来源：Bioresour Bioprocess | 编译：DNA Lab Space
导读
3'-唾液酸乳糖（3'-SL）是最简单的唾液酸化人乳低聚糖，在婴儿配方奶粉中应用广泛。本研究通过碳代谢流重定向、CTP再生强化、关键酶表达平衡优化及CRISPR辅助多拷贝染色体整合，构建了无质粒、无抗生素标记的高产菌株，摇瓶产量达7.75 g/L，5-L发酵罐补料分批产量达102.18 g/L，为目前报道的最高水平。
研究背景
人乳低聚糖（HMOs）是人乳中仅次于乳糖和脂质的第三大固体组分，约占总碳水化合物的20%。已鉴定出超过200种结构不同的HMOs，其中唾液酸化HMOs约占13%，以3'-SL和6'-SL最为丰富。3'-SL由乳糖与Neu5Ac通过α-2,3糖苷键连接而成，具有抑制病原体黏附、降低坏死性小肠结肠炎风险、调节免疫及支持神经发育等功效。牛乳和山羊乳虽含低聚糖，但浓度（<1%）和结构与人乳HMOs差异显著，无法作为替代来源。化学合成复杂且昂贵，微生物发酵成为最具前景的生产途径。近年来，工程化大肠杆菌生产3'-SL的研究取得显著进展，但产量和稳定性仍有提升空间。
研究方法
菌株、质粒与基因
本研究所用菌株列于表1，质粒汇总于支持信息表S1。大肠杆菌DH5α用于克隆和质粒构建，SLEB01作为3'-SL生产宿主菌株。质粒pCDFDuet-1和pET28a用于异源蛋白表达；pCas和pTargetF用于基因敲入；pTU1-A~D-RFP和pTU2-A-RFP用于表达模块组装；pTet-tns、pTetQCas-IS1、pRE57和pCutamp用于多拷贝基因整合。
表1 本研究所用菌株
| 菌株 | 特征 | 来源 |
|------|------|------|
| BL21(DE3) | F− ompT hsdSB(rB−mB−) gal dcm rnel31λ(DE3) | Invitrogen |
| SLIS026 | BL21(DE3)::ΔlacZ, ΔnanA, ΔnanKE | 实验室保存 |
| SLEB01 | BL21(DE3)::ΔLacZ ΔnanA ΔnanKE ΔnagABE | 实验室保存 |
| SLEB02 | BL21(DE3)::ΔLacZ ΔnanA ΔnanKE ΔnagABE ΔpfkA | 本研究 |
| SLEB03 | BL21(DE3)::ΔLacZ ΔnanA ΔnanKE ΔnagABE ΔmelB::LacY | 本研究 |
| SLEB04 | BL21(DE3)::ΔLacZ ΔnanA ΔnanKE ΔnagABE ΔpfkA::LacY | 本研究 |
| SLEB05 | BL21(DE3)::ΔLacZ ΔnanA ΔnanKE ΔnagABE ΔpfkA::LacY ΔaslA::fbaA-fbp | 本研究 |
| SLEB06 | BL21(DE3)::ΔLacZ ΔnanA ΔnanKE ΔnagABE ΔpfkA::LacY ΔaslA::fbaA-fbp ΔgltB::glmS-glnA | 本研究 |
| SLEB07 | BL21(DE3)::ΔLacZ ΔnanA ΔnanKE ΔnagABE ΔpfkA::LacY ΔaslA::fbaA-fbp ΔgltB::glmM | 本研究 |
| SLEB08 | BL21(DE3)::ΔLacZ ΔnanA ΔnanKE ΔnagABE ΔpfkA::LacY ΔaslA::fbaA-fbp ΔgltB::glmU | 本研究 |
| SLEB09 | BL21(DE3)::ΔLacZ ΔnanA ΔnanKE ΔnagABE ΔpfkA::LacY ΔaslA::fbaA-fbp ΔgltB::glmS-glnA ΔmelB::CMK-PPK | 本研究 |
| SLEB10 | BL21(DE3)::ΔLacZ ΔnanA ΔnanKE ΔnagABE ΔpfkA::LacY ΔaslA::fbaA-fbp ΔgltB::glmS-glnA ΔmelB::NDK-PPK | 本研究 |
