粗糙脉孢菌G蛋白信号通路差异调控三类纤维素酶活性的机制解析

📅 2026-08-13 📰 Biotechnol Biofuels Bioprod 2026 Jun 5 📂 研究进展 👁 20

来源：Biotechnol Biofuels Bioprod | 编译：DNA Lab Space

导读

纤维素向葡萄糖的转化是生物燃料生产的关键步骤，而丝状真菌粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）是研究这一过程的模式生物。本研究系统测定了全部G蛋白亚基、RGS蛋白单突变体及Gα多重突变体在纤维素诱导条件下的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶活性，揭示了不同G蛋白信号组分对三类纤维素酶活性的差异化调控——Gα亚基GNA-1与GNA-3共同驱动内切葡聚糖酶活性，而腺苷酸环化酶CR-1对纤维二糖水解酶活性不可或缺。cAMP回补实验进一步表明cAMP水平在这两类酶活性调控中扮演重要角色。

研究背景

异源三聚体G蛋白亚基、腺苷酸环化酶以及RGS（G蛋白信号调节蛋白）是模式丝状真菌粗糙脉孢菌将纤维素转化为葡萄糖所必需的信号组分。转录组学分析已揭示其中多个基因参与特定纤维素酶类（包括内切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶（纤维二糖水解酶）、β-1,4-葡萄糖苷酶、多糖单加氧酶及纤维二糖脱氢酶）的表达调控。然而，这些信号组分如何在酶活性层面差异化调控不同纤维素酶类，仍是未解的问题。

研究方法

菌株与培养条件

所用菌株列于表S1。分生孢子从含Vogel's最低培养基的琼脂瓶中收获，用于接种培养。液体VM培养（25 ml）以2%葡萄糖为碳源，按1×10⁶ 分生孢子/ml接种，在25°C、200 RPM振荡、持续光照条件下生长16小时。培养物用无碳源VM培养基洗涤两次，然后转移至含2% Avicel（纤维素）的VM液体培养基中生长48小时。如实验需要，葡萄糖和Avicel培养基中补充3 mM cAMP（#A6885，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）。无细胞上清液（分泌蛋白组样品）用注射器收集，通过0.45微米滤膜去除细胞。分泌蛋白组样品经浓缩后进行SDS-PAGE分析。细胞垫经真空过滤收集，用水洗涤以去除残留分泌物。总细胞蛋白（生物量蛋白）从细胞垫中用含SDS的缓冲液、加热并搅拌、使用玻璃珠提取。

RNAseq数据层次聚类分析

从前期研究获取野生型、Δgna-1、Δgna-3和Δcr-1突变株在纤维素上生长时27个已注释且表达的纤维素酶基因的每百万转录本数（TPMs）。层次聚类分析采用Euclidean距离作为相似性度量，以完全连接法生成聚类，使用R软件中的pheatmap（V1.0.13）完成。

蛋白质与酶活测定

细胞垫提取物和无细胞上清液中的蛋白质浓度使用Pierce Bicinchoninic acid assay（Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚州奇诺）测定，以牛血清白蛋白作为标准。无细胞分泌蛋白组降解Avicel至葡萄糖的能力采用Avicelase测定法检测。内切葡聚糖酶活性使用底物Azo-CMC-纤维素酶（S-ACMC，#700005041）测定，按制造商（Megazyme/Neogen，美国密歇根州兰辛）推荐方法进行，但所有测定试剂均使用五分之一体积。纤维二糖水解酶测定使用最多90 µl无细胞上清液，加入500 µl反应混合液中，反应混合液含底物对硝基苯酚-β-D-纤维二糖苷（#N5759-100MG，Sigma-Aldrich），溶于0.1 M柠檬酸钠缓冲液（pH 5.0）。反应在37°C孵育20分钟，用625 µl 0.1 M氢氧化钠终止反应，在405 nm处读取吸光度。β-葡萄糖苷酶测定遵循相同方案，但底物为对硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷（#N81090-1.0，Research Products International，美国伊利诺伊州芒特普罗斯佩克特），37°C孵育时间为15分钟。

统计分析

图2、3、4、5、7和8的误差线反映标准误。对技术重复值进行Q检验，基于Z值识别并去除离群值。为鉴定纤维素酶活性或蛋白水平的显著差异，采用成对双尾Welch's t检验，将各突变株的活性数值与野生型或其他突变株进行比较。所有比较的p值见文件S1。

▲ Hierarchical clustering of Transcripts Per Million and DESeq2 data for 27 cellulase genes in the wild type, Δ gna-1 , Δ gna-3 and Δ cr-1 strains during growth on cellulose. The average Transcripts Per Million (TPMs) for cellulase genes obtained from RNAseq data from a previous study [ 9 ] were Log2

