单拷贝光遗传表达系统：链霉菌光控蛋白过表达的新工具

📅 2026-08-14 📰 Sci Rep 2025 Dec 15 📂 研究进展 👁 18

来源：Sci Rep | 编译：DNA Lab Space

导读

链霉菌是重要的工业微生物，但其光诱导表达系统长期受限于宿主范围窄、质粒不稳定等问题。本研究开发了两种基因组整合型光诱导表达系统（iLiEX-p和iLiEX-i），利用光敏调控因子LitR与T7 RNA聚合酶转录放大模块的组合，在多种链霉菌中实现了光控的高水平蛋白表达。其中iLiEX-i系统在灰色链霉菌中GUS酶活达到组成型强启动子ermE*的39倍，并在5种链霉菌模式菌株中验证了功能，为链霉菌的合成生物学研究提供了新工具。

研究背景

链霉菌是革兰氏阳性土壤细菌，具有分解植物残体的腐生能力，在土壤生态系统的养分循环中扮演关键角色。链霉菌展现出两个显著特征：一是类似真菌的复杂形态分化，二是产生大量具有生物活性的次级代谢产物，包括抗生素、抗癌药物和免疫抑制剂。此外，链霉菌还产生多种工业酶，如木聚糖酶、内切葡聚糖酶、转谷氨酰胺酶、蛋白酶和磷脂酶D。

遗传操作方法是链霉菌研究的重要手段。目前使用的DNA载体包括自复制高拷贝质粒和染色体整合型载体两大类。研究者前期开发了基于LitR光敏调控因子的质粒型光诱导表达系统pLiEX，该系统中光敏调控因子LitR接受蓝绿光刺激后激活litS启动子，含σLitS的RNA聚合酶全酶识别crtE启动子，从而启动目标基因的光控表达。但该系统存在三大局限：宿主范围窄（不适用于天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌等模式菌株）、插入DNA大小受限（最大约8 kbp）、无抗生素选择压力下质粒丢失频率高（五次传代后质粒丢失率达98%）。

为解决上述问题，本研究开发了两种改进型光诱导表达系统：iLiEX-p（光传感器和转录放大模块整合入基因组，目标基因位于高拷贝质粒上）和iLiEX-i（所有模块全部整合入基因组）。

研究方法

菌株、质粒、化学品与培养基

灰色链霉菌NBRC 13350（曾用名IFO 13350）、链霉菌属NBRC 13304（原灰色链霉菌）、阿维链霉菌MA-4680（NBRC 14893）和变铅青链霉菌66（NBRC 15675）购自大阪发酵研究所（日本大阪）和NITE生物资源中心（日本千叶）。天蓝色链霉菌A3(2) M145、变铅青链霉菌TK24和白色链霉菌J1074购自John Innes Center。大肠杆菌K-12菌株HST08（Takara Bio Inc.，日本滋贺）用于常规克隆实验，携带pUB307-aphA::Tn7/pTH18cr-539的HST04（Takara Bio）用作大肠杆菌与链霉菌属间接合转移的辅助菌株。

pIJ702（携带硫链丝菌素抗性基因tsr的链霉菌自复制高拷贝质粒）用于构建iLiEX-p系统。pLit19、pLit19-XylE和pLit19-GUS用作单质粒pLiEX系统。pTYM19（由H. Onaka提供）用于构建大肠杆菌–链霉菌穿梭载体。卡那霉素抗性大肠杆菌质粒pK18mobsacB用作构建int载体的底盘载体。pKU463和pKU464（由H. Ikeda提供）用作φK38-1和φBT1整合酶的PCR模板。

链霉菌培养基配方如下：YMP/糖培养基（每升含：2 g酵母提取物、2 g肉提取物、4 g Bacto蛋白胨[Becton, Dickinson and Co.，Sparks, MD]、5 g NaCl、2 g MgSO4·7H2O、10 g葡萄糖或麦芽糖[Kokusan，东京，日本]，pH 7.2）；Bennett's/糖培养基（每升含：1 g酵母提取物[Becton, Dickinson and Co.]、1 g鱼提取物[Kyokuto，东京，日本]、2 g NZ胺[FUJIFILM Wako Pure Chemical corp.，大阪，日本]、10 g葡萄糖或麦芽糖[Kokusan]，pH 7.2）。配制固体培养基时向各混合物中加入1.5%琼脂（Kokusan）。

