来源：Int J Mol Sci | 编译：DNA Lab Space
导读
木质纤维素是地球上最丰富的可再生有机碳库，但其致密的木质素屏障长期阻碍生物转化效率。本研究聚焦于枯草芽孢杆菌T7菌株，通过同源建模、分子对接和分子动力学模拟等计算生物学手段，系统解析了该菌株13种碳水化合物活性酶的结构特征与底物识别机制。研究发现Abhydrolase_1与木四糖结合亲和力达−7.7 kcal/mol，GH9内切葡聚糖酶与纤维四糖结合亲和力为−7.0 kcal/mol，并经100 ns分子动力学模拟验证了复合物的结构稳定性。计算结果与该菌株实验观察到的24.5 mm纤维素酶水解圈、63.4%碱木质素脱色率等表型数据高度吻合。
研究背景
全球能源体系仍高度依赖化石燃料，其供应超过80%的一次能源，同时驱动资源枯竭与温室气体排放上升。氢气因其燃烧产物仅为水、质量能量密度高达142 MJ kg⁻¹而被视为可行替代能源。与此同时，全球每年约产生13亿吨木质纤维素有机废弃物，包括食物残渣、农作物秸秆和林果业副产品，这些生物质是低成本、可再生的原料。暗发酵产氢路径中，梭菌属通常仅实现1–2 mol H₂/mol己糖的产率，远低于乙酸途径理论最大值4 mol H₂/mol己糖；且多数梭菌缺乏天然木质素降解能力，需额外预处理或共培养体系，增加了工艺复杂性。木质纤维素含纤维素（40–50%）、半纤维素（20–40%）和木质素（10–30%），多酚类木质素基质屏蔽多糖组分，限制酶可及性，构成生物精炼的主要技术瓶颈。传统物化预处理虽可破除木质素屏障，但能耗高、成本大。枯草芽孢杆菌T7因兼具木质素修饰与水解酶分泌能力，有望实现整合生物加工。
研究方法
本研究对B. subtilis T7基因组中编码的碳水化合物活性酶开展计算机模拟结构表征，为前期报道的木质素修饰与生物产氢实验观察提供机制层面的支持。工作流程依次为：目标蛋白筛选与同源建模（含辅因子引入）、配体制备、盲对接、位点特异性对接、顶级复合物筛选用于分子动力学模拟、模拟执行与轨迹分析。全部计算使用公开工具与标准流程以确保可靠性。
配体制备。 碳水化合物配体包括纤维五糖、木四糖和纤维二糖。其中，纤维五糖仅用于补充表S2中报道的菌株间GH9比较；纤维四糖和木四糖用于正文12对组合的对接筛选，两个最高亲和力复合物（Abhydrolase_1-木四糖和GH9-纤维四糖）进入分子动力学模拟。配体三维结构使用碳水化合物专用GLYCAM06力场，通过GLYCAM-Web服务器（glycam.org）制备。结构序列或人工构建，或使用同源Protein Data Bank（PDB）结构中的天然寡糖（如PDB ID 7R2D中的纤维五糖）交叉校验，确保天然立体化学和β-(1→4)糖苷键的正确表征。结构先在GLYCAM服务器上进行能量最小化，以保持吡喃糖环最低能量的生物活性⁴C₁椅式构象。最小化后的坐标导入AutoDockTools（V1.5.7），添加所有极性氢、合并非极性氢并分配Gasteiger部分电荷。为在对接模拟中保持环完整性，环内单键设为不可旋转（扭转树审计）。聚合物主链的构象自由度得以保留，而环外基团和核心糖苷键（phi和psi二面角）的柔性被系统约束，允许对主链几何进行现实采样。转换为AutoDock PDBQT格式前，所有最终构象通过PyMOL（v2.5，Schrodinger, LLC）中的可视化和定量二面角分析验证，并与椅式构象的理想二面角范围进行比较。
CAZymes筛选与同源建模。 从B. subtilis T7注释基因组中选出13种与木质纤维素降解相关的CAZymes。使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org）预测三维结构。每个靶标选择序列同一性、覆盖率、全局模型质量估计（GMQE > 0.7）和QMEAN评分（>−4.0）最佳的模板。模型在BIOVIA Discovery Studio 2021中添加极性氢并分配部分原子电荷后用于对接。对两种氧化酶进行辅因子引入：AA10裂解性多糖单加氧酶模型纳入Cu²⁺，AA3氧化还原酶模型纳入FAD。辅因子位置通过保守配位残基和与实验解析模板的结构比对（核心区域RMSD < 1.0 Å）验证。占据甘氨酸富集基序的最高评分构象被保留。
