植物，拥有丰富的遗传资源，包括突变体库和注释完善的基因组，其优势尚待充分发掘。
研究方法
PCP渗透是快速生成稳定转化植物细胞的方法
我们假设渗透后的PCP可作为稳定转化细胞培养物的有效来源。该假设使用农杆菌菌株GV3101::pMP90进行验证，因为该菌株已成功用于拟南芥悬浮细胞的稳定转化（Burén et al., 2011; García-León et al., 2018）。将携带潮霉素筛选标记的PCP重悬于添加羧苄青霉素和万古霉素的新鲜培养基中以清除农杆菌，在潮霉素筛选下PCP迅速形成转基因悬浮培养物，RUBY报告基因的表达证实了这一点（补充图S2B–E）。对于细胞系Col-0和MM1，使用约200 mg和约60 mg的小PCP以及约8 g的大PCP均可实现转化。大PCP转化后经潮霉素筛选和培养放大，在PCP渗透后13 d内可生产近100 g（鲜重）的转化Col-0细胞（补充图S2D）。与瞬时表达观察结果相似，从MM1细胞系制备的PCP只有在渗透前于黑暗条件下培养，才能稳定形成转基因系（补充图S2E）。此外，与农杆菌共培养2 d比3 d产生更一致的转化结果，所用农杆菌的光密度为0.1时比更高密度0.4更有利于转化（补充图S2E）。
瞬时表达系统的建立与优化
我们首先尝试提高拟南芥悬浮细胞农杆菌介导瞬时表达工作流程的通量。该方法基于近期开发的PCP渗透技术，最初为烟草BY-2细胞建立（Rademacher et al., 2019）。为便于单独操作PCP，将其铸入过滤移液枪头顶部，使用RUBY（He et al., 2020）和GFP报告基因评估转化成功与否。
我们首先评估了四种不同农杆菌菌株对不同拟南芥细胞系进行PCP渗透的适用性，发现菌株GV3101::pMP90可在Col-0（图2A）和YG1（补充图S2A）细胞系中诱导RUBY表达，但在MM1、PSB-L和T87细胞系中无表达（图2A）。菌株AGL-1在Col-0中诱导RUBY表达，但在其他测试细胞系MM1、PSB-L和T87中无表达（图2A）。同样，菌株EHA105仅在Col-0中诱导RUBY表达，在MM1和PSB-L中无表达（补充图S2A）。最后，用菌株LBA4404渗透的PCP从未产生可见的RUBY信号（图2A）。农杆菌的培养方式不影响渗透成功率，液体或固体培养基培养的菌液均能诱导RUBY表达（图2B）。
由于Col-0和YG1常规在黑暗中培养，而其他细胞系在16 h光周期下培养，我们假设光照培养可能阻碍转化。随后比较了在黑暗或16 h光周期下培养的Col-0和MM1细胞对PCP渗透的接受能力。确实，Col-0细胞在16 h光周期下培养时转化完全消失（图2C）。同样，黑暗中培养的MM1细胞更易于PCP渗透；然而，只有从150 µl细胞悬浮液而非500 µl制备的小PCP能稳定获得高转化效率（图2A、D）。
接下来，我们测试了共表达沉默抑制因子p19是否能改善拟南芥PCP渗透。在Col-0 PCP中进行了GFP和p19的共表达，使用单一农杆菌菌株在同一质粒上携带两个基因，或使用两种共渗透菌株各携带一个基因。为避免检测到农杆菌细胞中表达的GFP（Buschmann, 2016已有报道），使用了含有DEM1内含子的gfp版本（Christie et al., 2011）。无论gfp和p19在同一质粒上还是共渗透，p19均能改善GFP表达（图2E）。
启动子表征
为扩展合成生物学应用的分子工具包，包括多基因构建体的异源表达，我们在拟南芥悬浮细胞中表征了12个组成型启动子。使用基于荧光素酶的报告系统测量渗透PCP中的启动子活性。木薯脉花叶病毒（CsVMV）启动子导致最高的荧光素酶表达，因此其他启动子的活性以CsVMV活性的百分比表示（图3）。广泛使用的花椰菜花叶病毒35S（CaMV35S）启动子表现出相似活性（96±16%），其次是拟南芥泛素-10（AtUbq10）启动子（73±3%）和农杆菌甘露碱合酶（AtuMas）启动子（30±12%）。番茄组蛋白H4（SlH4）启动子和农杆菌胭脂碱合酶（AtuNos）启动子明显较弱（分别为3±1%和3±3%；图3）。六个最弱启动子的活性在0.6±0.2%至0.3±0.2%之间。这些发现表明，CsVMV、CaMV35S、AtUbq10和AtuMas启动子最适合在拟南芥悬浮细胞中异源表达待纯化和生化表征的蛋白质。较弱的启动子可用于驱动需要量较低的辅助蛋白的表达。
研究结果
NifB功能模块的可溶蛋白可在拟南芥悬浮细胞中表达并靶向质体
为验证该系统在复杂合成生物学应用中的实用性，我们测试了固氮酶生物合成途径中NifB功能模块蛋白的表达。分别由拟南芥泛素-10启动子、番茄组蛋白H4启动子和木薯脉花叶病毒（CsVMV）启动子驱动nifU、nifS和fdxN基因表达，三种蛋白分别融合至拟南芥蛋白TOCC、CAB6和GLTB2的叶绿体靶向肽（CTP）最短版本（Eseverri et al., 2020a）。FdxN融合HA标签用于检测，而NifU和NifS不带标签。Col-0细胞分别用质粒pN2LM165（重复1）和pN2LM166（重复2）转化，蛋白提取缓冲液含100 mM Tris–HCl（pH 8）、150 mM NaCl、10%甘油和0.5%蛋白酶抑制剂混合物。Western blot检测总蛋白和可溶部分，确认三种蛋白均以可溶形式表达（图4A）。共聚焦激光扫描显微镜分析显示，NifU、NifS和FdxN分别与TOCC、CAB6和GLTB2 CTP融合后均定位于叶绿体，与mCherry报告基因融合RecA CTP的质体定位对照一致（图4B）。