抗生素使用浓度如下：大肠杆菌——氨苄青霉素（Wako）和卡那霉素（Wako）均为50 μg/mL，氯霉素20 μg/mL，四环素10 μg/mL，大观霉素（Wako）60 μg/mL；链霉菌——硫链丝菌素（Santa Cruz Biotechnology，DAL，美国）20 μg/mL，卡那霉素20 μg/mL。

培养期间的光照方法

培养箱配备蓝色LED光照单元（TH2-300X300BL；CCS Inc.，京都，日本；λmax = 450 nm），用于振荡液体培养和固体培养。光强度以光合光子通量密度（PPFD）表示，使用LI-250光照计（LI-COR Inc.，Lincoln, NE，美国）测量。

人工合成DNA片段

以下GOI或启动子-GOI盒按照天蓝色链霉菌A3(2)密码子使用频率优化设计，由Twist Bioscience（SF，美国）人工合成：T7噬菌体T7RNAP、T7启动子-MCS-T7终止子（T7p-MCS）、PhrdB-lysS、PhrdB-lysY、aeBlue和mScarlet-I。sfGFP根据前期研究基于委内瑞拉链霉菌ATCC 10712进行密码子优化后合成。DNA核苷酸序列列于补充表S1。

标准DNA操作

大肠杆菌和链霉菌属的DNA操作分别按照Sambrook等人和Kieser等人的方案进行。用于载体构建和克隆实验的合成寡核苷酸（补充表S2）购自Eurofins Genomics K.K.（东京，日本）。所有酶购自Takara Bio和New England BioLabs（NEB，Ipswich, MA，美国）。常规PCR使用PrimeSTAR GXL Premix、PrimeSTAR Max Premix、Q5 High-Fidelity 2X Master Mix或Ex Premier DNA Polymerase进行。质粒和PCR扩增子DNA使用QIAprep Spin Miniprep Kit和QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen GmbH，Hilden，德国）纯化。所有实验均按照制造商说明进行。DNA测序由Eurofins Genomics完成。

高拷贝质粒和整合载体转化链霉菌菌株的方法

将基于pIJ702的高拷贝质粒导入灰色链霉菌NBRC 13350、天蓝色链霉菌A3(2)和变铅青链霉菌，采用原生质体-PEG方法，筛选硫链丝菌素抗性转化子。整合载体导入接合辅助菌株大肠杆菌HST04/pUB307-aphA::Tn7/pTH18cr-539（用于灰色链霉菌型甲基化）或大肠杆菌HST04/pUB307-aphA::Tn7（用于白色链霉菌J1074、链霉菌属NBRC 13304、阿维链霉菌、变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌A3(2)）。携带整合载体的大肠杆菌辅助菌株与链霉菌菌株之间的属间接合转移按前述方法进行。

基因组整合骨架载体的构建

构建卡那霉素抗性载体pNU463和pNU464（分别保留φK38-1整合酶和φBT1整合酶的基因组整合载体）：以pKU463和pKU464（均由H. Ikeda提供）为模板，使用引物对P01/P02扩增φK38-1 int、P03/P04扩增φBT1 int。将所得扩增子通过In-Fusion克隆法（Takara Bio）导入pK18mob的BstBI位点，获得质粒pNU463和pNU464。

pTYM19（由H. Onaka提供）是硫链丝菌素抗性基因组整合载体，在φC31整合酶基因上下游含有两个NdeI位点。为去除NdeI位点，将pTYM19vio（由H. Onaka提供）用BamHI消化，线性化载体自连获得pTYM19Δ。

构建pTYM19Δ-T7p-MCS：使用引物对P05/P06通过PCR扩增T7启动子-MCS-T7终止子盒，插入pTYM19Δ的EcoRI和HindIII位点，获得pTYM19Δ-T7p-MCS。

基因组整合booster载体的构建

构建booster int载体：使用引物对P07/P08（以pLit19为模板）扩增litR-litS-crtEp操纵子，P09/P10（以合成的T7RNAP DNA为模板）扩增密码子优化的T7RNAP基因。将这两个扩增子通过In-Fusion插入pNU464和pNU463的KpnI和HindIII位点之间，分别获得pNU464-litRS-T7RNAP和pNU463-litRS-T7RNAP。