图1显示，对27个纤维素酶基因的TPM数据进行层次聚类分析，Δgna-1、Δgna-3和Δcr-1突变株的纤维素酶基因表达模式与野生型存在明显差异。热图中黄色和深绿色分别表示较高和较低的相对表达水平，最大相对水平为1.5（最亮黄色），最小相对水平为−1.5（最深绿色）。右侧表格展示了同一研究中各突变株相对于野生型的DESeq2差异表达倍数变化。

▲ Avicelase activity and secretome and biomass protein levels in G-protein and adenylyl cyclase mutants. Strains were cultured in VM glucose medium for 16 h. Mycelia were collected and washed twice using VM no carbon medium, and then transferred to VM Avicel medium for 48 h. A sample of each culture s

菌株在VM葡萄糖培养基中培养16小时，收集菌丝体并用VM无碳培养基洗涤两次，然后转移至VM Avicel培养基培养48小时。取各培养上清液样品并通过0.45微米滤膜。所有测定至少三次重复，误差以标准误表示。相对于野生型的统计显著性采用双尾Welch's t检验确定，p值标记为p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001。ND = 不可检测。柱状图顶部的数字代表各样品相对于野生型活性或蛋白水平的百分比。

▲ G蛋白单突变体、多突变体及腺苷酸环化酶突变体中各纤维素酶类别的活性。图中显示了内切葡聚糖酶（A）、纤维二糖水解酶（B）和β-葡萄糖苷酶（C）的活性结果。菌株培养及误差分析按图2图注所述方法进行。同时使用Welch's t检验计算各突变体之间的

图3展示了G蛋白单突变体、多重突变体及腺苷酸环化酶突变体中三类特异性纤维素酶活性。A为内切葡聚糖酶，B为纤维二糖水解酶，C为β-葡萄糖苷酶活性结果。

▲ cAMP对G蛋白和腺苷酸环化酶突变体中Avicelase活性及蛋白水平的影响。Avicelase活性和蛋白水平测量方法如图2图注所述，不同之处在于所有培养基均补充至终浓度3 mM cAMP。A代表Avicelase活性，B代表分泌蛋白组浓度，C显示菌体蛋白水平。误差分析如图2图注所述。使用Welch's t检验计算各突变体之间的统计显著性（文件S1）。

图4显示cAMP对G蛋白和腺苷酸环化酶突变体Avicelase活性及蛋白水平的影响。除所有培养基均补充终浓度3 mM cAMP外，Avicelase活性和蛋白水平测定均按图2图注所述进行。A代表Avicelase活性，B代表分泌蛋白组蛋白浓度，C代表生物量蛋白水平。

▲ cAMP对G蛋白和腺苷酸环化酶突变体中三类酶活性的影响。显示了内切葡聚糖酶（A）、纤维二糖水解酶（B）和β-葡萄糖苷酶（C）的活性结果。菌株培养方法如图2图注所述，但所有培养基均调至终浓度3 mM cAMP。误差分析按图2图注所述进行。各突变体之间的统计学显著性使用Welch's t检验（File S1）计算。

图5展示了cAMP对G蛋白和腺苷酸环化酶突变体中三类酶活性的影响。A为内切葡聚糖酶，B为纤维二糖水解酶，C为β-葡萄糖苷酶活性结果。

▲ RGS突变体及表达GTP酶缺陷型Gα基因等位基因菌株中的阿维纤维素酶活性、分泌蛋白组和生物量蛋白水平。菌株培养方法见图2图注。A为阿维纤维素酶活性，B为分泌蛋白浓度，C为生物量蛋白水平。误差分析见图2图注。各突变体间差异显著性采用Welch's t检验计算（文件S1）。

图6展示了RGS突变体及表达GTP酶缺陷型Gα等位基因菌株的Avicelase活性和分泌蛋白组及生物量蛋白水平。A代表Avicelase活性，B代表分泌蛋白组蛋白浓度，C代表生物量蛋白水平。

▲ RGS突变体及表达组成型活性Gα等位基因菌株中特定纤维素酶类的活性。显示了内切葡聚糖酶（A）、纤维二糖水解酶（B）和β-葡萄糖苷酶（C）的活性结果。菌株培养及误差分析按图2图注所述进行。各突变体之间还使用Welch's t检验计算了统计学显著性（文件S1）。