分子对接。 使用AutoDock Vina（版本1.2.7）进行盲分子对接，以探索靶酶的整体结合景观并识别非经典和别构结合腔。受体蛋白制备包括去除水分子、添加极性氢和分配Kollman电荷。大型网格盒以每个蛋白结构的几何中心为中心，网格点间距足够大以覆盖整个溶剂暴露表面，从而避免对结合位点位置的先验假设。exhaustiveness参数设为8或更高，以实现碳水化合物主链在整个蛋白表面的充分构象采样。
位点特异性分子对接。 通过位点特异性分子对接研究碳水化合物配体与GH9内切葡聚糖酶和Abhydrolase_1的结合亲和力及精确分子相互作用。使用基于机器学习的表面形貌服务器PrankWeb预测结合腔。排名最高的预测口袋的质心用于定义对接网格锚点，网格盒尺寸根据每个口袋的物理体积和关键残基组成动态缩放（20 Å至30 Å）。AutoDock Vina采用刚性受体和柔性配体。最终结合构象按结合自由能ΔG（kcal/mol）排序，并评估配体在各酶催化裂隙内的取向。
分子动力学模拟。 选定的酶-配体复合物使用GROMACS 2023.2和CHARMM36力场进行全原子分子动力学模拟。每个系统在立方体盒子中用TIP3P水分子溶剂化，并以0.15 M NaCl中和以近似生理离子强度。能量最小化采用最陡下降算法，直至最大力低于1000 kJ mol⁻¹ nm⁻¹。平衡分两个阶段：NVT系综100 ps和NPT系综500 ps，均采用V-rescale恒温器和Parrinello–Rahman恒压器（GROMACS 2020.6实现，GROMACS开发团队，荷兰格罗宁根；由巴基斯坦拉合尔Johar Town C-II基因组学与信息学实验室协调）。每次生产运行持续100 ns，积分时间步长2 fs。温度维持300 K（V-rescale恒温器），压力维持1 bar（Parrinello–Rahman恒压器）。含氢原子的共价键用LINCS算法约束。使用随机初始速度种子进行三次独立重复以评估可重复性。轨迹分析使用标准GROMACS工具；氢键标准设为供体-受体距离0.35 nm和角度30°。
食物垃圾来源与表征、发酵条件及分析方法。 本研究的分析方法聚焦于氢气、挥发性脂肪酸（VFA）积累和木质素修饰。虽然底物转化由化学计量产率和代谢物谱间接体现，但由于未经处理的不均质食物垃圾基质的分析复杂性，未进行残余还原糖或挥发性固体（VS）去除的直接定量。未经处理的食物垃圾收集自山东理工大学中央食堂（中国淄博），连续五天汇集以确保组成均一性。汇集物料在高转速搅拌机中均质化至粒径< 5 mm，分装为200 g等份，−20 °C保存备用。发酵前未施加任何化学（酸/碱）、酶或热处理（如高压灭菌、蒸汽爆破）。干物质生化组成按标准实验室分析程序（LAP）测定。初步表征研究中，废弃物含10.1 ± 0.3%葡聚糖、7.4 ± 0.2%木聚糖、0.5 ± 0.1%阿拉伯聚糖和6.8 ± 0.2%木质素；未检测到甘露聚糖。底物含18.4 ± 0.4%总固体（TS）和75.3 ± 1.1%挥发性固体（VS）（鲜重基），总有机碳（TOC）含量为干重的42.7 ± 0.9%。暗发酵实验在250 mL血清瓶中进行，工作体积100 mL。基础培养基含（每L）：NH₄Cl 1.0 g、K₂HPO₄ 1.5 g、KH₂PO₄ 0.5 g、MgCl₂·6H₂O 0.2 g、FeCl₃ 0.05 g、CaCl₂ 0.05 g、NaHCO₃ 4.0 g和1 mL微量元素溶液。
研究结果
B. subtilis T7的木质素降解与水解活性。 B. subtilis T7在固体和液体培养体系中均表现出木质素修饰活性。在补充碱木质素或Azure B的最低盐琼脂平板上，37 °C培养96 h内菌落周围形成明显脱色圈，表明分泌能够降解复杂芳香聚合物的胞外酶。在7天液体培养中，该菌株对碱木质素实现63.4 ± 3.2%脱色率（280 nm处测定），对Azure B实现56.5 ± 2.9%脱色率（663 nm处测定）。细菌生长未受影响，第7天620 nm处光密度达1.45 ± 0.12（补充图S1）。培养上清液的高效液相色谱（HPLC）分析显示芳香族单体的瞬时积累。阿魏酸在第3天达到峰值浓度0.85 ± 0.07 mg/L，同期香草醛最大浓度为0.67 ± 0.05 mg/L。对香豆酸在0.32 ± 0.04 mg/L处达峰，至第6天基本耗尽，与后续利用一致。