| S01 | SLEB01携带质粒pSL01和pET28a-NmST | 本研究 |
| S02 | SLEB01携带质粒pSL01和pET28a-PsST | 本研究 |
| S03 | SLEB01携带质粒pSL01和pET28a-PmST1 | 本研究 |
| S04 | SLEB01携带质粒pSL01和pET28a-PmST2 | 本研究 |
| S05 | SLEB01携带质粒pSL01和pET28a-BtST | 本研究 |
| S06 | SLEB01携带质粒pSL01和pET28a-VsST | 本研究 |
| S07 | SLEB01携带质粒pSL01和pET28a-NgST | 本研究 |
| S08 | SLEB01携带质粒pSL01和pET28a-PpST | 本研究 |
| S09 | SLEB02携带质粒pSL01和pET28a-BtST | 本研究 |
| S10 | SLEB03携带质粒pSL01和pET28a-BtST | 本研究 |
| S11 | SLEB04携带质粒pSL01和pET28a-BtST | 本研究 |
| S12 | SLEB05携带质粒pSL01和pET28a-BtST | 本研究 |
| S13 | SLEB06携带质粒pSL01和pET28a-BtST | 本研究 |
| S14 | SLEB07携带质粒pSL01和pET28a-BtST | 本研究 |
| S15 | SLEB08携带质粒pSL01和pET28a-BtST | 本研究 |
| S16 | SLEB09携带质粒pSL01和pET28a-BtST | 本研究 |
| S17 | SLEB10携带质粒pSL01和pET28a-BtST | 本研究 |
| S18 | SLEB09携带质粒pSL20 | 本研究 |
| S19 | SLEB09插入IS1::neuA-neuB-neuC-BtST基因盒，含工具质粒 | 本研究 |
| S20 | SLEB09插入IS1::neuA-neuB-neuC-BtST基因盒，不含工具质粒 | 本研究 |
除非另有说明，质粒均使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix通过Gibson组装构建。密码子优化的基因包括：来自空肠弯曲杆菌的UDP-N-乙酰葡糖胺差向异构酶neuC（WP_002874240.1）和N-乙酰神经氨酸合酶neuB（WP_002874241.1）、来自脑膜炎奈瑟菌的CMP-Neu5Ac合酶neuA（WP_002215295.1）、来自海藻伯杰菌的BtST（AGH37861.1），以及其他用于筛选的ST变体，均由北京擎科生物科技有限公司合成。
试剂、培养基与培养条件
3'-SL标准品（纯度≥95%）购自Carbosynth（英国伯克郡）。乳糖、IPTG、抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素、安普霉素、氯霉素、壮观霉素、四环素）及其他分析级试剂均购自上海生工生物工程股份有限公司。
除非另有说明，以下所有浓度均指终浓度。3'-SL生产工程菌株先在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中于37°C、250 rpm培养4-5小时。种子培养液（2.5-5% v/v）接种至500 mL摇瓶中的100 mL TB培养基（10 g/L胰蛋白胨、18 g/L酵母提取物、2.31 g/L KH2PO4、16.43 g/L K2HPO4、4 mL/L甘油），在相同条件下培养至OD600达到1.0-1.2。