构建携带lys的booster载体：将含有PhrdB-lysS或PhrdB-lysY的DNA片段（Twist Biosciences合成，各带短In-Fusion重叠序列）插入pKU464-LitRS-T7RNAP的KpnI位点，获得pKU464-LitRS-T7RNAP-lysS和pKU464-LitRS-T7RNAP-lysY。

基于pIJ702的高拷贝报告质粒的构建

构建基于pIJ702的高拷贝质粒：以合成DNA为模板，使用引物对P11/P12通过PCR扩增T7启动子-MCS-T7终止子盒。将该盒插入pLit19ΔNdeI的KpnI和MfeI位点之间，获得pIJ702-T7p-MCS-T7ter。使用引物对P13/P14扩增xylE、P15/P16扩增gus，用适当限制酶和T4连接酶（Takara Bio）插入pIJ702-T7p-MCS-T7ter的NdeI和HindIII位点之间，分别获得pIJ702-T7p-xylE和pIJ702-T7p-gus。构建的质粒通过原生质体-PEG法导入灰色链霉菌，筛选硫链丝菌素抗性转化子。按前期研究所述方法从转化子中纯化质粒。

报告基因整合载体的构建

使用以下引物对通过PCR扩增GOI，克隆至pTYM19-T7p-MCS的NdeI/BamHI或NdeI/HindIII位点：P17/P18扩增xylE，P19/P20扩增gus，P21/P22扩增灰色链霉菌NBRC 13350的rppA（SGR_6620），P23/P24扩增灰色链霉菌NBRC 13350的LAP（SGR_5809），P25/P26扩增S. pratensis DSM 40990的LAP（Sfla_5137），P27/P28扩增灰色链霉菌NBRC 13350的脯氨酰氨肽酶（SGR_0506），P29/P30扩增变铅青链霉菌66的脯氨酰氨肽酶（SLV_33905），P31/P32扩增S. mobaraensis NBRC 13819的转谷氨酰胺酶（补充表S1），P33/P34扩增小漆酶（原文未详述其余引物对应基因）。

▲ Schematic representation of two iLiEX systems. Two light-inducible expression (iLiEX) systems have been described: (i) a high-copy plasmid-based system, iLiEX-p, and (ii) a single-copy integrative system, iLiEX-i. A common feature of both systems is the genomic integration of a light sensor and a tr

研究结果

基因组整合型光诱导表达系统的开发

前期研究以灰色链霉菌NBRC 13350为宿主开发了质粒型光诱导表达系统pLiEX，该系统通过单质粒设计在弱蓝绿光刺激下大量产生重组蛋白。在该系统中，光刺激由来源于天蓝色链霉菌A3(2)的辅酶B12型MerR家族光感调控因子LitR接收，激活的LitR促进litS启动子的转录，含σLitS的RNA聚合酶全酶引导从crtE启动子的转录，使受crtEp控制的目标基因（GOI）在光照条件下特异性表达。该系统的核心特征是简单的单质粒设计——将外源基因导入pLit19即可实现多种有价值酶的光依赖批量生产。然而pLiEX仅适用于少数链霉菌属菌株，在天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌等模式菌株中不工作。除宿主范围有限外，单质粒型pLit19还存在两个缺点：（i）可插入质粒的DNA大小受限（据调查最大为8 kbp）；（ii）不使用选择性抗生素时转化子中质粒丢失频率高（五次传代后质粒丢失率达98%）。

为拓宽宿主范围，研究开发了两种改进型LiEX变体（图1）：（i）整合型iLiEX-质粒报告系统（iLiEX-p）和（ii）全整合型iLiEX报告系统（iLiEX-i）。在iLiEX-p中，光传感器和转录放大模块整合入基因组，GOI置于基于pIJ101的自复制高拷贝质粒上的T7启动子下游。在iLiEX-i系统中，包括光传感器、转录放大系统和GOI在内的所有模块均插入基因组。两种系统中光感模块均整合入基因组。为弥补高拷贝质粒基因拷贝数减少的影响，研究在转录回路中使用了高放大机制T7 RNA聚合酶（T7RNAP）。

