来源：Appl Microbiol Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导读
纤维素生物加工通常需要额外添加昂贵的酶制剂。本研究将来自解纤维素醋弧菌的外切纤维素酶CelK和内切纤维素酶CelA导入恶臭假单胞菌，通过Sec或Tat分泌信号肽实现功能性胞外分泌。实验证实，分泌的纤维素酶可水解羧甲基纤维素及多种荧光/显色底物，且当菌株同时表达胞内β-葡萄糖苷酶时，能够以纤维三糖或纤维四糖为唯一碳源生长。该工作为假单胞菌的整合生物加工能力提供了新证据。
研究背景
工业化微生物发酵依赖低成本且成分波动的原料，如木质纤维素作物残渣。这类大分子底物需要预处理释放可发酵单体，或由分泌胞外酶的微生物执行整合生物加工——在同一菌株内完成高分子量底物的胞外解聚与单体的产物转化。然而，多数精密发酵所用细菌和酵母不天然分泌纤维素酶，且难以耐受木质纤维素粗提物中的抑制物。恶臭假单胞菌因对木质素来源芳香族化合物和有机酸具有高耐受性，成为整合生物加工的候选底盘。但针对该菌及其他革兰氏阴性菌的胞外酶分泌工具仍然有限。本研究旨在通过工程化手段使恶臭假单胞菌分泌纤维素酶，并评估其在聚合或寡聚纤维素底物上的生长能力。
研究方法
化学试剂、菌株与培养基
刚果红购自Merck（货号C6277），纤维三糖购自Neogen（产品代码O-CTR-50MG），Avicel PH-101购自Merck（货号11365），3-甲基苯甲酸购自Merck（货号8.21902）。M9培养基终浓度组成：磷酸氢二钠47 mM、磷酸二氢钾22 mM、氯化钠0.5 g/L、氯化铵1 g/L、硫酸镁2 mM。所有培养均添加1× Studier痕量金属（Studier 2005），该混合物提供常规M9培养基中所需的氯化钙及其他M9缺乏的元素。
遗传设计
遗传构建体详见表1及在线资源1（支持数据S1）。简要而言，使用SignalP 6.0（Teufel et al. 2022）预测来自解纤维素醋弧菌的CelA内切纤维素酶（GenBank ID: WP_003512420.1）和CelK外切纤维素酶（GenBank ID: WP_011837826.1）的天然分泌信号肽（Tozakidis et al. 2016）。天然信号肽被替换为与文献报道的恶臭假单胞菌胞外蛋白相关的Sec或Tat信号肽的框内融合（表1）。CelA和CelK构建体排列为一个操纵子，每个基因的恶臭假单胞菌密码子优化和翻译起始速率（TIR）使用DeNovo DNA的Operon Calculator设计（Farasat et al. 2014）（http://www.denovodna.com）。设计由Twist Bioscience合成，克隆至pSEVA231（Martínez-García et al. 2023）表达载体，受XylS/Pm（Gawin et al. 2017）诱导型启动子控制。
为构建P. putida KT2440_PEM7-cbh菌株（组成型胞内β-葡萄糖苷酶表达），使用已发表（Dvořák and de Lorenzo 2018）的遗传设计——由热 bifida 融合杆菌的bglC基因（cbh；GenBank登录号WP_011291384.1）编码纤维二糖水解，受组成型PEM7启动子控制。PEM7-cbh构建体合成为线性片段（Integrated DNA Technologies），使用Gibson等温组装（Gibson et al. 2009）的一般原则克隆至pBAMD1-6 mini-Tn5转座子递送质粒（Martínez-García et al. 2014）。转化后的恶臭假单胞菌在terrific broth中经延长恢复培养（7 h，30 °C，180 rpm振荡）。回收的总细胞群体经洗涤后重悬于100 mL补充5 g纤维二糖/L、30 mg庆大霉素/L和Studier痕量金属的M9培养基中，孵育4天（30 °C，180 rpm振荡），然后涂布于补充5 g纤维二糖/L、30 mg庆大霉素/L和Studier痕量金属的M9琼脂。基因整合通过菌落PCR和Sanger测序确认。比较5个独立克隆以葡萄糖或纤维二糖为唯一碳源的生长性能。各转化克隆在含葡萄糖（5 g/L）或纤维二糖（5 g/L）的M9基础培养基中预培养，30 °C、180 rpm标准轨道摇床振荡。