溶解度筛选鉴定出适合植物表达的新型古菌NifB蛋白变体
基于上述模块的成功表达，我们进一步对NifB同源蛋白进行溶解度筛选。首先构建了稳定表达nifU、nifS和fdxN::HA的转基因背景细胞系。在该背景系中，不同nifB同源基因融合BCCP1叶绿体靶向肽（Eseverri et al., 2020b），与gfp（转化对照）和p19（沉默抑制因子）瞬时共表达（图5A）。
NifB文库的构建流程如下：以Uniprot注释的NifB变体为起点，筛选已知NifB蛋白基序（Arragain et al., 2017）和古菌来源。利用Bac Dive等公共数据库（Schober et al., 2025）及分离来源信息，从嗜热生物中选择了8个NifB同源蛋白。此外，还纳入了4个来自已知固氮古菌的同源蛋白、1个来自未培养古菌的同源蛋白和2个来自极端细菌的同源蛋白。合成基因设计使用DNA Chisel程序（Zulkower and Rosser, 2020），重点匹配拟南芥密码子使用偏好，获得高GC和GC3含量，同时避免已知mRNA不稳定基序（图5B）。
Western blot检测总蛋白（T）和可溶部分（S），NifB变体融合Twin-Strep（TS）标签，用Strep单克隆抗体（StrepMAB）检测。以不含nifB的相同表达载体作为阴性对照（–NifB）。筛选结果鉴定出多个适合植物表达的古菌NifB变体（图5C）。
稳定转化植物细胞中NifB模块的多基因堆叠
最后，我们构建了包含五个质体靶向蛋白和一个胞质GFP的单一T-DNA构建体，用于稳定转化：NifU、NifS、FdxN::HA、Twin-Strep::NifB和胞质GFP（图6A）。以Methanobacterium bryantii的nifB基因转化MM1植物细胞，Western blot使用α-NifU、α-NifS、α-HA、α-StrepII和α-GFP抗体检测总蛋白和可溶提取物，确认五个基因均成功表达（图6B）。
以Methanosarcina acetivorans的nifB基因转化Col-0细胞，使用Strep-Tactin®XT 4Flow®亲和层析纯化TS-NifB蛋白。考马斯亮蓝染色的SDS–PAGE凝胶显示，星号标记的条带对应TS-NifB的预期分子量39.5 kDa（图6C）。质谱分析确认条带3为TS::NifB，而条带1、2和4对应共纯化的拟南芥蛋白甲基巴豆酰辅酶A羧化酶α亚基（Q42523）和β亚基（Q9LDD8），以及乙酰辅酶A羧化酶生物素羧基载体蛋白（F4KE21）。条带5为拟南芥蛋白A0A384KVD0和Q9SSR9的混合物，功能未知。Western blot分析纯化各步骤（图6D），使用α-Strep（StrepMAB）、α-RbcL和α-GFP抗体检测。
讨论与解读
本研究建立并验证了一种在拟南芥悬浮培养中快速高效表达多基因构建体的工作流程，旨在实现植物细胞中固氮途径重建等复杂工程任务。该方法基于PCP渗透技术并适配拟南芥，展示了稳健的转化效率、与多种细胞系的兼容性以及快速生成稳定转化培养物的能力。通过将该系统应用于质体靶向Nif蛋白的表达，展示了其在合成生物学应用中的实用性。本工作的关键创新在于将瞬时和稳定转化工作流程整合为一个精简平台。与此前需要40天以上才能获得200 ml转基因细胞培养物（García-León et al., 2018）或29天获得42 ml培养物（Van Leene et al., 2011）的方法相比，本工作流程可在不到两周内产生含100克细胞的300 ml转基因培养物。这一加速可能源于更高的起始材料量和更高的转化效率。值得注意的是，黑暗培养条件显著改善了MM1细胞最初较低的转化效率。
编译者解读
该平台的核心价值在于将PCP渗透技术从烟草拓展至拟南芥，并巧妙地将瞬时与稳定转化整合为统一流程。启动子系统表征和NifB同源文库筛选体现了典型的合成生物学"设计-构建-测试"循环。尤其值得关注的是，通过单一构建体堆叠六个基因（含五个质体靶向蛋白）并实现可溶性表达，为植物固氮酶工程提供了可行工具。局限在于部分细胞系（如PSB-L、T87）对渗透转化不敏感，且NifB蛋白的纯化仍伴随内源蛋白共纯化问题，后续需进一步优化亲和纯化条件或开发更具选择性的标签系统。该平台对表达不稳定或低丰度蛋白具有独特优势，有望加速植物合成生物学的工业化应用。
参考来源
Meile L, Alonso-Tolo G, Ferreiro-Eiras Z, Jiang X, Burén S. A high-throughput heterologous expression platform for plant synthetic biology based on Arabidopsis suspension cells. J Exp Bot, PMID: 41432110.
PMID: 41432110