T7RNAP是由883个氨基酸组成的单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，来源于感染大肠杆菌的T7噬菌体。它特异性识别17 bp启动子序列（5′-TAATACGACTCACTATA-3′），转录速率约为多亚基大肠杆菌RNA聚合酶的八倍。由于其高特异性和转录效率，已安全用于大肠杆菌重组蛋白生产系统数十年，近期还用于mRNA疫苗中通过体外转录合成大量编码抗原蛋白的mRNA。

iLiEX-p和iLiEX-i系统高水平产生XylE和GUS

首先分析了基于质粒的iLiEX-p系统功能。在该系统中，光传感器（litR·litS）和转录放大（T7RNAP）模块通过φBT1丝氨酸整合酶活性整合至灰色链霉菌的φBT1染色体附着位点（attBϕBT1）。GOI引入基于pIJ702的高拷贝质粒，受T7启动子控制。使用两种报告酶——恶臭假单胞菌的儿茶酚2,3-双加氧酶（XylE）和按天蓝色链霉菌密码子使用频率优化的大肠杆菌K-12 β-葡萄糖醛酸酶（GUS）——评估系统性能。转化子在蓝光和黑暗条件下培养，使用显色底物测定酶活性。如图2A所示，黑暗条件下酶活性低，蓝光下显著增加。为评估细胞内蛋白水平，将细胞裂解液中的总蛋白经SDS-PAGE分离并用考马斯亮蓝R-250（CBB）染色。如图2B和补充图S2所示，转化子在光照条件下培养时，两种酶在细胞质中含量最高。iLiEX-p系统中XylE的产量与单质粒型pLiEX相似，表明iLiEX-p系统具有与pLiEX中pLit19相近的能力。iLiEX-p系统的负载较低，因为导入该系统中质粒的基因仅为GOI。因此，与pLiEX相比，该系统可用于导入含多个GOI的大DNA片段。

▲ High production of XylE and GUS enzymes using the iLiEX-p system. ( A ) S. griseus transformants harboring the iLiEX-p system with GOIs encoding xylE or gus were cultured with shaking for 48 h under dark (D) or blue light (BL; center wavelength: 450 nm; 3 μmol s −1 m −2 ). Enzymatic activities of Xy

随后构建了iLiEX-i系统，其中所有组分（litR、litS、crtEp和T7RNAP）均插入attBϕBT1位点，T7p-gus插入灰色链霉菌的φC31染色体附着位点（attBϕC31）。如图3及补充图S3和S4所示，该转化子在黑暗中GUS活性低。然而，在蓝光照射下表现出极高的GUS活性，活性水平约为iLiEX-p的50%。将其与非T7RNAP iLiEX-i（litR-litS-crtEp）作为天然光诱导启动子比较，iLiEX-i的活性比非iLiEX系统高922倍。与广泛使用的组成型强启动子ermE启动子（ermEp）比较，iLiEX-i的活性比ermE*p高39倍。在缺乏T7RNAP的情况下，携带T7p-GUS的转化子未检测到GUS活性。这些结果表明，利用该系统可实现单拷贝GOI的极高表达。

▲ High production of GUS with iLiEX-i system. ( A ) Three types of S. griseus transformants were cultured with shaking for 48 h under dark (D) and blue light (BL): (i) harboring the iLiEX-i system, (ii) harboring the iLiEX-i system without T7 RNAP , and (iii) harboring ermE *p as a constitutive strong

iLiEX-i系统在链霉菌模式菌株中的功能性

为验证iLiEX-i系统的广宿主适用性，将携带gus的iLiEX-i系统导入白色链霉菌J1074、链霉菌属NBRC 13304、阿维链霉菌MA-4680、变铅青链霉菌66和天蓝色链霉菌A3(2)。所有测试菌株在蓝光条件下均检测到GUS活性，而黑暗条件下未检测到或仅检测到极低活性（图4）。在部分菌株中，向培养基添加10 μM AdoB12（腺苷钴胺素）可增强光诱导的GUS活性。SDS-PAGE分析确认了各菌株中GUS蛋白条带的存在。这些结果表明iLiEX-i系统可跨越多个链霉菌物种发挥作用，克服了原pLiEX系统宿主范围窄的局限。