未转化P. putida KT2440作为对照。起始培养物以1:100稀释接种至200 µL含葡萄糖（5 g/L，黑线）或纤维二糖（5 g/L，蓝线）的M9基础培养基中，使用标准96孔微量滴定板覆盖breathe-easy膜（Merck货号Z380059），每个克隆n = 4技术重复培养，30 °C、900 rpm振荡培养，每十分钟监测600 nm吸光度。所有培养含庆大霉素（30 mg/L），未转化P. putida KT2440除外。选择以纤维二糖为唯一碳源生长性能最佳的克隆8（支持图S6），作为后续纤维素酶分泌质粒转化的单一P. putida KT2440_PEM7-cbh菌株。
纤维素酶分泌质粒（pSEC_cellulase和pTAT_cellulase）用于转化P. putida KT2440_PEM7-cbh、P. putida KT2440或P. putida S12。质粒以卡那霉素（50 mg/L）维持筛选。阴性对照菌株通过转化pSEVA231载体制备。所有实验每个菌株设三个生物学重复，生物学重复定义为质粒转化步骤中独立菌落。
固体培养基上羧甲基纤维素水解
菌株在含50 μg卡那霉素/mL的LB培养基中过夜预培养（30 °C振荡）（P. putida KT2440_cbh背景菌株另加30 μg庆大霉素/mL）。过夜培养物用无添加M9培养基洗涤并稀释至OD600 nm = 0.3。各取5 μL培养物点样于补充抗生素、Studier痕量金属、酵母提取物（0.05% w/v）、羧甲基纤维素（CMC：0.5% w/v）和3-甲基苯甲酸酯（1 mM）的M9琼脂上。琼脂板于30 °C孵育64 h。CMC水解通过刚果红染色观察（Teather and Wood 1982）（5 mL刚果红1 mg/mL孵育15 min，随后5 mL氯化钠1 M洗涤15 min）。
纤维素酶酶活测定
测定预培养：菌株在补充0.2%（w/v）酪蛋白氨基酸和50 μg卡那霉素/mL（P. putida KT2440_cbh背景菌株另加30 μg庆大霉素/mL）的M9培养基中过夜预培养（30 °C，180 rpm）。过夜培养物稀释至OD600 nm = 0.05，置于1 mL补充0.2%（w/v）酪蛋白氨基酸的M9培养基中。3 h后，加入1 mM 3-甲基苯甲酸诱导纤维素酶表达，再孵育过夜（16 h，30 °C，180 rpm）。细胞经离心沉淀（3900 rpm，5 min），取培养上清液测定纤维素酶存在情况（详见下文）。
4-羟基苯甲酸肼（PAHBAH）测定：还原糖末端检测的4-羟基苯甲酸肼（PAHBAH）测定法（Lever 1972）改编自已发表方法（Garvey et al. 2014）。羧甲基纤维素加入培养上清液至终浓度1%（w/v），50 °C振荡孵育4 h。每小时取样，立即与PAHBAH工作试剂混合，95 °C孵育10 min后置冰上5 min。样品体积30 μL与200 μL含36 mM PAHBAH的工作试剂混合。孵育后，在ThermoFisher Varioskan多功能酶标仪上测量405 nm吸光度。
4-甲基伞形酮基-β-D-纤维二糖苷（4-MU cellobioside）测定：4-甲基伞形酮基-β-D-纤维二糖苷（4-MUC）加入培养上清液样品至终浓度1.25 mM，50 °C孵育3 h。加入100 μL 0.1 M碳酸钠终止反应，水稀释10倍后测量荧光（λex = 360 nm，λem = 460 nm），使用ThermoFisher Varioskan多功能酶标仪。
4-硝基苯基β-D-纤维二糖苷（p-NP cellobioside）测定：4-硝基苯基β-D-纤维二糖苷（p-NP cellobioside）加入培养上清液样品至终浓度0.5 mM，45 °C孵育2 h。2 h后在ThermoFisher Varioskan多功能酶标仪上测量405 nm吸光度。
纤维素酶的蛋白质组学鉴定
基于靶向质谱的蛋白质组学分析用于定性鉴定恶臭假单胞菌培养上清液和细胞沉淀中内切纤维素酶（CelA）和外切纤维素酶（CelK）的异源表达。在LB培养基中培养的菌株于指数生长后期收获，上清液和细胞沉淀部分通过离心分离（4,500 g，15 min，4 °C）。上清液使用10 kDa截留分子量过滤器（Vivaspin 20货号28-9322-60）浓缩20倍。细胞沉淀或浓缩液（原文此处截断，后续处理未详述）。