随后加入0.1 mM IPTG、2 g/L MgSO4·7H2O、0.1 mL微量元素溶液（54.4 g/L (NH4)2Fe(C6H5O7)2、9.8 g/L MnCl2·4H2O、1.6 g/L CoCl2·6H2O、1 g/L CuCl2·2H2O、1.9 g/L H2BO2、9 g/L ZnSO4·7H2O、1.1 g/L Na2MoO4·2H2O、1.5 g/L Na2SeO2、1.5 g/L NiSO4·6H2O），同时加入10 g/L葡萄糖和5 g/L乳糖启动发酵，随后在30°C、250 rpm条件下培养。每12小时补加葡萄糖（10 g/L），发酵48小时终止。对于携带质粒的菌株，抗生素添加浓度如下：氨苄青霉素100 µg/mL、卡那霉素50 µg/mL、链霉素50 µg/mL、安普霉素50 µg/mL、氯霉素25 µg/mL、四环素100-1000 ng/mL。
基因编辑
使用由pCas9质粒（表达Cas9核酸酶）和pTargetF质粒（携带含靶标特异性N20序列的sgRNA）组成的CRISPR-Cas9系统进行大肠杆菌BL21(DE3)染色体基因敲除。sgRNA使用CRISPOR在线工具（https://crispor.gi.ucsc.edu/）设计。基因编辑操作按先前描述的方法进行（Li et al. 2021a）。质粒信息见支持信息表S1，引物列于支持信息表S2。
3'-SL合成关键酶表达平衡
为优化neuA、neuB、neuC和ST的表达兼容性，使用Minitab软件进行实验设计和方差分析。按照Golden Gate组装策略，每个基因分别与其启动子、RBS和终止子组装到pTU1-A~D-RFP载体中，生成Level 1单基因转录单元。根据实验设计要求，将Level 1单元依次组装到pTU2-A-RFP中，获得Level 2多顺反子模块。组装程序参照相关文献（Moore et al. 2016; Stukenberg et al. 2021）。质粒详情见支持信息表S1，引物序列见支持信息表S2，启动子信息见支持信息表S3。
3'-SL合成模块的多拷贝整合
使用CRISPR辅助转座酶系统进行多拷贝染色体整合。设计靶向多拷贝基因组位点的crRNA。该系统需要四个质粒：pDOE13，携带neuB-neuC-neuA-BtST表达盒的供体质粒（通过Gibson组装构建）；pTet-tns，表达转座酶蛋白TnsA、TnsB和TnsC；pTetQCas-IS1，携带IS1插入位点、靶位点32-nt间隔序列以及辅助蛋白TniQ、Cas8、Cas7和Cas6；pCutamp，编码在整合后去除其他三个质粒的sgRNA。多拷贝整合操作参照相关程序（Zhang et al. 2020, 2021; Yang et al. 2021）。质粒和引物分别列于支持信息表S1和支持信息表S2。
每轮转座循环后，在摇瓶中筛选菌落。高产量菌株随后去除辅助质粒并重新评估。为提高质粒去除效率，在含50 µg/mL安普霉素和10 mM鼠李糖的LB培养基中的诱导时间从3小时延长至10小时。
5-L生物反应器补料分批发酵
补料分批发酵在5 L生物反应器中进行，工作体积2 L。发酵培养基组成：24 g/L蛋白胨、12 g/L酵母提取物、2.0 g/L NH4Cl、0.24 g/L MgSO4、6.8 g/L KH2PO4、5 mg/L FeCl2、10 mg/L MnCl2·4H2O和5 mg/L CaCl2。种子培养通过将1%（v/v）预培养物接种到50 mL LB培养基中，于37°C过夜培养。将摇瓶培养物转移至生物反应器，在37°C下培养至OD600达到20。随后加入IPTG（0.1 mM）和乳糖（10 g/L），温度降至25°C启动3'-SL生产。通过调节搅拌速度（100-1000 rpm）维持溶解氧（DO）在15-25%。
研究结果
α-2,3-唾液酸转移酶（ST）的筛选