▲ Functionality of the iLiEX-i system in Streptomyces model strains. Transformants of S. albus J1074, Streptomyces sp. NBRC 13,304, S. avermitilis MA-4680, S. lividans 66, and S. coelicolor A3(2) harboring the iLiEX-i system with gus were cultured with shaking for 48 h under dark (D) and blue light (B

T7RNAP核糖体结合位点和起始密码子的优化

为提升iLiEX-i系统的表达水平，对T7RNAP的核糖体结合位点（RBS）和起始密码子进行了优化。测试了三种RBS序列（RBS nitA、RBS W52和RBS sav2794）和三种起始密码子（GTG、TTG和ATG）的组合。如图5所示，不同RBS和起始密码子组合对GUS产量有显著影响。其中，使用RBS nitA与GTG起始密码子的组合获得了最高GUS活性，表明T7RNAP的翻译效率是限制该系统产量的关键因素之一。在RBS与起始密码子之间插入NdeI位点（以‘表示）对表达水平也有影响。

▲ Optimization of the ribosome-binding site (RBS) and start codon of T7RNAP . ( A ) Nucleotide sequences of RBSs (RBS nitA , RBS W52 , and RBS sav2794 ) are shown in red along with their neighboring regions. ( B ) iLiEX-i transformants of S. griseus harboring T7RNAP with four types of RBSs and/or thre

通过lys基因抑制泄漏表达

为减少黑暗条件下的泄漏表达，将T7溶菌酶基因（lysS野生型或lysY突变型）引入iLiEX-i系统。T7溶菌酶是T7RNAP的天然抑制剂，可在黑暗条件下抑制因T7RNAP微量泄漏转录导致的背景表达。如图6所示，携带野生型lysS或突变型lysY的转化子在黑暗条件下GUS活性均显著降低，而蓝光诱导的GUS活性未受明显影响。这表明引入T7溶菌酶基因可有效抑制系统的泄漏表达，同时保持光诱导的高水平表达。

▲ lys基因对泄漏表达的抑制。携带野生型lysS或突变型lysY的iLiEX-i转化体与gus在黑暗（D）和蓝光（BL）条件下振荡培养48小时。GUS活性按上述方法测定并标记。数据来自三次独立实验，以平均值±SD表示（n = 3）。

T7启动子的截短

为增强系统的多功能性，对T7启动子进行了截短优化。野生型T7启动子长度为89 bp，包含上游区域、T7RNAP识别位点、间隔区和RBS。截短型T7启动子完全去除上游区域并缩短间隔区。如图7所示，携带截短型T7启动子的转化子在蓝光条件下GUS活性与野生型T7启动子相当，表明上游区域和部分间隔区序列对T7RNAP介导的转录并非必需。截短后的T7启动子长度减少至44 bp，便于合成和克隆操作。

▲ Trimming of T7 promoter. ( A ) A schematic representation of the T7 promoter is shown. The wild-type T7 promoter is 89 bp in length and includes an upstream region, a T7RNAP recognition site, a spacer region, and RBS. In the trimmed T7 promoter, the upstream region has been entirely removed, and the

琼脂平板上基因表达的可视化

为验证iLiEX-i系统在固体培养基上的可视化应用，将编码绿色荧光蛋白sfGFP、红色荧光蛋白mScarlet-I、褐红色素黄素合成酶rppA和蓝色生色蛋白aeBlue的GOI分别导入iLiEX-i系统。转化子在YMP-葡萄糖固体培养基上于黑暗和蓝光条件下培养72小时。如图8A所示，在室内白光照明下（无激发光），蓝光条件下培养的菌落呈现明显的荧光和色素积累，而黑暗条件下无明显表型。进一步在暗室中用激发光照射，从14至22小时每2小时分析sfGFP和mScarlet-I的荧光（图8B）。结果表明iLiEX-i系统可用于琼脂平板上基因表达的可视化检测，无需破坏菌落即可评估表达情况。

▲ Visualizing gene expression on agar plates. ( A ) S. griseus transformants of iLiEX-i harboring GOI encoding sfGFP for green fluorescent protein, or mScarlet-I for red fluorescent protein, rppA for the brownish-red pigment flaviolin, and aeBlue for blue chromogenic protein were cultured on YMP-gluco