研究结果
恶臭假单胞菌中纤维素酶分泌的设计
从已发表文献中鉴定出两个Tat信号肽和两个Sec信号肽与胞外蛋白相关。一个已表征的胞外磷酸酶UxpB（Putker et al. 2013）通过Tat途径分泌，而最丰富的胞外蛋白——外膜孔蛋白OprF（Choi et al. 2014）通过Sec途径分泌。另外两个胞外蛋白（一个具有Sec分泌信号，GenBank位点WP_010955666.1；一个具有Tat信号，GenBank位点WP_010953415.1）从恶臭假单胞菌外膜囊泡蛋白质组学研究中鉴定（Salvachúa et al. 2020）（在线资源1，支持表S1）。
选择来自解纤维素醋弧菌（革兰氏阳性菌，原名Clostridium thermocellum）（Tindall 2019）的CelA内切纤维素酶和CelK外切纤维素酶作为模型纤维素酶。这些酶虽为热稳定酶，但在30 °C下与已知中温原核纤维素酶活性相当（Mingardon et al. 2011），而后者中已被表征的很少。解纤维素醋弧菌的纤维素发酵（Shao et al. 2020）及其纤维小体复合物测定（Zhang and Lynd 2003）通常在中性或接近中性pH下进行，表明与恶臭假单胞菌培养条件（初始培养基pH 7.0）兼容。鉴定了解纤维素醋弧菌CelA和CelK纤维素酶的天然Sec途径分泌信号肽序列，替换为恶臭假单胞菌的Sec或Tat途径信号肽，并在XylS/Pm诱导型启动子系统控制下从双顺反子表达质粒表达（Gawin et al. 2017）（质粒pSEC_cellulase和pTAT_cellulase；在线资源1，支持图S1）。
表达构建体为每个纤维素酶基因设计了低翻译起始速率（TIR；De Novo DNA Operon Calculator，http://www.denovodna.com），CelK外切纤维素酶TIR约为10,000单位，CelA内切纤维素酶约为1000单位，依据是从纤维素聚合物高效释放葡萄糖需要的外切纤维素酶活性单位多于内切纤维素酶（Setter-Lamed et al. 2017）。
恶臭假单胞菌分泌活性纤维素酶
通过将转化菌株涂布于补充羧甲基纤维素（CMC；一种不可发酵的水溶性纤维素衍生物）和3-羟基苯甲酸（3-HB；XylS/Pm启动子系统诱导剂）的M9琼脂上，在固体培养基上观察到胞外纤维素酶活性。琼脂板随后用刚果红染色，刚果红与完整的β-(1–4)-吡喃葡萄糖苷强烈相互作用（Wood 1980）。携带pTAT_cellulase和pSEC_cellulase质粒的P. putida KT2440观察到淡橙色透明圈，表明CMC水解，而携带阴性对照pSEVA231质粒的菌株未观察到（图2）。当P. putida S12菌株用相同质粒转化时，该观察结果一致（在线资源1，支持图S2）。
通过靶向蛋白质组学确认了pSEC_cellulase和pTAT_cellulase培养物上清液中CelK和CelA纤维素酶的存在，其中CelK和CelA纤维素酶通过各纤维素酶独特的肽段鉴定，该肽段在携带pSEVA231质粒的阴性对照菌株中未观察到。CelK纤维素酶也在胞内组分中定性鉴定到，而胞内CelA未检测到（在线资源1，支持表S2）。
使用一组探针底物评估液体培养上清液中功能性纤维素酶的存在。CMC水解通过寡糖还原端与对羟基苯甲酸肼反应检测（Lever 1972）（PAHBAH；图3A）。培养上清液中的纤维素酶活性也用4-甲基伞形酮基β-D-纤维二糖苷（Chernoglazov et al. 1989）（4-MU cellobioside；图3B）和对硝基苯基β-D-纤维二糖苷（Deshpande et al. 1984）（p-NP cellobioside；图3C）测定，两者分别在纤维二糖基团与报告分子之间的糖苷键水解后产生荧光甲基伞形酮和有色对硝基苯酚产物。携带设计用于纤维素酶分泌质粒的菌株对三种底物均催化显著水解，且每次pTAT_cellulase培养物上清液的水解速率更高。这些观察在P. putida S12菌株中重复时结果一致（在线资源1，支持图S3）。