在前期工作中，研究者对大肠杆菌BL21(DE3)进行了广泛工程改造以增强Neu5Ac生物合成途径，获得菌株SLIS026（敲除ΔlacZ、ΔnanA、ΔnanKE）。随后，为进一步增强Neu5Ac生物合成，敲除了编码N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶（NagA）、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱氨酶（NagB）和N-乙酰葡糖胺特异性磷酸转移酶系统组分（NagE）的基因，获得菌株SLEB01（ΔlacZ、ΔnanA、ΔnanKE、ΔnagABE）。在SLEB01中异源表达neuBC，摇瓶发酵44小时后Neu5Ac产量达5.5 g/L。该菌株随后用作3'-SL途径构建和进一步代谢工程改造的亲本底盘。由于大肠杆菌BL21(DE3)缺乏天然的3'-SL生物合成途径，需要异源表达neuABC以及功能性ST来建立从头3'-SL合成。虽然neuABC模块已被广泛研究且通常不认为是主要限速步骤，但ST酶通过催化CMP-Neu5Ac与乳糖之间α-2,3糖苷键的形成，关键决定3'-SL生产效率。因此，ST活性和特异性仍是提高3'-SL产量的关键瓶颈。
为鉴定最佳ST候选酶，以来自脑膜炎奈瑟菌的NmST（AAC44541.1）为参考，在NCBI数据库中搜索同源物。选择了来自不同系统发育物种的7个ST同源物进行比较：PsST（Photobacterium sp. JT-ISH-224, BAF92025.1）、PmST1（Pasteurella multocida, WP_115173531.1）、PmST2（Pasteurella multocida, AAK02272.1）、BtST（Bibersteinia trehalosi, AGH37861.1）、VsST（Vibrio sp. JT-FAJ-16, BAF91160.1）、NgST（Neisseria gonorrhoeae, AAC44539.1）和PpST（Photobacterium phosphoreum, BAF63530.1）。为评估其性能，将四个必需基因分为两个表达模块：neuABC操纵子置于质粒pCDFDuet-1（pSL01）上，各ST候选基因分别从质粒pET28a（p28a-ST）单独表达。将相应质粒共转化至SLEB01，产生8株重组菌株（S01-S08）用于从头3'-SL生产。
摇瓶发酵显示各ST变体在3'-SL产量上存在明显差异。48小时摇瓶发酵后，表达BtST的菌株（S05）获得最高3'-SL产量（1.78 g/L），其次为NmST菌株（S01），产量1.45 g/L。序列比对显示BtST与NmST之间的氨基酸序列一致性仅为14.87%，尽管两者性能相当。相比之下，PmST2（S04）产量最低（0.57 g/L），而其同源物PmST1（S03）产量为1.22 g/L。这些结果表明，ST的进化起源和序列差异均显著影响其体内性能，最终影响3'-SL产量。
已有研究报道NmST和PmST具有强催化活性，是构建高产3'-SL菌株最常用的ST。而BtST的探索相对较少。Li等人报道在菌株构建过程中BtST活性低于PmST，这与本研究系统中观察到的优异性能形成对比。这一差异可能源于密码子优化策略、表达水平或neuABC与ST之间化学计量平衡的不同，这些因素均可能在不同宿主背景下显著影响酶性能。值得注意的是，Talafová等人报道BtST对乳糖的亲和力比多杀性巴氏杆菌ST高4倍，pH耐受范围更宽（6-10），唾液酸酶活性更低，这些特性可能有利于高效3'-SL合成。综合这些报道优势及其在本研究筛选中的优异表现，选择BtST作为后续菌株工程改造的首选ST候选酶。
通过物质和能量平衡系统优化3'-SL代谢网络