图7展示了RGS突变体及表达组成型活性Gα等位基因菌株中三类特异性纤维素酶活性。A为内切葡聚糖酶，B为纤维二糖水解酶，C为β-葡萄糖苷酶活性结果。

▲ Expression of individual β-glucosidase genes and SDS-PAGE analysis of secretome samples. A Levels of β-glucosidase mRNAs in wild type, Δ gna-1 , Δ gna-3 and Δ cr-1 strains. The average Transcripts Per Million (TPMs) for each of the six expressed β-glucosidase genes (out of seven total) were obtained

图8A显示野生型、Δgna-1、Δgna-3和Δcr-1菌株中六个表达β-葡萄糖苷酶基因的mRNA水平。其中仅NCU08755和NCU04952两个β-葡萄糖苷酶蛋白被预测为分泌型。图8B为缺失G蛋白亚基和腺苷酸环化酶基因菌株的分泌蛋白SDS-PAGE分析。五倍浓缩的分泌蛋白组样品（各20 µl）经10%分离胶SDS-PAGE电泳，凝胶经考马斯亮蓝染色，分子量标记位置标注于凝胶左侧。预测的胞外分泌β-葡萄糖苷酶NCU08755和NCU04952的未修饰大小分别为95.6 kD和77.7 kD。约70 kD处显著条带的位置以箭头标示。

研究结果

本研究测定了所有G蛋白亚基单突变体、RGS单突变体、Gα多重突变体及腺苷酸环化酶突变体Δcr-1从葡萄糖培养基转移至纤维素培养基后分泌蛋白组中的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶活性。

Gα亚基gna-1和gna-3共同为内切葡聚糖酶活性所必需。cr-1是纤维二糖水解酶活性所必需的，而gna-2与gna-3协同调控纤维二糖水解酶活性。多个G蛋白基因在一定程度上影响β-葡萄糖苷酶活性，但没有任何一个基因是该酶活性所必需的。

对G蛋白突变体进行cAMP补充后，内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶活性获得最大程度提升，表明cAMP水平在这两类酶活性调控中发挥重要作用。

在RGS突变体中，Δrgs-2菌株的三类纤维素酶活性均大幅降低，与表达组成型活性gna-3Q208L等位基因的菌株表现相似。相比之下，Δrgs-1突变体和gna-1Q204L菌株的内切葡聚糖酶活性显著高于野生型。

讨论与解读

综合来看，本研究结果表明G蛋白信号组分对粗糙脉孢菌三类主要纤维素酶类活性具有差异化影响。Gα亚基GNA-1与GNA-3共同驱动内切葡聚糖酶活性，CR-1对纤维二糖水解酶活性不可或缺，而β-葡萄糖苷酶活性则受多个G蛋白基因的多重影响但无单基因依赖性。cAMP回补实验揭示cAMP水平对特定纤维素酶类活性的重要性。RGS-2作为GNA-3上游的强负调控因子，其缺失导致三类酶活性全面下降；而RGS-1和GNA-1的组成型激活突变反而提升内切葡聚糖酶活性。

▲ A model for regulation of three cellulase classes by G protein signaling components. The seven RGS proteins are represented in white, the three Gα proteins are shown in blue, the Gβ proteins are colored in turquoise (GNB-1 and CPC-2), the Gγ subunit is represented in gray (GNG-1), and the adenylyl c

图9提出了G蛋白信号组分调控三类纤维素酶活性的模型。七个RGS蛋白以白色表示，三个Gα蛋白以蓝色表示，Gβ蛋白以青色表示（GNB-1和CPC-2），Gγ亚基以灰色表示（GNG-1），腺苷酸环化酶（CR-1）以黄色表示。细实线箭头表示单突变体中部分活性丧失，粗实线箭头表示单突变体中严重或完全活性丧失，虚线箭头表示仅当该基因与其他Gα基因联合突变时才观察到效应。A为内切葡聚糖酶活性调控模型，B为纤维二糖水解酶活性调控模型，C为β-葡萄糖苷酶活性调控模型。

编译者解读

本研究采用"基因敲除+分泌蛋白组酶活测定"的系统策略，逐一拆解G蛋白信号网络各节点对三类纤维素酶的差异化贡献，避免了单一基因研究的碎片化局限。cAMP回补实验设计尤为巧妙——通过外源添加绕过信号通路上游，直接锁定cAMP水平为关键调控节点。从合成生物学应用看，RGS-1和GNA-1组成型激活突变显著提升内切葡聚糖酶活性这一发现，为工程改造丝状真菌分泌系统提供了直接靶点。但研究局限于单一模式菌株的实验室培养条件，距离工业纤维素酶生产场景仍有距离。

参考来源

Oza Y, Borkovich KA. G-protein signaling components differentially regulate the activity of multiple cellulase enzyme classes in Neurospora crassa. Biotechnol Biofuels Bioprod. PMID: 42249379.

PMID: 42249379

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