进一步设计质粒以独立研究两个已鉴定TAT分泌信号肽的功能以及低TIR对CelA内切纤维素酶的影响（表1）。CelK外切纤维素酶使用与pTAT_cellulase质粒中相同的信号肽（UxpB）和TIR表达。CelA内切纤维素酶以PP_2478或UxpB信号肽以及两种不同TIR（约1000和约10,000）表达。所有CelA内切纤维素酶变体产生的CMC透明圈与pTAT_cellulase菌株观察到的相似（在线资源1，支持图S4）。CelK外切纤维素酶单独表达时观察到较淡的透明圈。
表1 本研究所用纤维素酶分泌质粒的关键特征
| 质粒名称 | CelK外切纤维素酶 | CelA内切纤维素酶 |
|---|---|---|
| pSEVA231 | - | - |
| pTAT_cellulase | UxpB（PP_1043）信号肽，TIR 13356 | PP_2478信号肽，TIR 1346 |
| pSEC_cellulase | OprF（PP_2089）信号肽，TIR 10504 | PP_5130信号肽，TIR 1057 |
| pUxpB-CelK_10k | UxpB（PP_1043）信号肽，TIR 13356 | - |
| p2478-CelA_1k | - | PP_2478信号肽，TIR 1346 |
| pUxpB-CelA_1k | - | UxpB（PP_1043）信号肽，TIR 1035 |
| p2478-CelA_10k | - | PP_2478信号肽，TIR 10172 |
| pUxpB-CelA_10k | - | UxpB（PP_1043）信号肽，TIR 9018 |
CelA内切纤维素酶无论使用PP_2478还是UxpB分泌信号肽均表现出CMC水解（支持图S5），且当CelA内切纤维素酶TIR从约1000增加到约10,000单位时，CMC水解大约翻倍。只有CelK外切纤维素酶催化4-MU cellobioside和p-NP cellobioside的水解（支持图S5）。
恶臭假单胞菌在纤维素寡聚体上的生长
基于已发表设计（Dvořák and de Lorenzo 2018）（支持方法S1和支持图S6）制备了组成型表达胞内β-葡萄糖苷酶以代谢纤维二糖的P. putida KT2440_PEM7-cbh菌株。pSEC_cellulase和pTAT_cellulase质粒分别用于转化P. putida KT2440_PEM7-cbh，评估在葡萄糖和纤维三糖上的生长能力。微生物生长实验（原文此处截断）。
讨论与解读
本研究证实了工程化恶臭假单胞菌能够分泌纤维素酶，且胞外纤维素酶活性足以支持以寡聚纤维素底物（纤维三糖或纤维四糖）为唯一碳源和能源的生长——尽管相对于葡萄糖生长存在显著适应性代价。这是恶臭假单胞菌碳源利用工程化的新进展，扩展了此前该菌株被改造用于木糖、纤维二糖、蔗糖和阿拉伯糖胞内代谢的工作。仅在纤维素酶以pTAT_cellulase质粒编码的信号肽分泌并与胞内β-葡萄糖苷酶共表达时，才观察到纤维素寡聚体上有意义的生长。纤维三糖上的生长缓慢，最大比生长速率低于葡萄糖生长的10%。延滞期延长约四天，在纤维四糖上生长时进一步增加28%。当纤维素酶分泌菌株在葡萄糖上生长时，指数生长速率和总生物量积累未显著受损，表明在纤维素寡聚体上观察到的低生长速率和降低的生物量滴度可能归因于胞外纤维素酶活性不足。
编译者解读
该研究在假单胞菌底物谱拓展方面迈出了务实一步——选择双组分纤维素酶（内切+外切）搭配Tat分泌信号肽的策略，兼顾了酶蛋白正确折叠与跨膜转运的平衡。TIR差异化设计（外切酶高、内切酶低）体现了对纤维素降解机制的理解。局限也很明显：寡聚体上生长速率不足葡萄糖的10%，延滞期长达数天，胞外酶活仍不足以支撑高效解聚。从合成生物学应用看，后续可尝试酶组合的定向进化、多拷贝分泌盒整合或共培养策略来提升水解通量。该工作为假单胞菌底盘在纤维素整合生物加工中的可行性提供了实证基础。
参考来源
Smith MR, Moffitt K, Holdsworth W, Luna-Flores CH, Goyal M. Cellulase secretion by engineered Pseudomonas putida enables growth on cellulose oligomers. Appl Microbiol Biotechnol. PMID: 41291027. DOI: 10.1007/s00253-025-13617-9.
PMID: 41291027