固体培养基平板实验证明了强大的水解活性。在刚果红染色的羧甲基纤维素（CMC）琼脂上，T7产生24.5 ± 1.2 mm的水解圈，表明内切葡聚糖酶活性。在木聚糖和淀粉-碘平板上分别观察到11.6 ± 0.8 mm和14.2 ± 1.0 mm的水解圈，确证木聚糖酶和淀粉酶活性。蛋白水解活性在脱脂牛奶琼脂上产生23.3 ± 1.5 mm的水解圈（补充图S3）。这些表型数据与基因组中存在的氧化性CAZymes（AA10、AA3）和多种糖苷水解酶一致。
不同底物的生物产氢。 在分批暗发酵实验中，B. subtilis T7在纯培养条件下无需互养伙伴即可直接从多种碳源产氢。最高体积产率以木糖获得（274 ± 15 mL H₂/g VS，相当于0.92 ± 0.05 mol H₂/mol底物）。修正Gompertz模型给出最大产氢速率（Rmax）为45.2 ± 3.1 mL/h，迟滞期12.4 ± 1.2 h。未经处理的食物垃圾获得最高摩尔氢产量1.41 ± 0.08 mol H₂/mol底物（210 ± 14 mL H₂/g VS）。葡萄糖、淀粉和CMC的产率范围为1.02至1.25 mol H₂/mol底物。乙酸和丁酸是主要挥发性脂肪酸，未检测到甲烷（表1）。运行结束时的VFA谱确证所有底物条件下均呈现混合乙酸/丁酸发酵途径。乙酸和丁酸是主要代谢物，浓度分别为1.3–2.6 g/L和0.56–1.6 g/L（表1）。丙酸——一种常与低氢产率相关的电子汇——在所有反应器中均低于HPLC检测限（<0.05 g/L）。摩尔乙酸与丁酸比（A:B）随底物变化，范围从1.31（食物垃圾）到2.32（CMC）。虽然根据乙酸途径（4 mol H₂/mol己糖）与丁酸途径（2 mol H₂/mol己糖）的化学计量学，较高的A:B比通常有利于每摩尔底物产生更多氢气，但食物垃圾的复杂组成可能影响这一趋势，在较低A:B比下仍获得最高摩尔氢产量（1.41 mol/mol）。
关键CAZymes的分子对接分析。 针对GH9内切葡聚糖酶和Abhydrolase_1整个溶剂暴露表面的盲对接，在未对结合位置施加任何先验约束的情况下，识别出多个能量上有利的碳水化合物配体结合口袋。最高产的对接构象一致聚集在表面可及的沟槽区域内，其拓扑结构与持续性多糖降解酶的底物结合通道一致。对GH9而言，优势构象收敛于横跨酶表面的一个大型催化裂隙——这是内切葡聚糖酶容纳延伸多糖链的典型几何特征。Abhydrolase_1同样将其最高评分构象定向于一个极性的、边界清晰的表面口袋中，该口袋衬有氢键供体和受体。两种情况下，盲对接识别的结合位点与PrankWeb预测的顶级口袋高度吻合，验证了无偏方法的可靠性，并为后续位点特异性分析提供了结构依据。碳水化合物配体沿这些沟槽区域一致地采用延伸构象，最大化与侧翼残基的接触表面——这种结合模式在结构上类似于已表征多糖水解酶的底物接合几何。在所有测试的12种酶-配体组合中，Abhydrolase_1对木四糖表现出最高结合亲和力（−7.7 kcal/mol），而GH9对纤维四糖表现出最强偏好（−7.0 kcal/mol），表明分别对半纤维素和纤维素来源寡糖的底物特异性（表2）。纤维五糖仅作为额外配体用于T7 GH9与已发表Bacillus GH9内切葡聚糖酶的菌株间比较（补充表S2）；本节所述12种酶-配体组合及后续分子动力学运行均使用纤维四糖。模板序列同一性取自补充表S1，指为每种酶选择的SWISS-MODEL模板。所有值均远高于通常认为可靠同源建模最低要求的30%阈值，支持将这些模型用于本文报道的对接和动力学计算。
