来源：Infect Immun | 编译：DNA Lab Space
布鲁氏菌是一种广泛传播的胞内动物病原体，所致布鲁氏菌病是重要的人畜共患病。然而，宿主哪些基因支持布鲁氏菌感染，此前并不清楚。一项最新研究用流式细胞术结合全基因组CRISPR-Cas9功能缺失筛选，在人类巨噬细胞样细胞中系统鉴定了超过150个影响布鲁氏菌早期感染的宿主基因，并发现AKT-Ragulator-mTORC1信号轴在建立胞内适宜微环境中发挥关键作用。
研究背景
布鲁氏菌属细菌感染全球范围内每年造成大量动物和人类健康问题。这类病原体能够在巨噬细胞等吞噬细胞内存活并复制，其致病机制高度依赖宿主细胞内的多种因子。尽管已知一些宿主蛋白参与布鲁氏菌的入侵和胞内运输，但宿主基因层面的完整图景仍然缺失。传统研究通常针对单一候选基因，难以揭示感染过程的全局调控网络。CRISPR筛选技术为系统性鉴定宿主因子提供了有力工具，但在布鲁氏菌研究领域，此前尚未有全基因组规模的筛选报道。该研究正是针对这一空白，开发了基于流式细胞术的高通量感染检测方法，并将其与全基因组CRISPR-Cas9筛选相结合，在人类巨噬细胞样细胞中寻找那些被布鲁氏菌"劫持"的宿主基因。
研究方法
研究人员首先构建了高荧光强度的布鲁氏菌报告菌株。他们选择将编码mNeonGreen荧光蛋白的基因整合到布鲁氏菌染色体的glmS位点，从而获得稳定表达强荧光信号的细菌。考虑到绵羊种布鲁氏菌（B. ovis）主要感染绵羊，对人无 zoonotic 风险，研究人员先用它来验证感染体系。在无细胞培养条件下，表达mNeonGreen的B. ovis展现出与野生型一致的生长动力学曲线，且在THP-1细胞内部可通过荧光显微镜清晰观察到细菌。
感染实验采用THP-1人类单核细胞系，经诱导分化为巨噬细胞样细胞。研究人员系统测试了感染复数（MOI）和时间点对感染效率的影响。在感染复数1,000、感染时间3小时的条件下，流式细胞术能够清晰、可重复地区分感染和未感染的宿主细胞群体。而2小时的较短感染时间产生的感染细胞比例不足，无法满足基于流式细胞术的遗传筛选需求。更重要的是，在MOI 1,000、感染3小时的条件下，B. ovis感染对THP-1宿主细胞活力没有影响。用相同条件感染表达mNeonGreen的流产布鲁氏菌（B. abortus），流式细胞术检测显示50%的THP-1细胞被感染。这一感染比例足以支持后续全基因组筛选。
在确定感染条件后，研究人员进行了全基因组CRISPR-Cas9功能缺失筛选。在人类巨噬细胞样细胞中，用覆盖全基因组的CRISPR文库进行敲除，然后用荧光B. abortus感染，通过流式细胞术分选那些胞内细菌信号显著降低的细胞。这些细胞中被打断的宿主基因，即为可能支持布鲁氏菌感染的候选因子。筛选在感染后3小时进行检测，聚焦于细菌感染的早期阶段。
对于筛选得到的候选基因，研究人员在特定功能类别内进行了验证实验。他们重点关注了小GTP酶RAB14、Src家族激酶调节因子CSK以及磷脂翻转酶亚基TMEM30A这三个基因，分别用遗传学手段破坏这些基因后，检测B. abortus和B. ovis感染效率的变化。此外，通过基因集富集分析（GSEA）识别出mTORC1信号通路的正调控因子作为候选宿主因子后，研究人员用遗传学方法敲除了LAMTOR2和AKT1，并用AKT1的药理学抑制剂处理细胞，验证该通路在感染中的作用。
为了检验这些宿主需求是否具有病原体特异性，研究人员还采用了无关的胞内病原体——脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）进行平行感染实验。通过比较CSK、AKT1、LAMTOR2和RAB14在这两种病原体感染中的需求差异，区分了共享型和病原体特异的宿主依赖因子。
原文摘要未详述的具体参数包括：CRISPR文库的具体类型和覆盖度、筛选的具体细胞数量、转染方式、感染后培养条件、AKT1抑制剂的名称和浓度、LAMTOR2和AKT1的敲除方式（siRNA、shRNA或CRISPR）、以及脓肿分枝杆菌感染的具体MOI和时间点。
研究结果
筛选结果显示，超过150个宿主基因的破坏能够显著降低感染后3小时胞内B. abortus的荧光信号。这些基因中既包含已知的宿主因子，也发现了此前未被重视的与内体运输、细胞骨架重塑和脂质稳态相关的基因。
在功能类别验证中，RAB14、CSK和TMEM30A三个基因均被证实支持B. abortus和B. ovis的感染过程，且作用于细菌进入细胞后的步骤。这意味着这些宿主因子并非参与细菌的初始入侵，而是在细菌进入细胞后、建立胞内复制生态位的过程中发挥作用。
基因集富集分析将mTORC1信号通路的正调控因子鉴定为宿主依赖因子。这一发现通过三重验证得到确认：遗传学破坏LAMTOR2、遗传学破坏AKT1、以及药理学抑制AKT1，均导致布鲁氏菌感染效率下降。LAMTOR2是Ragulator复合物的组成部分，负责将mTORC1招募到溶酶体表面；AKT1则是PI3K-AKT信号通路的核心激酶。这些结果表明，AKT-Ragulator-mTORC1信号轴在布鲁氏菌建立胞内适宜微环境的过程中发挥关键作用。
病原体特异性分析提供了更为精细的图景。在脓肿分枝杆菌感染中，CSK、AKT1和LAMTOR2同样是高效感染所必需的，但RAB14并非必需。这一结果将宿主因子分为两类：一类是多种胞内细菌共用的"通用型"依赖因子（CSK、AKT1、LAMTOR2），另一类是布鲁氏菌特有的依赖因子（RAB14）。
原文摘要未提供以下具体数据：各基因敲除后感染效率下降的具体百分比、AKT1药理学抑制的剂量-效应关系、MOI 100与MOI 1,000条件下感染率的精确数值对比、以及脓肿分枝杆菌感染中各个基因缺失后的感染效率量化数据。
讨论与展望
这项工作的价值在于把布鲁氏菌感染的宿主因子研究从"零敲碎打"推进到"全基因组"尺度。超过150个候选基因的鉴定规模，本身就说明布鲁氏菌与宿主细胞的互动远比想象中复杂。AKT-Ragulator-mTORC1轴的发现尤其值得关注——mTORC1是细胞代谢和自噬的核心调控节点，布鲁氏菌劫持这一通路，可能与其逃避宿主细胞清除、重塑胞内营养环境有关。RAB14在布鲁氏菌感染中必需、在脓肿分枝杆菌感染中非必需，这一差异为开发针对布鲁氏菌的特异性干预策略提供了潜在靶点。后续研究可以围绕这些候选基因在体内感染模型中的功能验证展开，并深入探究AKT-Ragulator-mTORC1轴被激活的具体分子机制。
参考来源
Kim T, Scheeres EC, Fiebig A, Olive AJ, Crosson S. A genome-wide CRISPR screen defines host determinants of early Brucella infection in human macrophage-like cells. Infect Immun. PMID: 42402044.
PMID: 42402044