开发能够高水平生产3'-SL的微生物底盘需要系统优化代谢网络，以维持细胞生长与产物形成之间的有效平衡。果糖-6-磷酸（F-6-P）是关键代谢中间体，通过6-磷酸果糖激酶（pfkA）转化为果糖-1,6-二磷酸（F-1,6-P）。该步骤是影响碳通量在EMP途径与3'-SL生物合成途径之间分配的主要调控节点。已有研究表明，pfkA缺失可减少EMP途径的碳通量，导致F-6-P积累，从而增加目标分子（如2'-FL和3'-SL）的前体可用性。遵循这一策略，使用CRISPR-Cas9在菌株S05中敲除pfkA，获得菌株S09。与亲本菌株S05相比，pfkA缺失使生物量降低（OD下降8.5%），但3'-SL产量显著提高58.4%。发酵48小时后，菌株S09的3'-SL产量达到2.82 g/L，表明碳利用向目标生物合成途径增强，底物转化效率显著提升。
3'-SL的合成既需要葡萄糖代谢产生Neu5Ac前体，也需要高效转运外源乳糖（糖基受体）。因此，乳糖摄取是影响3'-SL产量的另一个关键因素。为提高胞内乳糖水平，在菌株S05中于四环素启动子Ptet下过表达内源乳糖透性酶基因lacY，构建菌株S10。在补充5 g/L乳糖的摇瓶发酵48小时后，菌株S10产生3.2 g/L 3'-SL，较S05提高79.8%。同时观察到生长略有下降（OD600降低7.3%），这可能归因于lacY过表达相关的膜应激。鉴于pfkA缺失和lacY过表达对3'-SL产量的有益效果，将这两种修饰组合构建菌株S11。菌株S11的3'-SL产量达3.64 g/L，较S10和S09分别提高13.8%和29.1%。菌株S05-S11依次构建，每株菌均由前一菌株引入单一工程修饰获得。其中S11的3'-SL产量最高，因此选择其进行后续代谢工程改造。
考虑到F-6-P是进入氨基糖生物合成途径（通向Neu5Ac形成）的入口代谢物，增加其胞内可用性有望增强3'-SL生物合成的前体供应。因此，在菌株S11中过表达编码果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（fbaA）和果糖-1,6-二磷酸酶（fbp）的基因。所得菌株S12产生4.11 g/L 3'-SL，较S11提高12.9%，且未显著影响细胞生长。这些结果表明，增加胞内F-6-P库有效增强了3'-SL生物合成的碳通量。
在Neu5Ac生产菌株的代谢工程中，由葡糖胺-6-磷酸合酶（GlmS）催化的F-6-P转化是限速步骤，且该酶受……
5-L生物反应器中菌株S20和S18的生产性能
讨论与解读
本研究通过整合代谢工程、途径表达优化和CRISPR辅助多拷贝染色体整合，开发了用于从头3'-SL生产的高性能微生物细胞工厂。该策略产生了无质粒、无抗生素标记的菌株S20，具有增强的遗传稳定性，适用于高密度发酵。与已报道的微生物从头3'-SL生产系统相比，菌株S20表现出优异的发酵性能。与基于质粒的菌株S18相比，S20在延长发酵过程中表现出更持续的生产能力，凸显了多拷贝染色体整合在构建稳健生产菌株方面的优势。
编译者解读
本研究的技术路线具有清晰的工程逻辑：从ST酶筛选入手确定关键催化元件，继而通过模块化代谢重排（pfkA缺失、lacY过表达、fbaA-fbp过表达、glmS-glnA整合、CMK-PPK整合）逐级提升前体供应，最后以CRISPR辅助转座酶系统实现多拷贝染色体整合，彻底摆脱质粒和抗生素依赖。102.18 g/L的产量不仅刷新了3'-SL微生物合成的纪录，更验证了"质粒表达→染色体整合"这一工业化路径的可行性。值得注意的是，BtST这一此前较少被关注的ST变体在筛选中表现突出，提示酶筛选的起点不应局限于文献热门候选。本研究的局限在于未详述5-L发酵的最终OD600和乳糖转化率等关键参数，且染色体整合拷贝数的均一性对菌株稳定性的长期影响仍需进一步考察。该策略对其它复杂HMOs的微生物合成具有直接借鉴价值。
参考来源
Wu Y, Min T, Ma Z, Wang S, Sun C. Systematic pathway engineering of Escherichia coli for enhanced 3'-sialyllactose production. Bioresour Bioprocess. PMID: 42573917. DOI: 10.1186/s40643-026-01110-8.
PMID: 42573917