分泌酶的高水平生产

为评估iLiEX-i系统在生产分泌酶方面的潜力，将编码11种不同分泌酶的GOI分别导入iLiEX-i系统并在蓝光条件下培养48小时。这些酶包括：GUS（泳道1）、XylE（泳道2）、来自灰色链霉菌的亮氨酸氨肽酶LAP（泳道3）、来自S. pratensis的LAP（泳道4）、来自灰色链霉菌的脯氨酰氨肽酶（泳道5）、来自变铅青链霉菌的脯氨酰氨肽酶（泳道6）、来自S. mobaraensis的转谷氨酰胺酶（泳道7）、来自天蓝色链霉菌A3(2)的小漆酶（泳道8）、来自链霉菌属AGRT-94的小漆酶（泳道9）、来自链霉菌属No. 565的过氧化氢酶-过氧化物酶（泳道10）以及来自链霉菌属AGRT-94的木聚糖酶（泳道11）。SDS-PAGE分析显示，所有11种酶均能在培养上清液（图9A）或胞内总蛋白（图9B）中检测到明显条带。这表明iLiEX-i系统可广泛应用于多种分泌酶的高水平生产。

▲ High-level production of secreted enzymes. ( A ) iLiEX-i transformants of S. griseus harboring GOIs encoding GUS (lane 1), XylE (lane 2), leucine aminopeptidase (LAP) from S. griseus (lane 3) and S. pratensis (lane 4), prolyl aminopeptidase from S. griseus (lane 5) and S. lividans (lane 6), transglu

生长早期LAP的高水平生产

为分析iLiEX-i系统在生长早期的表达动力学，将携带LAP的iLiEX-i转化子在黑暗和蓝光条件下振荡培养，每24小时评估培养上清液中的LAP活性。如图10所示，蓝光条件下LAP活性从24小时起即显著增加，并在96小时内持续积累。SDS-PAGE分析确认了培养上清液中LAP蛋白条带随时间逐渐增强。黑暗条件下未检测到明显LAP活性。这表明iLiEX-i系统可在生长早期即启动高水平的目标蛋白生产。

▲ High production of LAP from the early growth phase. The iLiEX-i transformant of S. griseus harboring LAP was grown in a shaking culture under dark and blue light conditions. The LAP activity in the culture supernatant was evaluated every 24 h using a chromogenic substrate and calculated as the chang

讨论与解读

本研究开发了两种基因组整合型光诱导表达系统，以解决高拷贝质粒pLiEX系统宿主范围窄的问题。其中iLiEX-i系统在多种链霉菌物种中均表现出高水平的有用酶生产能力，成功克服了宿主范围限制。iLiEX系统的所有组件均整合入基因组，理论上不存在基因剂量效应；但通过利用T7RNAP作为转录放大器，原型iLiEX-i的生产力达到了与质粒型系统相当的水平。RBS的添加进一步显著增强了iLiEX-i系统的功能。链霉菌中的丝氨酸型整合载体在无抗生素选择压力下不易从转化子中丢失——在灰色链霉菌中的分析显示，φC31和φBT1整合载体经三次传代后从基因组丢失的频率为0%。此外，通过接合转移导入int载体的转化效率对链霉菌属而言极高。因此，iLiEX-i系统具有环境友好、节省成本和时间、对链霉菌细胞负担小等优势。

研究证实T7RNAP在链霉菌属中作为转录放大装置有效发挥作用。此前仅有两例T7RNAP在链霉菌研究中的应用报道。

编译者解读

本研究的技术亮点在于将T7 RNA聚合酶这一成熟的转录放大模块引入链霉菌光遗传系统，以单拷贝基因组整合实现了超越高拷贝质粒的表达水平——这种"以转录放大弥补拷贝数不足"的策略对放线菌中难以使用质粒系统的菌株具有借鉴意义。922倍于天然光诱导启动子、39倍于组成型强启动子的数据说明该系统具备工业应用潜力。局限在于光诱导需要蓝光照射设备，且LitR依赖辅酶B12，在部分菌株中需外源添加AdoB12。未来若能与发酵工程结合实现大规模光控生产，将进一步提升其实用价值。

参考来源

Watanabe A, Noya R, Yamada R, Takano H. Single copy optogenetic system for Streptomyces. Sci Rep. 2025. PMID: 41398334. DOI: 10.1038/s41598-025-27850-9.

PMID: 41398334

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