木四糖与Abhydrolase_1的位点特异性分子对接。 将木四糖对接到PrankWeb预测的Abhydrolase_1顶级腔中，显示配体在明确界定的结合沟槽内得到良好容纳（图2和图3，表3）。二维相互作用分析鉴定出与Gly32、Phe33、Thr34、Ser36和His256残基形成的六个常规氢键，构成复合物内的主要稳定力。与Ser39、Arg179和Ile180的额外碳-氢键接触为木四糖在催化口袋内提供了补充锚定。三维可视化确认配体占据中心结合腔，与酶具有广泛的表面互补性，采取的取向与生产性底物接合一致。−7.7 kcal/mol的结合亲和力——在所有筛选的酶-配体对中最高——反映了木四糖与Abhydrolase_1活性位点之间强烈的几何和电子兼容性。
纤维四糖与GH9的位点特异性分子对接。 纤维四糖对GH9活性位点的位点特异性对接显示四糖有利地插入酶的延伸催化沟槽。相互作用谱包含七个常规氢键，关键接触位于Tyr141、Trp145、Tyr255、Tyr354、Arg254和Asp194。与Trp193的额外π-σ相互作用进一步贡献非共价稳定。三维建模显示纤维四糖采取跨越整个底物结合通道的延伸构象，同时与催化和底物识别残基相互作用。这种结合几何是容纳多个葡萄糖基单元并切割内部糖苷键的内切葡聚糖酶的特征，与B. subtilis T7中GH9的纤维素分解作用一致。−7.0 kcal/mol的结合亲和力以及所识别极性接触的广度，支持该酶对纤维素来源寡糖的有效识别。选择用于分子动力学模拟的两种酶（GH9内切葡聚糖酶和Abhydrolase_1）的AlphaFold一级结构及关键相互作用残基如补充图S7所示。
讨论与解读
分子对接与分子动力学结果共同为B. subtilis T7的木质纤维素分解潜力提供了连贯的原子级叙事。盲对接扫描确认GH9和Abhydrolase_1均拥有广泛的表面可及寡糖结合景观，有利构象一致收敛于与PrankWeb预测活性位点拓扑吻合的沟槽状腔中。两种独立计算方法的一致性增强了所识别结合区域的可靠性，并验证了无偏盲对接方法作为表征注释不良酶中CAZyme-底物相互作用有效起点的价值。对接数据中出现的底物偏好具有化学一致性：Abhydrolase_1作为筛选中最高亲和力结合蛋白（木四糖−7.7 kcal/mol），通过六个氢键网络识别戊糖骨架配体，口袋几何与残基组成强烈提示其作用于半纤维素底物——很可能是木质纤维素解构早期释放的木聚糖来源寡聚物。GH9则对纤维四糖表现出最高亲和力（−7.0 kcal/mol），通过跨越催化残基（Asp194）和底物识别元件的七个氢键接合配体。100 ns分子动力学模拟证实两种蛋白均保持整体结构完整性，配体动力学特征与内切葡聚糖酶的持续性底物转运机制一致。这些计算发现与该菌株实验观察到的24.5 mm纤维素酶水解圈、11.6 mm木聚糖酶水解圈及63.4%碱木质素脱色率等表型数据高度吻合。
编译者解读。 本研究展示了计算生物学在合成生物学菌株开发中的前置筛选价值——通过低成本、高精度的结构模拟，在湿实验前即可锁定关键酶-底物识别机制。将盲对接与位点特异性对接联用、再以多副本分子动力学验证的策略，为缺乏晶体结构的CAZymes提供了可靠的功能预测范式。值得注意的是，计算预测的底物偏好（Abhydrolase_1偏向半纤维素、GH9偏向纤维素）与该菌株实际水解圈数据定量吻合，形成了干湿实验闭环验证。局限在于：计算模型未纳入木质素-多糖复合体的空间位阻效应，且未对酶-底物诱导契合的动态过程进行增强采样模拟。未来若能将此类计算筛选与定向进化相结合，有望进一步释放该菌株在整合生物加工中的产氢潜力。
参考来源
Shah TA, Sheikh A, Ibrahim HIM, Khalifa A, Ameen A. In Silico Insights into Carbohydrate-Active Enzymes (CAZymes) of Bacillus subtilis T7: Lignin and Polysaccharide Degradation Mechanisms. Int J Mol Sci. PMCID: PMC13466493.
PMCID: PMC13466493